家蚕BmSCP1基因及其重组表达载体和应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，家蚕bmscp1基因和蛋白，还涉及含有家蚕bmscp1基因的重组表达载体，以及家蚕bmscp1基因和蛋白的应用。

背景技术

家蚕是一种重要的经济昆虫，蚕丝是丝绸工业的重要原料。在我国很多农村地区，养蚕业是当地经济的支柱性产业和农民的主要经济收入来源，蚕丝业每年为蚕农创收上百亿元。但是，家蚕却面临严重的疾病威胁，每年因蚕病引起的损失占蚕业生产总收入的20％左右。病毒病是对养蚕业威胁最严重的一类疾病，主要由家蚕质型多角体病毒bmcpv等引起。

由于bmcpv在蚕业生产上危害严重，科研工作者一直希望找出影响家蚕对病毒抗性的关键基因，然后通过分子生物技术来提高家蚕对病毒的抗性。对影响家蚕病毒抗性的关键基因全长序列进行克隆和鉴定，为阐明家蚕抵抗病毒的机制，以及培育抗性品种应用于蚕业生产有着重要的理论价值和实践意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供家蚕bmscp1基因；本发明的目的之二在于提供含有所述家蚕bmscp1基因的重组表达载体；本发明的目的之三在于提供家蚕bmscp1基因在制备抗bmcpv病毒家蚕品种中的应用；本发明的目的之四在于提供家蚕bmscp1基因在制备抗bmcpv病毒家蚕品种中的应用；本发明的目的之五在于提供家蚕bmscp1基因在制备抑制bmcpv病毒增殖的药物中的应用；本发明的目的之六在于提供家蚕bmscp1蛋白；本发明的目的之七在于提供所述家蚕bmscp1蛋白在制备降低bmcpv病毒感染死亡率的药物中的应用；本发明的目的之八在于提供所述家蚕bmscp1蛋白在制备抑制bmcpv病毒增殖的药物中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、家蚕bmscp1基因，所述家蚕bmscp1基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。

2.含有所述家蚕bmscp1基因的重组表达载体。

优选的，所述表达载体为由seqidno.3所示序列插入包含中肠特异启动子p3p+5ui和sv40终止信号序列的psl1180载体的bamhi和noti酶切位点处。

3.所述家蚕bmscp1基因在制备抗bmcpv病毒家蚕品种中的应用。

4.所述家蚕bmscp1基因在制备降低bmcpv病毒感染死亡率的药物中的应用。

5.所述家蚕bmscp1基因在制备抑制bmcpv病毒增殖的药物中的应用。

6.家蚕bmscp1蛋白，所述家蚕bmscp1蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示。

7.所述家蚕bmscp1蛋白在制备降低bmcpv病毒感染死亡率的药物中的应用。

8.所述家蚕bmscp1蛋白在制备抑制bmcpv病毒增殖的药物中的应用。

本发明中h表示小时，min表示分钟。

本发明的有益效果在于：本发明克隆了家蚕的一个影响家蚕抗性的关键基因bmscp1的全长cds序列，该基因在家蚕中肠特异表达并分泌到肠液中，被bmcpv病毒诱导上调。为了研究该基因的功能，以该基因的全长cds序列作为靶标，构建了转基因增量表达载体，通过转基因显微注射，筛选得到转基因阳性个体，增量表达该基因的转基因家蚕对bmcpv病毒的抗性显著提高，因此该基因在家蚕转基因抗病育种的研究和应用中具有重要价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为bmscp1基因的转基因增量表达载体示意图。

图2为qpcr检测转基因家蚕体内bmscp1表达量。

图3为转基因家蚕感染bmcpv后的死亡率统计。

图4为转基因家蚕感染bmcpv后的病毒含量检测。

图5为肠液总蛋白sds-page和westernblot分析(a：肠液总蛋白sds-page分析；m：marker；1：scp1-1五龄第四天肠液；2：scp1-2五龄第四天肠液；3：对照(wt)五龄第四天肠液；b：肠液总蛋白westernblot检测；1：scp1-1五龄第四天肠液；2：scp1-2五龄第四天肠液；3：对照(wt)五龄第四天肠液)。

