拟南芥NAC103基因在调节种子萌发中的应用的制作方法

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种拟南芥nac103基因在调节种子萌发中的应用。

背景技术

种子的萌发是农作物生长发育的关键时期，种子发芽时期和发芽质量好坏直接影响了农作物的生长和经济效益，促进种子萌发有利于提高农作物的产量，而抑制种子萌发同样具有重要的实用价值和研究意义，尤其是水稻等农作物在收获前遭遇高温多湿天气，种子容易在穗上萌发，造成农作物产量下降、影响农作物品质和经济效益。因此，如何防止农作物种子在穗上萌发已成为农业生产中亟需解决的问题。

种子萌发是从种子吸水吸胀开始，经历了一系列复杂而有序的生理过程和形态发生过程，受到内源因子和外部环境因子的共同调控。调控种子萌发的主要激素是赤霉素（gibberellin,ga）和脱落酸（abscisicacid，aba），赤霉素有利于打破种子休眠，促进种子发芽，而脱落酸抑制种子发芽，有利于植物抵御外界不良环境条件对种子的影响。

脱落酸（c15h20o4）是由异戊二烯为单位组成的一种倍半萜烯物质，呈弱酸性，不仅广泛参与了种子休眠、种子发芽、幼苗生长以及开花等植物生长发育过程，还在植物抗干旱、高盐、低温等非生物胁迫应答和病虫害侵害等生物胁迫应答中发挥了重要作用。研究脱落酸调节的种子萌发过程中的基因调控机制，有利于更合理地提高植物抵御外界不良环境胁迫，为植物抗逆境新品种的选育提供新的途径和思路。

技术实现要素：

本发明的目的是研究在脱落酸调节的种子萌发过程中的基因调控机制，通过对基因功能的研究，提供一种拟南芥nac103基因在调节种子萌发中的应用，可为植物新品种培育奠定一定的理论和应用基础。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：

拟南芥nac103基因在促进或抑制种子萌发过中的应用。

拟南芥nac103基因在外源脱落酸调节的种子萌发过程的应用，外源脱落酸存在时nac103基因缺失促进种子萌发，外源脱落酸存在时nac103基因过量表达抑制种子萌发。

一琐琐碎种拟南芥nac103基因的突变体，所述的基因突变体为在拟南芥nac103基因编码区的第115位后插入一个碱基t或者碱基a。

所述的拟南芥nac103基因的基因突变体的碱基序列如seq.id.no.1或seq.id.no.2所述。

所述的拟南芥nac103基因的突变体在促进种子萌发中的应用。

本发明所述的拟南芥nac103基因在genbank中的编号为nm125802，在拟南芥tair（https://www.arabidopsis.org/）数据库中的的编号是at5g64060，该基因的cds长1068bp，编码356个氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列如seq.id.no.3所示。本发明通过基因工程技术手段筛选到nac103突变体植株nac103-d1、nac103-e4，nac103过量表达转基因植株nac103-oe1、nac103-oe3；与野生型拟南芥wt相比，各植株在正常ms培养基中表现出大致相同的萌发趋势，在萌发生长48h后，野生型拟南芥、nac103突变体植株和过量表达转基因植株种子的萌发率均达到90%以上；当ms培养基中添加不同浓度的外源脱落酸时，nac103突变体的发芽率高于野生型拟南芥，且随着脱落酸浓度逐渐提高，差异越显著；而nac103过量表达材料的发芽率低于野生型拟南芥，且随着脱落酸浓度逐渐提高，差异越显著，本发明表明nac103基因的表达量影响了脱落酸调节下的种子萌发。

本发明还提供了一种拟南芥nac103基因的基因突变体，所述的基因突变体为在nac103基因编码区的第115位后插入一个碱基t或者碱基a，获得的突变体植株的纯合突变体分别命名为nac103-d1和nac103-e4。所述的拟南芥nac103基因的基因突变体nac103-d1的碱基序列如seq.id.no.1所述，5’…gatgccattgtctgaggtcgacatt

tac…3’；nac103-e4的碱基序列如seq.id.no.2所述，5’…gatgcca

ttgactgaggtcgacatttac…3’。

所述的拟南芥nac103基因的基因突变体在促进种子萌发中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明基于基因工程技术手段获得具有较多nac103蛋白的nac103过量表达转基因植株和无nac103蛋白的nac103突变体植株，并以正常表达nac103蛋白的野生型拟南芥植株为对照，从较多nac103蛋白、无nac103蛋白和正常表达nac103蛋白三个nac103表达层面，有效分析了拟南芥的nac103基因在促进或抑制种子萌发中的应用，特别是在脱落酸调节下的nac103基因表达在种子萌发过程中的生物学功能，为研究nac103基因在种子萌发过程中的功能提供了重要的植物材料。

