一种水凝胶复合物、制备方法及应用与流程

本发明涉及生物医学工程领域，并且更具体地，涉及一种水凝胶复合物、制备方法及应用。

背景技术：

透明质酸是在组织广泛存在分布的非硫酸化糖胺聚糖，近年来，透明质酸在诸多领域均有应用，例如美容中、风湿病学中、眼科学中、制药学中以及外科手术中，特别是用于软骨修复、骨关节炎治疗等。

透明质酸在关节腔里起着润滑的作用，也有用于缓解关节炎带来的疼痛。由于其良好的生物相容性，被广泛的应用于组织修复。但是处于自然未修饰状态下的透明质酸十分容易在体内被快速清除，所以在保证生物相容性前提下对透明质酸进行改性延长其半衰期是必要的。现有技术中存在一些材料(例如壳聚糖和海藻酸钠)可以不经过手术，仅通过注射一些材料或者细胞复合物来达到软骨修复的手段，但是可能会引起炎症反应。透明质酸鲜有引起不良反应的报道，其作为水凝胶广泛应用于生物医学领域。

关节软骨修复一直是临床难题。和骨骼不同，关节软骨缺乏血管、神经和淋巴系统，一旦有较大的受损，难以靠组织自愈进行修复。临床上经典的治疗方法是骨髓刺激法，通过引入骨髓血，刺激缺损处软骨再生；例如骨髓刺激法可以用于微骨折、软骨自体或者异体移植。但是骨髓刺激法再生的软骨是纤维软骨，性能不如原生的透明软骨。并且会随着时间退变，骨髓刺激法再生的软骨的移植则会存在基质整合不良、细胞寿命短以及潜在疾病转移风险等问题。由于上述治疗方法的创伤面较大并且花费和康复时间较长，近些年来微创手术也逐步在关节软骨修复中应用。

综上，想要成功修复软骨，充分利用关节镜的优势，所需材料除了良好的生物相容性，还需要具备来源广泛、湿粘附性、操作简便、适用缺损类型广、创伤性小、副作用小、成软骨性能优异等特点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可注射原位成胶水凝胶复合物、制备方法及应用。

本发明的技术方案如下：

根据本发明，提供一种形成水凝胶复合物的方法，包含以下步骤：

(1)制备透明质酸溶液；

(2)制备醛基改性透明质酸及酰肼衍生化透明质酸；

其中，制备醛基改性透明质酸包括：

a)氧化步骤(1)中得到的透明质酸溶液，干燥纯化得到醛基改性透明质酸(i)；或者

b)进行步骤a)；

用四丁基氢氧化铵中和步骤a)得到的醛基改性透明质酸(i)的水溶液至ph为7.4-7.6，干燥纯化后得到改性透明质酸的四丁胺盐；将改性透明质酸的四丁胺盐溶解后，加入过量活化剂活化改性透明质酸的四丁胺盐，再加入过量苯甲醛基团引入剂进行反应，反应结束后干燥纯化得到醛基改性透明质酸(ii)；

其中，醛基改性透明质酸(i)是通过氧化而开环得到醛基。醛基改性透明质酸(ii)是通过接枝而引入苯甲醛基团；

制备酰肼衍生化透明质酸包括：

在步骤(1)中得到的透明质酸溶液中加入活化剂活化后，再加入过量联氨或二酰肼进行反应，得到酰肼衍生化透明质酸溶液；

(3)将醛基改性透明质酸和酰肼衍生化透明质酸混合后成胶。

根据本发明的一个实施例，步骤(1)制备透明质酸溶液的方法包含：将分子量10万～200万道尔顿的透明质酸钠(nahy)于室温溶于水中，形成0.005～0.3g/ml的透明质酸水溶液(优选地，此处透明质酸水溶液的质量浓度可以为0.005～0.1g/ml)。加入阳离子交换树脂搅拌过夜，过滤得到透明质酸溶液(ha)。