图6为肠液处理后的bmcpv添食家蚕中肠病毒量(a：以感染后24h的家蚕幼虫中肠cdna为模板，qpcr检测bmcpv基因组片段的表达量；b：用bmscp1抗体和pbs处理正常家蚕肠液后，与病毒孵育，以此病毒添食家蚕，以感染后24h的家蚕幼虫中肠cdna为模板，qpcr检测bmcpv基因组片段的表达量)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、克隆bmscp1基因全长cds序列

首先根据家蚕基因组序列设计特异引物，bmscp1的正向引物：5'-atgattatcttacttgtattgg-3'(seqidno.1)，反向引物5'-ttatgtatttgaaagccatcg-3'(seqidno.2)。以家蚕大造(dz)5龄3天的中肠cdna为模板进行扩增，pcr反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、54℃退火40秒、72℃延伸70秒，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；pcr产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pmd19-t载体连接，连接反应在t4dna连接酶作用下，16℃过夜连接，然后转化dh5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明成功克隆了bmscp1基因的cds序列。

最终获得了1440bp的bmscp1基因cds全长序列，核苷酸序列如seqidno.3所示，氨基酸序列如seqidno.4所示，包含6个外显子和5个内含子。生物信息学分析显示bmscp1第1-16个氨基酸为信号肽，该蛋白具有一个肽酶_s28结构域。

实施例2、构建转基因增量表达载体piggybac[p3p+5ui-bmscp1-sv40-3×p3dsredafm]

为了研究该基因的功能，通过增量表达方式来提高家蚕体内该基因的表达量，然后再观察病毒增殖是否有变化，从而证明该基因的功能。

以bmscp1基因的全长cds序列作为靶标，设计增量表达引物，上游引物为bmscp1oe-f：5'-ggatccatgattatcttacttgtattgg-3'(seqidno.5)，下游引物为bmscp1oe-r：5'–gcggccgcttatgtatttgaaagccatcg-3'(seqidno.6)。以克隆的bmscp1基因的cds质粒为模板进行pcr扩增，pcr反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性40秒、54℃退火40秒、72℃延伸70秒，共29个循环，最后72℃延伸10分钟；对扩增出的目的条带进行回收、连接和转化，筛选阳性克隆后测序。

将测序验证成功的质粒用bamhi和noti进行双酶切，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得bmscp1酶切片段；同时用bamhi和noti双酶切已经包含中肠特异启动子p3p+5ui和sv40终止信号序列的psl1180载体(参见liangjiang.the5’-utrintronofthemidgut-specificbmapn4geneaffectsthelevelandlocationofexpressionintransgenicsilkworms.insectbiochemistryandmolecularbiology63(2015)21～6，具体是将p3p+5ui和sv40分别连入psl1180载体多克隆位点而得)，经琼脂糖电泳鉴定并回收，得psl1180-p3p+5ui-sv40酶切片段。将bmscp1酶切片段和psl1180-p3p+5ui-sv40酶切片段进行连接，然后转化，筛选阳性克隆，得到psl1180-p3p+5ui-bmscp1-sv40载体。将piggybac[3×p3dsredafm]载体和psl1180-p3p+5ui-bmscp1-sv40分别用asci单酶切，回收目的条带后连接转化，筛选阳性克隆，得到piggybac[p3p+5ui-bmscp1-sv40-3×p3dsredafm]载体(pb-scp1)，结果如图1所示。

实施例3、转基因显微注射和阳性个体的筛选

(1)将家蚕大造(dz)品种蚕卵浸酸(盐酸比重为1.073，温度为46℃，时间为5分钟)解除滞育以后，放于15℃和85％湿度的黑暗环境中催青30天左右直至孵化，将蚁蚕收好置于标准环境中饲养(温度：25℃，湿度：80％)，化蛾以后将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后产下的蚕卵为非滞育蚕卵，用于下一步的显微注射。