基于本发明所述的nac103基因在种子萌发过程中的生物学功能，本发明提供了拟南芥nac103基因的基因突变体在在促进种子萌发中的应用，所述突变体应用在转基因植物中，有利于植物抵御外界不良环境条件对种子的影响，从而获得植物抗性增强的植物新品种，在种质资源保存和农作物生产中有很好的应用前景。

附图说明

图1为拟南芥nac103突变体nac103-d1、nac103-e4突变体中扩增的部分nac103基因片段；

图2为生物统计分析wt、nac103-d1和nac103-e4在含有脱落酸浓度分别为0μm，0.5μm，1.0μm，1.5μm，3.0μm的1/2ms培养基中的发芽率；

图3为生物统计分析wt、nac103-oe1和nac103-oe3在含有脱落酸浓度分别为0μm，0.5μm，1.0μm，1.5μm，3.0μm的1/2ms培养基中的发芽率。

具体实施方式

下面结合附图，进一步阐释本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围；实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

atu6-26-sgrna-sk质粒载体、pcambia1300-pyao:cas9质粒由中国科学院遗传发育所谢旗教授赠送（参考文献yanl,weis,wuy,hur,lih,yangw,xieq.high-efficiencygenomeeditinginarabidopsisusingyaopromoter-drivencrispr/cas9system.molplant.2015dec7;8(12):1820-3.）。pcambia1300质粒购买自北京天恩泽基因科技有限公司。大肠杆菌dh5α感受态细胞、top10感受态细胞由实验室常规自制。bsai内切酶购自neb公司。t4连接酶、nhei、spei、高保真聚合酶、碱性磷酸酶、dna提取试剂盒均购自takara公司。dna凝胶回收试剂盒、质粒dna小量提取试剂盒均购自axygen生物技术公司。rna提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

实施例1：利用crispr/cas9系统构建nac103突变体的载体构建及nac103纯合突变体的筛选

本发明用于nac103突变体筛选的crispr/cas9系统载体构建具体方法为：

1.突变靶点的选择：根据在线搜索软件（http://crispr.mit.edu/）在nac103的nac结构域内寻找突变靶点，根据软件评分确定了特异性较好的2个突变靶点，突变靶点序列为：突变靶点1如seq.id.no.4所述，ccattgctgaggtcgacatttac；突变靶点2如seq.id.no.5所述，tgtggttactggaagaccacagg。

pcr扩增突变靶点1所用的引物：nac103-f1：如seq.id.no.6所述，5’-attgtaaatgtcgacctcagcaa’-3；nac103-r1：如seq.id.no.7所述，5’-aaacttgctgaggtcgacattta’-3。

pcr扩增突变靶点2所用的引物：nac103-f2：如seq.id.no.8所述，5’-attgtgtggttactggaagaccac’-3；nac103-r2：如seq.id.no.9所述，5’-aaacgtggtcttccagtaaccaca’-3。

2.双元载体的构建与转基因：

（1）单一靶点的sgrnacassette的构建：

利用bsai内切酶在37℃酶切atu6-26-sgrna-sk质粒载体60min，分别与退火（98℃，3min，室温冷却）后的突变靶点1和突变靶点2的产物在t4连接酶作用下与atu6-26-sgrna-sk质粒载体连接（25℃，30min）；将连接产物转化到大肠杆菌dh5α，涂氨苄青霉素抗性的lb平板，挑选单克隆做菌落pcr鉴定，并测序确认将靶点连接到atu6-26-sgrna-sk质粒载体中；所述引物序列如下：

靶点1的pcr引物：sk-grna-f:如seq.id.no.10所述，5’-ctcactatagggcgaattgg-3’；nac103-r1:如seq.id.no.7所述，5’-aaacttgctgaggtcgacattta’-3。

