一种葡聚糖水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及一种葡聚糖水凝胶及其制备方法，尤其涉及一种ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶及其制备方法，属于生物医用功能高分子材料技术领域。

背景技术：

水凝胶（hydrogel）是一种通过物理或化学交联形成的具有三维网络结构的聚合物，在水溶液中能够溶胀并保持大量水分而又不能溶解。水凝胶具有较强吸收水分的能力，在许多技术领域被广泛应用，如蛋白质分离技术、隐形眼镜的制备、药物递送系统等。其中，水凝胶作为一类常用的药物载体，已成为联合化疗的有效辅助材料，其可通过改变药物进入人体的方式和在体内的分布，控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官。因此，水凝胶作为药物载体在药物递送系统中具有潜在的应用价值。

多糖类高分子是一种理想的水凝胶基质，其来源丰富，可从多种天然可再生资源中获得，由于其具有优越的生物相容性和生物粘附性，可以经修饰形成水凝胶结构作为药物载体应用。此类水凝胶具备生物毒性低、副作用小、生物降解性良好等特点，是制备药物释放系统的良好物质基础。

根据环境响应性刺激的不同，可将水凝胶分为ph响应型水凝胶、氧化还原响应型水凝胶、磁响应型水凝胶等，此类水凝胶在环境因素刺激作用下会发生结构、性能变化。刺激响应性水凝胶作为药物载体，因受环境刺激而表现出的行为在控制药物释放过程中起到关键作用。这种响应性使其在药物递送系统中有良好的应用价值，具有优化药物装载和释放、延长循环时间和校准靶向性等特点。在多种刺激响应型水凝胶研究中，基于人体中存在的ph梯度而进行的水凝胶型药物载体的设计和研究十分广泛。人体肿瘤组织相比于正常组织略偏酸性，因此，水凝胶作为药物载体可利用细胞内外ph值的不同来控制药物的释放情况。席夫碱结构在中性及碱性环境中具有良好的稳定性，而在酸性条件下容易发生水解断裂。由于正常的人体体液和血液环境略显碱性，肿瘤病变区域及细胞内溶酶体等结构具有偏酸性环境，因此，在水凝胶结构中引入席夫碱结构，使其可在人体正常环境下保持稳定而在酸性环境下发生降解，从而达到药物释放的目的。此外，癌变组织的外部微环境与正常的体内环境相比，癌变组织内具有较高浓度的谷胱甘肽（gsh），导致细胞内外形成较大的氧化还原电势差，这为含二硫键的水凝胶药物载体提供了在体内降解的良好环境。因此，二硫键的引入是使药物载体具备氧化还原响应特性的重要手段之一。具有ph及氧化还原双重响应性的水凝胶作为药物载体可以实现药物的多重刺激响应释放，特别是在肿瘤组织微环境刺激响应性释放领域得到了广泛关注。然而，目前主要采用多步法制备ph／氧化还原双重响应性水凝胶，反应过程及条件相对较复杂。

技术实现要素：

针对ph／氧化还原双重响应性水凝胶作为药物载体应用的优势及其现有制备方法中存在的问题，本发明提供了一种以同时含有氨基和二硫键的小分子（胱胺二盐酸盐）作为交联剂，一步法制备分子结构中同时含有席夫碱及二硫键的葡聚糖水凝胶材料的方法。因席夫碱键及二硫键分别在酸性及还原性条件下容易降解，因此，该葡聚糖水凝胶具有ph／氧化还原双重响应性能。本发明具有反应条件温和、操作简单、易于实施等特点。

本发明通过以下技术方案实现：

一种ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶的制备方法，具体操作步骤如下：

（1）醛基化葡聚糖的制备：

室温下将葡聚糖溶解于去离子水中，加热至澄清透明，得到葡聚糖水溶液；冷却至室温后按照糖单元／io4^-摩尔比为2:1-1:2向葡聚糖水溶液中加入高碘酸钠，室温、避光条件下搅拌2-6h，将所得溶液透析3-5天，透析时每3-5h换一次水，透析完成后冷冻干燥，得到醛基化葡聚糖固体；

（2）ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶的制备：

将步骤（1）得到的醛基化葡聚糖固体溶于去离子水中，配制浓度为50-200mg/ml的醛基化葡聚糖溶液。室温下，向其中加入交联剂，调节溶液ph至8.0-10.0，混合均匀后得到具有ph／氧化还原双重响应性的葡聚糖水凝胶。