根据本发明的一个实施例，制备醛基改性透明质酸(i)包括：

向步骤(1)中的透明质酸溶液中加入氧化剂，置于暗处反应0.5～6小时。加入乙二醇除去多余的氧化剂，继续搅拌1小时后，收取产物，纯化干燥得到醛基改性透明质酸(i)。

根据本发明的一个实施例，制备醛基改性透明质酸(i)中使用的氧化剂可以是高碘酸盐、高锰酸盐、氯酸盐等的一种。

根据本发明的一个实施例，制备醛基改性透明质酸(i)中加入的透明质酸溶液与氧化剂的摩尔比为(1：1)～(1：10)。

根据本发明的一个实施例，步骤(3)中，醛基改性透明质酸和酰肼衍生化透明质酸混合的质量比为(5～1)：(1～5)。

根据本发明的一个实施例，步骤(2)中的改性透明质酸的四丁胺盐与苯甲醛基团引入剂反应的摩尔比(1：1)～(1：10)，反应的ph为5.6～7.2，反应时间为1～48小时；苯甲醛基团引入剂为对羟基苯甲醛或对羟基苯甲醛同分异构体及羟基苯甲醛衍生物。

根据本发明的一个实施例，二酰肼可以是己二酸二酰肼(adh)。

根据本发明的一个实施例，对羟基苯甲醛同分异构体及羟基苯甲醛衍生物可以是邻羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛等。

根据本发明的一个实施例，步骤(2)中使用的活化剂均为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)的组合，或4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)。即制备醛基改性透明质酸中使用的活化剂和制备酰肼衍生化透明质酸中使用的活化剂均为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)的组合，或4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)。

根据本发明的一个实施例，制备醛基改性透明质酸中活化剂的活化时间为0.5～2小时。

根据本发明的一个实施例，制备醛基改性透明质酸中改性透明质酸的四丁胺盐与活化剂的摩尔比(1：1)～(1：10)。

根据本发明的一个实施例，步骤(2)改性透明质酸的四丁胺盐使用有机溶剂溶解，上述有机溶剂可以是二甲基亚砜(dmso)或二甲基甲酰胺(dmf)。

根据本发明的一个实施例，步骤(2)中，制备酰肼衍生化透明质酸溶液中，活化剂活化透明质过程为在步骤(1)中得到的透明质酸溶液中透明质酸与活化剂的摩尔比为(1：1)～(1：10)，搅拌0.5～6小时。

根据本发明的一个实施例，制备酰肼衍生化透明质酸溶液中，活化后的透明质酸溶液与联氨或二酰肼反应的摩尔比(1：1)～(1：50)，反应时间为16～72小时。

此外，例如光固化、静电作用、温敏等的其他成胶方式也可以在本发明的方法基础上实现。

根据本发明，提供一种采用如上方法制备的水凝胶复合物，原料包括如下组分：

(a)醛基改性透明质酸溶液；

(b)酰肼衍生化透明质酸溶液；

水凝胶复合物为将组分(a)和(b)混合成胶。

根据本发明的一个实施例，醛基改性透明质酸的平均分子量范围为10万至200万道尔顿，以及酰肼衍生化透明质酸的平均分子量范围为10万至200万道尔顿。

根据本发明的一个实施例，醛基改性透明质酸的醛基取代度为10-70％；酰肼衍生化透明质酸的酰肼基团或肼基的接枝率为10-80％。

本发明的水凝胶复合物，可以用于：

-美容中，用于填充或替代生物组织；

-风湿病学中，用于替代或暂时补充滑液的试剂；

-眼科学中，作为辅助剂；

-制药学中，作为用于释放活性物质的试剂；

-外科手术中，用于软骨修复、骨关节炎治疗、骨重建、增加声带体积或生成外科组织，并且可结合细胞治疗使用。

本发明将醛基改性透明质酸和酰肼衍生化透明质酸两种组分分别无菌封装储存在密闭容器和注射器内，混合后几分钟内即可迅速成胶。配合关节镜手术时，使用者只需直接注射需要量至关节腔中填满缺损处，复合物通过席夫碱反应，能迅速成胶，并且吸附在关节软骨缺损表面。