靶点2的pcr引物：sk-grna-f:如seq.id.no.10所述，5’-ctcactatagggcgaattgg-3’；nac103-r2：如seq.id.no.9所述，5’-aaacgtggtcttccagtaaccaca-3’。

分别将以上含有靶点1和靶点2的atu6-26-sgrna-sk质粒载体的菌株扩大培养提取质粒，用nhei和spei双酶切回收的片段即为sgrnacassette。

（2）含有1个靶点的双元载体的构建：

37℃条件下spei酶切pcambia1300-pyao:cas9质粒30min，然后在80℃失活20min，37℃条件下加入0.2μl碱性磷酸酶10min去磷酸化，电泳回收后，与sgrnacassette用t4连接酶连接后转化大肠杆菌dh5α，涂卡那霉素抗性的lb平板，菌落pcr鉴定（750bp）后大量扩增质粒，分别获得含有靶点1和靶点2的双元载体。

所述菌落pcr鉴定引物如下：1300-grna-f:如seq.id.no.11所述，ccagtcacgacgttgtaaaac；1300-grna-r:如seq.id.no.12所述，caatgaatttcccatcgtcgag。

（3）含有2个靶点的双元载体构建：

将步骤（2）中获得的含有靶点1和靶点2的双元载体的单菌落分别扩大培养，提取质粒；含有靶点1的双元载体质粒用spei单酶切作为载体，含有靶点2的双元载体质粒用nhei和spei双酶切回收后作为片段与spei单酶切的含有靶点1的双元载体用t4连接酶连接，转入大肠杆菌dh5α中，挑选单克隆做菌落pcr鉴定；pcr鉴定引物如seq.id.no.11和seq.id.no.12所述：将鉴定正确的含有2个靶点的双元载体质粒转化农杆菌后，大量培养后通过浸花侵染的方式转入拟南芥中。

3.nac103突变体的初筛

转基因种子的消毒：取适量步骤2得到的拟南芥种子分装到1.5ml的离心管中，先加入1ml50%的乙醇漂洗，用移液枪吸取乙醇弃去；加入1ml现配的有效氯浓度为0.15%naclo溶液，震荡消毒约10min后，在超净工作台中弃去naclo溶液，加入1ml无菌蒸馏水清洗3次后，再在离心管中加入约1ml无菌蒸馏水使种子悬浮。

拟南芥转基因种子消毒后，接种到含有潮霉素（25mg/l）的固体1/2ms培养基，在4℃冰箱中春化3天后，置于光照培养箱中培养约7天，挑选绿色幼苗（含潮霉素抗性的转基因植株）移栽到土中，收获转基因t1代植株种子。分别将t1代转基因种子点播到固体1/2ms培养基，光照培养箱中培养7天后，移栽到植物温室中，待植株生长出6片较大叶片后，单株摘取1-2片叶片分别提取植物总dna。利用geno-nac103f和geno-nac103r引物进行pcr扩增nac103基因，吸取部分扩增产物先在琼脂糖凝胶中成像，选取与野生型拟南芥中nac103片段大小一致目的条带，将剩余pcr扩增产物送测序公司（上海杰李生物技术有限公司）测序，测序结果在ncbi（www.ncbi.nlm.nih.gov）网站进行比对，比对结果发现有3株为插入单碱基的突变株，但从测序峰看这些突变体均为杂合突变株。分别收集杂合突变体单株种子。geno-nac103f：如seq.id.no.13所述，gtctgttgatatctgcaaga；geno-nac103r：如seq.id.no.14所述，gaacattcttttgagccagt。

4.nac103突变体的复筛

分别将杂合突变体的种子播种到固体1/2ms培养基上，光照培养箱中生长7天后移苗到植物温室中，植物生长出约6片较大叶片后，单株摘取1-2片分别提取植物总dna。利用geno-nac103f和geno-nac103r引物进行pcr扩增nac103基因，吸取部分扩增产物先在琼脂糖凝胶中成像，若目的条带与野生型拟南芥中nac103片段大小一致，将剩余pcr扩增产物送测序公司测序，测序结果在ncbi（www.ncbi.nlm.nih.gov）网站进行比对，最终筛选到两种插入单碱基的纯合突变体nac103-d1和nac103-e4。分别收集nac103纯合突变体种子，为种子发芽率分析提供重要的植物材料。图1为拟南芥nac103突变体nac103-d1、nac103-d1突变体中扩增的部分nac103基因片段。其中，marker代表dna分子量标准，1代表nac103-d1突变体中扩增的部分nac103基因片段，2代表nac103-d1突变体中扩增的部分nac103基因片段。

