一种智能高分子包埋微粒的制备方法与流程

本发明属于高分子复合材料技术领域，特别涉及一种智能高分子包埋微粒的制备方法，该微粒具有温度和pH双重智能响应特征。

背景技术：

目前，国内外的污水处理厂还是以活性污泥法作为主导的处理工艺，该工艺存在以下问题：首先，系统中各种微生物的份额是由基质和微生物的产率自然形成的。由于自养菌的代谢过程较慢，生长周期长，在常规的活性污泥法中，相关自养菌所占份额极低，相关污染物去除效率低，成为污水处理技术中控制性步骤。以城市污水处理厂硝化菌为例加以说明。城市污水中COD和氨氮的浓度一般分别为300～500mg/L和30～50mg/L，相应的异养菌和硝化菌的污泥产率系数分别为0.2(gVSS/gCOD)和0.1(gVSS/gNH4+-N)，对应的异养菌和硝化菌在活性污泥污泥中的份额分别为70％～80％和3～5％。尽管各个城市的污水处理系统的污染物浓度、污泥龄等营养条件和操作条件有所差异，但大致范围基本相似。由于硝化菌份额低，需要通过延长水力停留时间提高氨的去除率。其次，对于同一个污水处理系统中不同微生物的污泥龄是相同的，而该污泥龄并非各种微生物的最佳停留时间，使得微生物的处理效果达不到最优。最后，污水生物处理中微生物受温度和pH值影响，对于份额少的自养菌在不同的温度和pH值条件下的影响尤为明显，甚至会因为温度和pH值波动导致代谢活动停止，使系统出水不达标。

包埋目标微生物的技术可以有效解决以上问题。通常被用来作为包埋材料的有琼脂、角叉莱胶、壳聚糖、海藻酸盐、聚丙烯酰胺(ACAM)和聚乙烯醇(PVA)等。琼脂为热凝胶，不容易被微生物降解，但机械强度低，价格高；角叉莱胶为含有钾或钙离子的热/离子凝胶，在交联过程中过量的钾离子对微生物细胞有毒。壳聚糖为阴离子型的离子凝胶，会导致微生物细胞活性降低，大多数情况下作为微胶囊的低浓度涂层。海藻酸盐为二价离子凝胶，包埋微生物细胞条件简单温和，无毒，生物相容性好，成本低，但胶珠稳定性和机械性能较差，容易受到阳离子螯合剂和酸性环境的影响而导致胶珠破损或溶解。聚丙烯酰胺是人工合成的聚合物，丙烯酰胺的含量和包埋细胞含量会影响凝胶的硬度，丙烯酰胺和交联剂的比例决定了凝胶的孔径和稳定性，凝胶非常多孔且含水量高。然而，由于所使用的试剂和自由基聚合反应常常会严重损伤细胞壁，会导致细胞活力降低。聚乙烯醇(PVA)，作为新型微生物包埋固定化载体，具有较高的机械强度以及较好的化学稳定性。但研究表明采用PVA作为包埋固定化载体时存在水溶胀性大，传质能力弱和交联包埋过程中硼酸对微生物产生的严重损伤等问题。综合以上文献，天然聚合物制取微生物细胞微粒时，制取条件更温和，对细胞的完整性和活性危害小，渗透性更好，可以为微生物提供更好的物质代谢通道，但机械强度不够，化学稳定性差，容易破碎和泄露。人工合成聚合物可以提供更高的机械强度和化学稳定性，抗生物分解能力强，但在制取微囊的过程中由于反应条件过于剧烈，往往会对微生物细胞造成严重损伤，降低了细胞活性且传质效果不如天然聚合物。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种智能高分子包埋微粒的制备方法，该微粒具有将目标微生物在温和，无毒和生物相容性好的条件下固定于微粒中，微生物代谢物质通过微粒内微孔与环境发生传递和交换，实现微生物的新陈代谢，生长和繁殖富集。用于代谢物质传递和交换的微粒内部通道具有随温度和pH值的变化而变化的特征。当温度降低时，通道孔径增大。通常情况下，当环境温度降低时，微生物的生长速率会下降，当通道孔径增大后，底物传递和交换能力增强，减弱因温度下降对微生物生长代谢的影响。当pH值升高时，通道孔径增大。通常情况下，当某些碱性底物浓度升高时会，会导致pH值升高，通道孔径增大，底物传递和交换能力增强，微生物对底物降解速率增加，减弱因底物浓度升高带来对微生物生长代谢的影响。该项技术为微生物的生长代谢、培养和富集提供了稳定的环境，削弱了外部环境变化对微生物生长代谢的冲击作用。同时，因为微生物被固定于较大粒径(1-5mm，根据需要，通过改变制粒条件而获得不同粒径)的微球内，使目标微生物更易于从反应系统内分离出来并进行回用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种智能高分子包埋微粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制海藻酸钠溶液；