步骤（1）中的葡聚糖为分子量10000~70000g/mol的葡聚糖中的任一种。

步骤（2）中的交联剂为分子结构中同时带有氨基和二硫键的化合物，优选为胱胺二盐酸盐。交联剂加入量按照醛基化葡聚糖中醛基与交联剂中氨基的摩尔比为1:2~2:1加入。

反应过程示意如下：

本发明以同时带有氨基和二硫键的物质作为交联剂，通过氨基和醛基反应生成席夫碱结构对醛基化的葡聚糖进行交联，形成含有二硫键的水凝胶，使水凝胶具备ph／氧化还原双重响应性。

本发明的有益效果是：

1、本发明提出的水凝胶制备方法反应条件简单、温和、可一步获得结构中同时含有席夫碱及二硫键结构的多糖水凝胶；

2、本发明制得的葡聚糖水凝胶具备ph／氧化还原双重响应性，可作为刺激响应型载体材料应用于生物医学领域。

附图说明

图1是实施例1步骤（1）制得的醛基化葡聚糖的红外光谱图；

图2是实施例1制得的ph／氧化还原双重响应性葡聚糖水凝胶的红外光谱图；

图3是实施例1制得的ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶冷冻干燥样品的扫描电镜图；

图4是实施例2制得的ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶实物照片；

图5是实施例3步骤（3）水凝胶在还原性条件下发生降解后冷冻干燥样品的扫描电镜图；

图6是实施例3步骤（4）水凝胶在酸性条下发生降解后冷冻干燥样品的扫描电镜图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

（1）醛基化葡聚糖的制备：

室温下将5g葡聚糖（分子量为10000g/mol）溶解在50ml去离子水中，油浴加热20min至澄清透明，得到葡聚糖水溶液，冷却至室温后加入高碘酸钠获得混合溶液，混合溶液中糖单元与高碘酸钠中io4^-的摩尔比为1:2，室温、避光条件下搅拌2h，将所得溶液透析3天，透析时每3h换一次水，透析完成后冷冻干燥，得到醛基化程度约为50%（即每100个糖单元中有50个被氧化）的醛基化葡聚糖固体；其红外谱图如图1所示，图中1729.84cm^-1处为醛基中c=o的伸缩振动吸收峰；

（2）ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶的制备：

将步骤（1）得到的醛基化葡聚糖固体0.05g溶于1.0ml去离子水中，制得浓度为50mg/ml的醛基化葡聚糖溶液。室温下，向其中加入浓度为1g/ml的胱胺二盐酸盐水溶液60μl（醛基／氨基摩尔比约为0.5），并向获得的混合液中加入20μlnaoh溶液（0.5g/ml）调节溶液ph值至8.0，混合均匀5min，制得ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶。

将获得的葡聚糖水凝胶冷冻干燥得到淡黄色固体，其红外光谱图如图2所示，与醛基化葡聚糖的红外谱图图1对比可见：水凝胶醛基中的c=o伸缩振动吸收峰基本消失，说明醛基化葡聚糖中的醛基已与胱胺二盐酸盐中的氨基反应消耗；采用扫描电子显微镜对冷冻干燥的葡聚糖水凝胶的微观结构进行表征，如图3所示，sem图像可见该水凝胶材料微观结构上具有多孔海绵状结构。

实施例2

（1）醛基化葡聚糖的制备：

室温下将5g葡聚糖（分子量为20000g/mol）溶解在50ml去离子水中，加热20min至澄清透明，得到葡聚糖水溶液，冷却至室温后加入高碘酸钠获得混合溶液，混合溶液中糖单元与高碘酸钠中io4^-的摩尔比为1:1，室温、避光条件下搅拌4h，将所得溶液透析4天，透析时每4h换一次水，透析完成后冷冻干燥，得到醛基化程度约为60%的醛基化葡聚糖固体；

（2）ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶的制备：

将步骤（1）得到的醛基化葡聚糖固体0.075g溶于1.0ml去离子水中，制得浓度为75mg/ml的醛基化葡聚糖溶液。室温下，向其中加入浓度为1g/ml的胱胺二盐酸盐水溶液60μl（醛基／氨基摩尔比约为0.86），并向获得的混合液中加入25μlnaoh溶液（0.5g/ml）调节溶液ph值至8.5，混合均匀5min后溶液完全失去流动性制得ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶，如图4所示。