实施例2.nac103过量表达植株材料构建

1.nac103-yfp-1300载体构建及转基因

野生型拟南芥种子消毒后，点播到固体1/2培养基上，待拟南芥生长出4片叶子后，选取幼嫩的叶子用dna提取试剂盒提取总基因组dna，选用高保真聚合酶（primestar）和引物（nac103-yfpf和nac103-yfpfr）扩增拟南芥基因组中的nac103基因，扩增出的条带大小与nac103全长基因大小一致后，37℃条件下用spei和asci分别双酶切pcr扩增产物和pcambia1300质粒1小时，回收后用t4连接酶16℃连接5小时以上，转化top10感受态细胞，采用菌落pcr和nac103序列测序方法确保nac103基因无误，提取含有nac103全长的pcambia1300质粒转入到农杆菌中，利用浸花侵染的方式获得过量表达nac103的转基因t0代植株。

nac103-yfpf引物如seq.id.no.15所述：

ttggcgcgccatggggaaaactaacttggcacctg；

nac103-yfpfr引物如seq.id.no.16所述：

ggactagtatcgtccttagtctgaccgttgcttct。

2.转基因的转化与筛选

将收获的转基因t0代植株首先在含有潮霉素（25mg/l）的固体1/2ms培养基培养，在4℃冰箱中春化3天后，置于光照培养箱中培养7天，挑选绿色幼苗（含潮霉素抗性的转基因植株）移栽到土中正常培养，获得转基因t1代植株；与野生型拟南芥相比，转基因t1代植株的叶片有锯齿形、叶片数较多，植株抽薹较晚，分别收取t1代植株的种子。选择野生型拟南芥和基因材料种子消毒后点播在固体1/2ms培养基上，4℃春化2天后放到光照培养箱（22℃，16小时光照/8小时黑暗）中培养8天用rna提取试剂盒提取植株中mrna，采用rt-pcr检测nac103的表达量，与野生型拟南芥相比，发现nac103基因过量表达植株nac103-oe1和nac103-oe3中nac103的表达量显著提高。

实施例3外源脱落酸调节下的nac103对拟南芥种子萌发率的统计分析

1.含不同浓度aba的1/2ms固体培养基的配制

准确称量2.5gms培养基和12.0g蔗糖加入到1000ml蒸馏水中，溶解后调节ph至5.7，分装至5个500ml三角瓶中，每瓶200ml，再在每个三角瓶中加入1.6g的琼脂粉。121℃高压灭菌20min后，放入超净工作台上，待其冷却至35℃后，在5瓶培养基中分别加入0μl，10μl，20μl，30μl，60μl的10mm的脱落酸母液，所述脱落酸母液为10mg脱落酸粉末溶解到3.8ml无水乙醇中，配置成脱落酸浓度分别为0μm，0.5μm，1.0μm，1.5μm，3.0μm的1/2ms培养基，分别倒入无菌培养皿中，每个培养皿倒40ml的1/2ms培养基，每个浓度梯度倒3个培养皿，在每个培养皿上做好相应标记，待其凝固后备用。

2.拟南芥种子的播种与培养

分别将拟南芥野生型植株wt，nac103基因过量表达转基因植株nac103-oe1、nac103-oe3，nac103突变体植株nac103-d1、nac103-e4的种子经过清洗消毒，4℃低温春化处理3天后，在超净工作台中分别使用200μl移液枪吸取适量悬浮于无菌蒸馏水中的拟南芥种子，缓慢将混有种子的蒸馏水打出，依靠重力的作用，将种子逐粒均匀地播种到上述步骤1中所述含有不同浓度脱落酸（0μm，0.5μm，1.0μm，1.5μm和3.0μm）的1/2ms培养基表面上，并用透气胶带封口。每个脱落酸浓度设3个生物学重复，每个平板中每种材料种子数多于30粒。平放于22℃的长日照（16小时光照/8小时黑暗）条件下的光照培养箱中培养。培养期间，不定时观察种子在各种脱落酸浓度下的种子萌发情况。