本发明制备的水凝胶体系，使用方便，创伤小，无明显副作用，成胶迅速，能填补各类不规则形状软骨缺损并粘附于受损处，对受损的关节起到良好的保护作用，还能结合各类生物活性成分促进软骨修复。改性的透明质酸可以在生理环境下交联，与未改性的透明质酸相比，能在缺损处稳定存在促进修复，不会被快速清除，延长了半衰期；同时具有生物可降解性，有利于再生后期基质的积累，与合成高分子相比，由于体内本身就存在透明质酸，水凝胶复合物的降解物可自然代谢。和同类水凝胶体系对比，原料本身不含有毒小分子，成胶反应也无有副作用的小分子副产物生成，具有良好的生物相容性。本发明的水凝胶复合物由于引入苯环(由醛基改性透明质酸引入)能与交联反应后形成的c＝n键形成共轭体系，进一步增加了席夫碱反应水凝胶复合物的体内稳定性。

本发明的水凝胶复合物能配合关节镜，通过简便的注射方式，于软骨缺损处迅速成胶，保护受损的关节，并且在不引起明显副作用情况下结合生物活性成分，促进软骨再生进行修复。极大地减轻了患者负担。

综上，本发明的水凝胶复合物除了良好的生物相容性，还具备来源广泛、湿粘附性、操作简便、适用缺损类型广、创伤性小、副作用小、成软骨性能优异等特点。

本发明旨在通过对透明质酸进行改性，在保证其良好的生物相容性的前提下，使最终产物能配合临床关节镜，通过一次性微创注射，在任意缺损部位快速成胶进行填补，并且能够紧密粘附在缺损部位，尽可能减少病人负担，并达到促进软骨修复的效果。

附图说明

图1为根据本发明的实施例制备水凝胶复合物的示意图；

图2为根据本发明的实施例1的产物进行表征的核磁共振谱；

图3为根据本发明的实施例4的产物进行表征的红外光谱；

图4为根据本发明的实施例5的产物进行表征的红外光谱；

图5为根据本发明的实施例5的产物进行表征的核磁共振谱；

图6为根据本发明的实施例制备水凝胶复合物的生物毒性mtt测试的结果图；

图7为根据本发明的实施例的水凝胶复合物的使用示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除另外的说明，本文使用的术语是有机合成领域、聚合物、药物科学领域中使用的标准定义。

“透明质酸”是指未经改性或非衍生化的透明质酸。

“醛基取代度”是指醛基改性的透明质酸中醛基取代的程度，即取代基醛基所占的百分比或苯甲醛基团所占的百分比。

“酰肼基团或肼基接枝率”是指酰肼衍生化透明质酸中酰肼基团或肼基取代的程度，即酰肼基团所占的百分比或肼基所占的百分比。

下面将在更详细地讨论方法、组合物等特征。

透明质酸溶液的获得

制备透明质酸溶液：将分子量10万～200万道尔顿的透明质酸钠(nahy)于室温溶于水中，形成0.005～0.3g/ml的透明质酸水溶液(优选地，此处透明质酸水溶液的质量浓度可以为0.005～0.1g/ml)。加入阳离子交换树脂搅拌过夜，过滤得到透明质酸溶液(ha)。阳离子交换树脂可以使用苯乙烯离子交换树脂或丙烯酸离子交换树脂。

醛基改性透明质酸的制备

本发明的醛基改性透明质酸可以通过以下两种方法制备：

第一种方法：通过氧化透明质酸而开环得到醛基，进而获得醛基改性透明质酸(i)。按照ha与氧化剂的摩尔比为(1：1)～(1：10)在透明质酸溶液(ha)中加入氧化剂，将体系置于暗处反应0.5～6小时。加入乙二醇除去多余的氧化剂，继续搅拌1小时后，收取产物，纯化干燥得到醛基改性透明质酸(i)。氧化剂可以是高碘酸盐、高锰酸盐、氯酸盐等的一种。