(2)配制氯化钙溶液；

(3)将步骤(1)配制的海藻酸钠溶液滴入步骤(2)配制的氯化钙溶液中制取海藻酸钙微球；

(4)温度响应溶液制取；

(5)将步骤(3)制取的海藻酸钙微球投入步骤(4)配制的温度响应溶液中进行充分反应制取温度响应微球；

(6)pH响应溶液制取；

(7)将步骤(5)制取的温度响应微球投入步骤(6)配制的pH响应溶液中进行充分反应制取智能高分子包埋微球。

所述海藻酸钠溶液质量浓度为2-5％，配置温度为30-60，℃溶解充分。

所述氯化钙溶液质量浓度为1-6％。

所述步骤(3)中，滴入高度为4-10cm，所得海藻酸钙微球低温保存待用。

所述步骤(4)温度响应溶液的成分为：质量浓度为1-4％的NIPPAm，质量浓度为0.1-0.6‰的MBA，质量浓度为0.1-0.6‰的APS和体积百分比浓度为0.5-3‰的TMEDA。

所述步骤(5)中将海藻酸钙微球投入温度响应溶液中发生交联反应，反应时间控制在1-4h之内。

所述步骤(6)pH响应溶液的成分为：质量浓度为1-5％的AA，质量浓度为0.1-0.6‰的MBA，质量浓度为0.1-0.6‰的APS，质量浓度为0.1-0.6‰的SBS。

所述步骤(7)将温度响应微球投入pH响应溶液中反应10-40min，即获得双响应智能高分子包埋微球，之后保存于1-6％的氯化钙溶液中。

与现有技术相比，本发明使用海藻酸盐作为包埋内核，其包埋微生物细胞条件简单温和，无毒，生物相容性好，成本低。在此基础上，通过接枝共聚将温度感应高分子材料丙烯酸和pH感应高分子材料异丙基丙烯酰胺结合到内核表面形成一层智能感应高分子凝胶层，最终形成对温度和ph值具有双感应的智能高分子包埋微粒。本发明所使用的海藻酸盐具有生物相容性好，成本低，而高分子凝胶层具备对温度和pH值产生智能响应功能，同时高分子凝胶层又增强了海藻酸盐小球的机械强度。实现温和固定微生物，增强微生物对温度和pH值波动的耐受能力，实现微球对温度和pH值的智能响应，并通过复合材料制粒可以使微球机械强度更高，延长使用寿命。最终实现不同菌种的有效培养、富集和分离。本微球可以应用至多种微生物的固定分离培养系统和特定污染物污水生物处理系统中。

附图说明

图1是实施例1所得温度和pH双响应微球内部结构图(放大40倍)。

图2是实施例1所得温度和pH双响应微球内部结构图(放大60倍)。

图3是实施例1所得温度和pH双响应微球内部结构图(放大5000倍)。

图4是实施例1所得温度和pH双响应微球内部结构图(放大10000倍)。

图5是空白海藻酸钙、pH响应、温度响应和双响应微粒红外光谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。

本发明一种具有温度和pH双重智能响应高分子包埋微粒的制备方法，其中需要的原料见表1：

表1：微粒制取原料表

制备方法包括下述步骤：

(1)配制质量浓度为2-5％的海藻酸钠溶液：称取一定量的海藻酸钠粉末，按质量百分比浓度为2-5％的比例量取一定量的去离子水水浴加热至30-60℃，将海藻酸钠粉末投加至30-60℃的去离子水中，用搅拌器连续搅拌，直至完全溶解，备用。

(2)配制质量浓度为1-6％的氯化钙溶液：称取一定量的氯化钙，按质量百分比浓度为1-6％的比例量取一定量的去离子水，将氯化钙投加至去离子水中，用搅拌器连续搅拌，直至完全溶解。

(3)将对应溶液添加至制粒机内，将海藻酸钠液滴滴入氯化钙溶液中，根据目标微球的要求设定制粒机的转速和滴落高度，制取直径为(1-5mm，按需要制取)的微球。将获得的微粒取出，用1-6％的氯化钙溶液冲洗后，置于1-6％的氯化钙溶液中，低温(4℃)保存待用。