4.种子萌发率统计

在光照培养箱中培养48、60、72小时，分别对不同脱落酸浓度下的拟南芥野生型植株wt，nac103基因过量表达植株nac103-oe1、nac103-oe3，nac103突变体植株nac103-d1、nac103-e4的每个生物重复性样本进行观察，萌发率如图2、图3所示，图2为突变体植株nac103-d1、nac103-e4的萌发率趋势分析图；图3为基因过量表达植株nac103-oe1、nac103-oe3的萌发率趋势分析图；统计每种材料的种子萌发率，以胚芽完全突破种皮为标准，并计算萌发率，萌发率=萌发数/总数×100%。

表1光照培养48小时各植株发芽率统计

表2光照培养60小时各植株发芽率统计

表3光照培养72小时各植株发芽率统计

结果如表1所示，在不添加外源脱落酸时，在光照培养箱中培养48小时，野生型拟南芥wt、nac103过量表达转基因植株nac103-oe1、nac103-oe3,nac103突变体植株nac10-d1、n3ac103-e4的发芽率均达到90%以上，随着外源脱落酸浓度的增加，发芽率逐渐降低，当添加外源脱落酸浓度为3.0μl时，wt发芽率为4.4%，nac103-d1、nac103-e4的发芽率分别为38.9%和29.6%，nac103-oe1、nac103-oe3发芽率都是0。突变体植株的发芽率明显高于野生型植株，而过量表达转基因植株的萌发相比野生型植株受到抑制。

表2-3进一步表明随着光照培养时间的延长，nac103基因过量表达植株（nac103-oe1、nac103-oe3）的发芽率明显低于野生型拟南芥（wt）；而nac103突变体植株（nac103-d1、nac103-e4）的发芽率却明显高于野生型拟南芥（wt）。外源脱落酸存在时拟南芥nac103基因缺失使拟南芥种子具有更高的萌发趋势，拟南芥nac103过量表达转基因植株使拟南芥种子具有更低的萌发趋势。由此可知，nac103在脱落酸调节的拟南芥种子萌发过程中起到了非常重要的作用。