第二种方法：

按照上述第一种方法的到醛基改性透明质酸(i)，在醛基改性透明质酸(i)的基础上进行改性引入苯甲醛基团，进而获得同时具有醛基和苯甲醛基团的醛基改性透明质酸(ii)。具体为：

将四丁基氢氧化铵(tba-oh)中和醛基改性透明质酸(i)的水溶液至ph为7.4-7.6，干燥纯化后得到改性透明质酸的四丁胺盐；将改性透明质酸的四丁胺盐使用例如二甲基亚砜(dmso)或二甲基甲酰胺(dmf)的有机溶剂溶解后，按照改性透明质酸的四丁胺盐与活化剂的摩尔比(1：1)～(1：10)加入活化剂活化改性透明质酸的四丁胺盐活化0.5～2小时，再按照改性透明质酸的四丁胺盐与phb的摩尔比(1：1)～(1：10)加入对羟基苯甲醛(phb)反应1～48小时，反应保持ph为5.6～7.2，除去溶剂干燥纯化得到醛基改性透明质酸(ii)。

如图1所示的，第一种方法得到的醛基改性透明质酸仅具有基团r1，第二种方法得到的醛基改性透明质酸具有基团r1和基团r2。

其中，醛基改性透明质酸的醛基取代度根据不同投料比和反应时间可以为10-70％。

活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的组合，或4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐。

二酰肼可以是己二酸二酰肼(adh)。

羟基苯甲醛(phb)还可以使用对羟基苯甲醛同分异构体及羟基苯甲醛衍生物替代，对羟基苯甲醛同分异构体及羟基苯甲醛衍生物可以是邻羟基苯甲醛、香草醛、丁香醛等。

酰肼衍生化透明质酸的制备

在透明质酸溶液(ha)中，按照ha与活化剂的摩尔比(1：1)～(1：10)加入活化剂活化后，搅拌0.5～6小时后再按照ha与联氨或二酰肼的摩尔比(1：1)～(1：50)加入过量联氨或二酰肼进行反应，反应时间为16～72小时，纯化干燥得到酰肼衍生化透明质酸。活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基丁二酰亚胺的组合，或4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐。酰肼基团酰肼衍生化透明质酸的酰肼基团接枝率通过投料比和反应条件的控制可以为10-80％

水凝胶复合物

如图1和图7所示，将醛基改性透明质酸和酰肼衍生化透明质酸溶于生理盐水后，分别无菌封装储存在密闭容器和注射器内，按照质量比为(5～1)：(1～5)混合后成胶。

实施例1

使用分子量10万～20万道尔顿的透明质酸钠于室温溶于水中，形成0.01g/ml的透明质酸溶液。加入阳离子交换树脂搅拌过夜，过滤得到透明质酸溶液(ha)。向100ml0.01g/ml的透明质酸溶液中，加入5ml0.5m的高碘酸钠溶液进行氧化，将体系置于暗处反应3小时。加入0.5ml乙二醇除去多余的高碘酸钠，继续搅拌1小时后，收取产物，用截留分子量3500道尔顿的透析袋透析三天，冻干得到醛基改性透明质酸(ha-a)。醛基基团的取代度为37％(如图2所示)。

实施例2

使用分子量10万～20万道尔顿的透明质酸钠于室温溶于水中，形成0.03g/ml的透明质酸溶液。加入阳离子交换树脂搅拌过夜，过滤得到透明质酸溶液(ha)。向100ml0.03g/ml的透明质酸溶液中，加入15ml5m的高碘酸钠溶液进行氧化，将体系置于暗处反应0.5小时。加入10ml乙二醇除去多余的高碘酸钠，继续搅拌1小时后，收取产物，用截留分子量3500道尔顿的透析袋透析三天，冻干得到醛基改性透明质酸(ha-a)。