(4)温度响应溶液制取：制取质量浓度为1-4％的NIPAAm(单体)溶液(制取该溶液时需要充分搅拌混合至完全溶解)，并在该溶液中按质量浓度为0.1-0.6‰添加MBA，按质量浓度为0.1-0.6‰添加APS，按体积百分比为0.5‰-3‰添加TMEDA，将所得混合液在常温下充分搅拌混合，直至完全溶解，制得温度响应溶液，常温阴凉处保存，待用。

(5)将制取的海藻酸钙微粒置于温度响应溶液中，进行交联反应1-4h，将温度响应高分子材料结合到海藻酸钙微球上，得到温度响应智能微球，待用。

(6)pH响应溶液制取：制取质量浓度为1-5％的AA溶液(制取该溶液时需要充分搅拌至完全混合)，并在该溶液中按质量浓度为0.1-0.6‰添加MBA，分别按质量浓度为0.1-0.6‰添加APS和SBS，将所得混合液在常温下充分搅拌混合，直至完全溶解，制得pH响应溶液，常温阴凉处保存，待用。

(7)将从温度响应体系中取出的温度响应微球用去离子水冲洗干净后，投入pH响应溶液中反应10-40min，得到智能双响应微球，取出，置于1-6％氯化钙溶液中保存，待用。

以下是两个具体的实施例。

实施例1

(1)配制质量浓度为3％的海藻酸钙溶液、5％的氯化钙溶液。进行滴定，获得海藻酸钙内核。

(2)配制温度响应溶液，将海藻酸钙内核放入该溶液中，反应两个小时，获得温度响应微球。

(3)配制pH响应溶液，将温度响应微球放入该溶液中，反应二十分钟，获得温度和pH响应微粒。

制备出的具有温度和pH双响应微粒，如图1、图2、图3和图4所示，图1表明智能双响应微粒表面和内部结构不同，在其表面形成了一个很薄的结构层，可以实现智能双响应功能；图2表明在表面和内部结构内均存在囊腔，可以为微生物的生长和物质交换提供足够空间；图3表明智能双响应微粒表面是不连续不均匀的，其物质组成不均匀；图4表明智能双响应微粒表面的微观结构是三维网状结构，可以为微生物新陈代谢的代谢基质和产物提供有效的物质扩散通道。随着温度和pH变化，三维网状结构孔隙大小也会随之变化，从而达到控制扩散速度的目的。

图5为空白海藻酸钙微粒、pH响应微粒、温度响应微粒、双响应微粒的红外光谱图。四种微胶囊在波长1700cm^-1左右，出现了羧基的吸收峰，是由于海藻酸本身具有羧基。温度响应海藻酸钙微胶囊和智能双响应海藻酸钙微胶囊在波长3050cm^-1左右，显示了氨基的吸收峰。是由于温度响应微胶囊和双响应微胶囊的分子中具有NIPAM，其分子结构中含有酰胺基团。温度和pH智能双响应海藻酸钙微粒的红外光谱图与pH响应微粒和温度响应微粒的红外光谱图之和相吻合。通过傅立叶变换红外光谱可以分析双响应微球内部分子结构中未生成较为复杂的化学键或者发生共聚。说明了双响应是由pH响应和温度响应共同形成的。

对智能双响应高分子包埋微粒进行温度响应的外观研究，分别观察微粒25℃、40℃的去离子水中颜色变化，此颜色的变化是一个可逆的过程，都可以通过改变温度来控制颜色的交替。

对智能双响应高分子包埋微粒进行pH响应的外观研究，分别观察微粒在酸性和碱性的缓冲溶液中颜色的变化，此颜色的变化是一个可逆的过程，都可以通过改变pH值来控制颜色的交替。

实施例2

实施例2包埋微粒的制备步骤和条件的控制同实施例1，对智能双响应高分子包埋微粒进行温度响应和pH响应的外观观察分析。

将微粒放入纯净水中，进行加热，从0℃逐渐升温至45℃，可以观察到微粒逐渐从无色透明转变成乳白色。当对其实施降温，从45℃逐渐降到0℃时，颜色由从乳白色逐渐转变成无色透明。其颜色的变化是一个可逆的过程。

在25℃的溶液中，可以观察到微粒随着溶液酸性的增强，微粒的颜色逐渐变浅变透明，随着溶液碱性增强，微粒的颜色逐渐加深为乳白色。微粒颜色变化对pH的响应过程也为一个可逆过程。随着溶液酸性减弱，微粒的透明度逐渐减小，随着溶液碱性减弱，微粒的透明度逐渐增强，乳白色逐渐减退。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。