nac103基因全长基因组序列如seq.id.no.3所述：

1cttctccttcaagctatactctcattctctctcctccgaccaaagttttc51tgttcctccgcttctccttcccctaccggtgcgacttctcctctctttta101tcttctctctttgtttattttaacgccggaaatgtttctcacttgtacgt151tttggtttccgatgtaatctctcgtcttctctgtttcttgaaaatggggt201tttgatttctgggtttgatcttagctccatcaactttgatgcttcccctt251gatcaaaggattaaattctacagtggagattatctatctgcttaccaaat301tttgatcagttacaacaaaattacaaaatcagaattagccctagaatttg351ttttttgttgttacagtcccattcattgaaaagtgtcttcttctatgtgt401aggtgcttcgttttgtgttgtacagcagatgtctgttgatatctgcaaga451agaatccatcgtttctttggtgtgactgtggatatatgagcagaggaagg501ttgtggtgctttcagaccatcatgttttcttcttcttcttagctttttgt551ctctgctagatcttgttattgtgagttttttgctttactggtgagggaag601ttacttagtgtagtgaaagttttccccttgtcttccaatggggaaaacta651acttggcacctggttttcggtttcatccgactgatgttgaacttgtgaga701tactacttgaagaggaaagttatgggaaaaaagttccaagttgatgccat751tgctgaggtcgacatttacaagttcgaacctcctgatttacccggtaact801aactcattctttcagaaatctttgttctgtttcatgctttcttatttatt851tcctgattactaacagaggtttctttacattgtacagacaaatcatgtct901agggactggagatcttaagtggtacttcttctgtccaagagaaaagaagt951atcccaaaggcggtaaggcaaaccgctctactgaatgtggttactggaag1001accacagggagagacagagatgtttcttataatgacgaagtcactgggaa1051gataagaactctgatttatcactacgggaaaatacctcgcggtgatcgga1101ctgattgggtcatacatgaatatagacttgaagacaaagtactggctcaa1151aagaatgttcctcaggtaatgacgattcgttcttgtctttttttaacgtt1201ttgattccttgcaagtttactaaacatgcttgttgtgccctgcaggatac1251ttatgtgctttgcgttctctttaagaaaaatggacttggaccaagacatg1301gatctcaatatggtgctccatttaaggaagaggattggagtgataaggaa1351gaagaatatactcagaatcatcttgtagctggtcctagtaaagaaaccag1401tctagctgctaaggcctcacactcgtacgctcctaaggatggtttgacag1451gagtgatctcagaatcttgcgtctctgatgtgccgccactaactgccaca1501gtgcttccacctctaacaagtgatgttatagcttacaatcccttttcttc1551ttcacctcttcttgaggttcctcaagtatctctcgatggtggcgagttaa1601attcgatgcttgatctcttttctgttgacaatgacgactgtttacttttc1651gacgatttcgactaccataatgaggtaagtctgtctctgcatcatcatgc1701ttttgatgaatcagatttcagtgttcctgaaaagaaacttgttttgattg1751cttctgaaactacaggtaagacatcctgatggttttgtaaacaaggaagc1801tccggtgttcttaggagatggcaatttcagtggaatgtttgacctgagca1851atgaccaagtcgtagagctacaggatctgatacagtcacccactcctcat1901cctccttctcctccagctcaagctagtattcctgatgactcaagaagcaa1951cggtcagactaaggacgattaagtattttgtgctgacttatgctctttct2001tgctttggtctgatgctccatggaaacagagaccaaacatgtgaagcttt2051agccagaacgtttctattgttgccatctctgtctgcacgaaagaagagac2101aaaaccatgaatcagtaacttgaaaccgtccagtagtggagccagctttc2151tatgttatgtttctgcaactgcgttgtctgtagtcttagattttcatcat2201catttatgtatgtggcaaagaccttcgctttaactagtgtaataccatgg2251attcttagcttagcttcaatgataatgccattaaaattcagtcacaggct2301ataaggatgaatgtgaacgaacgtcgtcgtttggg。

序列表

<110>江苏大学

<120>拟南芥nac103基因在调节种子萌发中的应用

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gatgccattgtctgaggtcgacatttac28

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gatgccattgactgaggtcgacatttac28

<210>3

<211>2335

<212>dna

<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

<400>3

cttctccttcaagctatactctcattctctctcctccgaccaaagttttctgttcctccg60

cttctccttcccctaccggtgcgacttctcctctcttttatcttctctctttgtttattt120

taacgccggaaatgtttctcacttgtacgttttggtttccgatgtaatctctcgtcttct180

ctgtttcttgaaaatggggttttgatttctgggtttgatcttagctccatcaactttgat240

gcttccccttgatcaaaggattaaattctacagtggagattatctatctgcttaccaaat300

tttgatcagttacaacaaaattacaaaatcagaattagccctagaatttgttttttgttg360

ttacagtcccattcattgaaaagtgtcttcttctatgtgtaggtgcttcgttttgtgttg420

tacagcagatgtctgttgatatctgcaagaagaatccatcgtttctttggtgtgactgtg480

gatatatgagcagaggaaggttgtggtgctttcagaccatcatgttttcttcttcttctt540

agctttttgtctctgctagatcttgttattgtgagttttttgctttactggtgagggaag600

ttacttagtgtagtgaaagttttccccttgtcttccaatggggaaaactaacttggcacc660

tggttttcggtttcatccgactgatgttgaacttgtgagatactacttgaagaggaaagt720

tatgggaaaaaagttccaagttgatgccattgctgaggtcgacatttacaagttcgaacc780

tcctgatttacccggtaactaactcattctttcagaaatctttgttctgtttcatgcttt840

cttatttatttcctgattactaacagaggtttctttacattgtacagacaaatcatgtct900

agggactggagatcttaagtggtacttcttctgtccaagagaaaagaagtatcccaaagg960

cggtaaggcaaaccgctctactgaatgtggttactggaagaccacagggagagacagaga1020

tgtttcttataatgacgaagtcactgggaagataagaactctgatttatcactacgggaa1080

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ttgattccttgcaagtttactaaacatgcttgttgtgccctgcaggatacttatgtgctt1260

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