将pb-scp1重组载体和辅助质粒a3h混合备用。将产下的蚕卵在干净的载玻片上排列整齐，在蚕卵产后2小时用eppendorf显微注射仪将混合质粒溶液注射dz蚕卵中，总注射蚕卵数为189粒。用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度80％的环境中催青10天左右孵化，将孵化的17头g0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，g0代蚕蛾通过自交或回交共获得11蛾圈g1代蚕卵，用电动宏观荧光显微镜观察g1胚胎筛选并获得2个阳性蛾圈，继代扩大得到转基因家蚕系统scp1-1和scp1-2。

实施例4、转基因家蚕抗病毒能力检测

取转基因系统scp1-1和scp1-2及非转基因对照(wt)的五龄第三天幼虫中肠rna，利用bmscp1和内参基因tif-4a的各自特异引物进行qpcr检测，结果如图2所示。结果显示转基因家蚕体内bmscp1表达量显著高于对照。

取scp1-1、scp1-2和wt的4龄起蚕，以半致死剂量经口单头添食bmcpv病毒，统计死亡率到上蔟前，结果如图3所示。结果显示，在未攻毒对照几乎全部存活的情况下，scp1-1、scp1-2、wt的死亡率分别为22％、27％和45％，scp1-1和scp1-2的死亡率分别比wt降低了23％和18％。

在添食bmcpv病毒72h后，提取家蚕中肠rna并反转录成cdna，以bmcpv病毒基因片段s1、s2、s4、s5、s8和s10的特异引物进行qpcr检测，以家蚕看家基因tif-4a作为内参。将wt中每个基因的检测结果设定为100％，转基因品系的值以其为标准进行换算，统计感染bmcpv后的病毒含量，结果如图4所示。结果显示，scp1-1中bmcpv病毒基因片段s1、s2、s4、s5、s8和s10的含量分别只占对照的22％、23％、18％、23％、19％和16％；scp1-2中bmcpv病毒基因片段s1、s2、s4、s5、s8和s10的含量分别只占对照的22％、33％、21％、19％、23％和29％。结果表明增量表达bmscp1能够显著提高转基因家蚕对bmcpv的抗性。

实施例5、bmscp1蛋白在肠液中发挥抗病毒功能

提取转基因家蚕和对照五龄第四天肠液，测定各品系肠液蛋白含量后，等量上样进行sds-page电泳分析，考马斯亮蓝染色结果显示scp1-1、scp1-2和对照的上样量基本一致，利用bmscp1抗体进行westernblot检测，结果如图5所示。结果表明，在转基因家蚕肠液中bmscp1蛋白含量明显高于对照。

在五龄第四天提取转基因家蚕及对照的等量肠液，分别与等量的bmcpv病毒孵育后，添食四龄正常家蚕，24h后提取家蚕中肠rna，利用bmcpv基因片段s1、s2、s4、s5、s8、s10和家蚕内参基因tif-4a的特异引物进行qpcr检测，结果如图6中a所示。结果显示，在添食转基因家蚕肠液处理病毒的家蚕体内，病毒含量显著低于对照。

提取正常家蚕五龄第四天肠液，分成两等份，分别用bmscp1抗体和pbs处理，然后与等量bmcpv病毒孵育，再添食四龄家蚕，提取病毒感染后24h家蚕中肠rna进行qpcr检测，结果如图6中b所示。结果显示，在添食bmscp1抗体处理病毒的家蚕体内，病毒含量显著高于对照。

上述结果明，增量表达bmscp1的转基因家蚕显著抑制了bmcpv病毒的增殖，感染病毒后的死亡率显著降低；更有趣的是，利用抗体阻断肠液中bmscp1蛋白后，病毒进入家蚕体内的量显著增加，说明bmscp1蛋白在感染初期发挥抗病毒功能。这些结果说明bmscp1基因是影响家蚕抗性的关键基因，可以作为家蚕转基因抗病育种的靶标基因用于今后的分子育种工作中。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>西南大学

<120>家蚕bmscp1基因及其重组表达载体和应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>1440

<212>dna

<213>家蚕(bombyxmori)

<400>3

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<212>prt

<213>家蚕(bombyxmori)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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