实施例3

（1）醛基化葡聚糖的制备：

室温下将5g葡聚糖（分子量为40000g/mol）溶解在50ml去离子水中，加热20min至澄清透明，得到葡聚糖水溶液，冷却至室温后加入高碘酸钠获得混合溶液，混合溶液中糖单元与高碘酸钠中io4^-的摩尔比为1.5:1，室温、避光条件下搅拌6h，将所得溶液透析5天，透析时每5h换一次水，透析完成后冷冻干燥，得到醛基化程度约为70%的醛基化葡聚糖固体；

（2）ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶的制备：

将步骤（1）得到的醛基化葡聚糖固体0.1g溶于1.0ml去离子水中，制得浓度为100mg/ml的醛基化葡聚糖溶液。室温下，向其中加入浓度为1g/ml的胱胺二盐酸盐水溶液60μl（醛基／氨基摩尔比约为1.34），并向获得的混合液中加入35μlnaoh溶液（0.5g/ml）调节溶液ph值至9.0，混合均匀5min，制得ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶；

（3）还原性条件下的降解性能测试：

将制得的水凝胶置于浓度为10mm的gsh溶液中，置于恒温摇床（200rpm摇速，37℃）中振荡，12h后将降解后的葡聚糖水凝胶冷冻干燥得到淡黄色固体，并通过扫描电子显微镜观察其降解后的微观结构，如图5所示，从sem图像观察可知，与降解前的水凝胶微观结构相比，gsh溶液中降解12h后的水凝胶部分网络结构已出现断裂塌陷现象，表明该水凝胶材料在gsh溶液中发生了降解，可验证该水凝胶具有一定的氧化还原响应性；

（4）酸性条件下的降解性能测试：

将制得的水凝胶置于ph为5.0的磷酸盐缓冲溶液中，置于恒温摇床（200rpm摇速，37℃）中振荡，12h后将降解后的葡聚糖水凝胶冷冻干燥得到淡黄色固体，并通过扫描电子显微镜观察其降解后的微观结构，如图6所示，从sem图像观察可知，与降解前的水凝胶微观结构相比，ph5.0的磷酸盐缓冲溶液中降解12h后的水凝胶部分网络结构已出现断裂塌陷现象，说明该水凝胶材料在酸性环境中发生了降解，可验证该水凝胶具有一定的ph响应性。

实施例4

（1）醛基化葡聚糖的制备：

室温下将5g葡聚糖（分子量为70000g/mol）溶解在50ml去离子水中，加热20min至澄清透明，得到葡聚糖水溶液，冷却至室温后加入高碘酸钠获得混合溶液，混合溶液中糖单元与高碘酸钠中io4^-的摩尔比为2:1，室温、避光条件下搅拌6h，将所得溶液透析4天，透析时每3h换一次水，透析完成后冷冻干燥，得到醛基化程度约为80%的醛基化葡聚糖固体；

（2）ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶的制备：

将步骤（1）得到的醛基化葡聚糖固体0.15g溶于1.0ml去离子水中，制得浓度为150mg/ml的醛基化葡聚糖溶液。室温下，向其中加入浓度为1g/ml的胱胺二盐酸盐水溶液60μl（醛基／氨基摩尔比约为2.0），并向获得的混合液中加入45μlnaoh溶液（0.5g/ml）调节所得溶液ph值至10.0，混合均匀5min，制得ph／氧化还原双重响应型葡聚糖水凝胶；

（3）还原性条件下的降解性能测试：

将制得的水凝胶置于浓度为20mm的gsh溶液中，置于恒温摇床中振荡（200rpm摇速，37℃），12h后观察发现，gsh溶液颜色加深且由澄清变浑浊，溶液中有絮状物存在，表明部分水凝胶结构已发生降解；

（4）酸性条件下的降解性能测试：

将制得的水凝胶置于ph为3.0的磷酸盐缓冲溶液中，置于恒温摇床中振荡（200rpm摇速，37℃），12h后观察发现，磷酸盐缓冲溶液颜色加深且由澄清变浑浊，溶液中有絮状物存在，表明部分水凝胶结构已发生降解。