实施例3

使用分子量100万～150万道尔顿的透明质酸钠于室温溶于水中，形成0.005g/ml的透明质酸溶液。加入阳离子交换树脂搅拌过夜，过滤得到透明质酸溶液(ha)。向200ml0.005g/ml的透明质酸溶液，加入10ml0.25m高锰酸钾溶液氧化，将体系置于暗处反应6小时。加入0.5ml乙二醇除去多余的高锰酸钾，继续搅拌1小时后，收取产物，用截留分子量8000道尔顿的透析袋透析三天，冻干得到醛基改性透明质酸(ha-a)。

实施例4

使用分子量150万～200万道尔顿的透明质酸钠于室温溶于水中，形成0.01g/ml的透明质酸溶液。加入阳离子交换树脂搅拌过夜，过滤得到透明质酸溶液(ha)。向100ml0.01g/ml的透明质酸溶液，加入5ml0.5m氯酸钾溶液氧化，将体系置于暗处反应3小时。加入0.5ml乙二醇除去多余的氯酸钾，继续搅拌1小时后，收取产物，用截留分子量8000道尔顿的透析袋透析三天，冻干得到醛基改性透明质酸(ha-a)。

将四丁基氢氧化铵(tba-oh)中和ha-a的水溶液至ph为7.4，干燥纯化后得到改性透明质酸的四丁胺盐；将改性透明质酸的四丁胺盐使用二甲基亚砜(dmso)溶解后，按照摩尔比1：10加入活化剂(edc和nhs)活化改性透明质酸的四丁胺盐活化0.5小时，再按照摩尔比1：10加入过量对羟基苯甲醛(phb)反应16小时，反应保持ph为7.2，除去溶剂干燥纯化得到醛基改性透明质酸。其中，醛基改性透明质酸的红外表征结果如图所示(如图3所示)。

实施例5

使用分子量10万～20万道尔顿的透明质酸钠于室温溶于水中，形成0.01g/ml的透明质酸溶液。向100ml0.01g/ml的透明质酸溶液中加入4.75gedc和2.85gnhs，调节ph至5.6，搅拌0.5小时后加入21.6gadh，搅拌16小时，透析三天，冻干得到ha-adh(酰肼衍生化透明质酸)。如图4和5所示，酰肼基团接枝率为72.5％。

实施例6

使用分子量10万～20万道尔顿的透明质酸钠于室温溶于水中，形成0.01g/ml的透明质酸溶液。向100ml0.01g/ml的透明质酸溶液中加入0.48gedc和0.29gnhs，调节ph至6.2，搅拌1小时后加入4.36gadh，搅拌48小时，透析三天，冻干得到ha-adh(酰肼衍生化透明质酸)。其中，酰肼基团接枝率为75％。

实施例7

使用分子量10万～20万道尔顿的透明质酸钠于室温溶于水中，形成0.01g/ml的透明质酸溶液。向100ml0.01g/ml的透明质酸溶液中加入0.01moldmtmm，调节ph至7.2，搅拌2小时后加入1.74gadh，室温下搅拌72小时，加入乙醇沉淀后并依次用乙醇溶液和无水乙醇清洗，干燥三天得到ha-adh(酰肼衍生化透明质酸)。其中，酰肼基团接枝率为68％。

实施例8

将实施例1的醛基改性透明质酸溶液与实施例5的酰肼衍生化透明质酸溶液按照质量比2：1于模具中混合后5分钟形成水凝胶。

实施例9

将实施例2的醛基改性透明质酸溶液与实施例5的酰肼衍生化透明质酸的溶液按照质量比3：1于模具中混合，3分钟形成水凝胶。

实施例10

将实施例1的醛基改性透明质酸溶液与实施例6的酰肼衍生化透明质酸的pbs溶液按照质量比1：1于模具中混合，1.5分钟形成水凝胶。

实施例11

将实施例1、5、9、11的水凝胶种下细胞，24小时后进行生物毒性mtt测试。如图6所示，与阳性对照相比实验组没有显著性差异，生物相容性良好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。