本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种棉花基因ghtom在植物耐盐胁迫方面的应用。
背景技术
在大部分农田中，土壤盐碱化严重影响植物生产。据统计，由于土地盐碱化造成的作物减产比其它胁迫因素高出50％以上，目前据统计超过6％的农业用地受到土壤盐碱化的影响。植物生长固着在土壤中，受到不断恶化的环境条件的严重影响。因此研究植物耐盐胁迫过程中的主效基因及其表达调控，具有重要的意义。已知具有一定耐盐水平的植物主要取决于其细胞膜的稳定性，以维持离子的选择性摄取和通过渗透作用吸收水分。盐胁迫导致植物的一系列反应，而极端盐浓度可能导致氧化损伤，离子毒害，营养失衡，最终导致植物死亡。棉花基因ghtom在植物中编码g蛋白偶联受体(g-proteincoupledreceptors，gpcr)。g蛋白偶联受体(g-proteincoupledreceptors，gpcr)具有重要意义，使植物能够检测各种内源和外源信号，调节植物发育和对各种反应的适应性。当植物处于盐胁迫激发因子环境下，可在短时间内引起植物细胞膜去极化，传递盐胁迫信号，引发植物自身代谢的动态调节。植物在代谢活动过程中以单线态氧(o21)，过氧化氢(h2o2)，羟基自由基(ho-)和超氧自由基(o2-)形式产生活性氧。植物中活性氧(ros)的产生和消除同步的，但是当植物暴露于盐胁迫环境时，同步机制系统关闭，产生过量的ros，导致合成一些重要的抗氧化剂，如超氧化物歧化酶(sod)，过氧化物酶(pod)，多酚氧化酶(ppo)，过氧化氢酶(cat)和丙二醛(mda)，这些对dna修复至关重要，以维持植物能够在胁迫环境中正常生长。由ros阈值的增加引起的损伤称为氧化应激，ros可导致各种细胞成分(如膜脂，蛋白质，核酸和叶绿素)的氧化损伤。氧化应激的影响已在棉花，水稻，小麦和豆类等植物中得到研究。ros引起叶绿素降解和膜脂质过氧化，降低膜流动性和选择性。叶绿素降解，脂质过氧化程度是由细胞内mda浓度水平决定的，mda是脂质过氧化作用的产物。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供了一种棉花基因ghtom在植物耐盐胁迫方面的应用，拓展基因ghtom的应用范围。
为了实现上述目的，本发明从棉花中克隆了基因ghtom(gh_a07g0747)，并构建重组载体，通过农杆菌介导，利用蘸花法浸染野生型拟南芥(col-0)，通过培育和筛选获得t3代转基因拟南芥纯合系，表现出耐盐胁迫能力显著提高。
本发明首先提供了ghtom在植物耐盐碱方面的应用，所述棉花基因的基因id为gh_a07g0747，该基因的cds全长为978bp，编码g蛋白偶联受体(g-proteincoupledreceptors，gpcr)，功能域为pf06454，分布于细胞膜，在非生物胁迫信号转导过程中起重要作用。
为了验证该基因在植物耐盐胁迫反应中的作用，有以下步骤：
步骤一，t3代转基因纯合系及野生型拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至1/2ms固体培养基，培养5天后移至分别含有浓度为0mm、150mm和200mmnacl的1/2ms固体培养基，统计根长，7天后对野生型和转基因株系的根长进行统计，计算根长伸长量；
步骤二，t3代转基因纯合系及野生型拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至1/2ms固体培养基，培养5天后移至分别含有浓度为0mm和250mmnacl的1/2ms培养基，4天后对野生型和转基因株系存活率进行统计；
步骤三，t3代转基因纯合系及野生型拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至1/2ms固体培养基，培养8天后移栽至营养土。3周后，使用浓度分别为0mm、150mm和250mm的nacl溶液处理8天，对野生型和转基因株系的叶绿素含量进行测定，并在处理后的第8天及第16天记录野生型和转基因株系的表型；
步骤四，t3代转基因纯合系及野生型拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至1/2ms固体培养基，培育8天后转移至营养土，生长3周，分别用浓度为0mm和250mm的nacl溶液处理8天，对野生型和转基因株系的抗氧化酶pod、cat和sod活性和氧化剂mda和h2o2含量进行测定。
步骤五，t3代转基因纯合系及野生型拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至1/2ms固体培养基，培育8天后转移至营养土，生长3周，分别用浓度为0mm和250mm的nacl溶液处理4天，取适量叶片，提取叶片rna，并反转录为cdna，通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)技术，测定已广泛研究的盐胁迫响应基因(atabf4，atsos2，atcbl1和atrd29a)的表达量变化。
进一步地，所述步骤一中，与盐胁迫下的野生型植株相比，转基因拟南芥表现出较长的根，根长的增加提高了植物对水分摄入量和水分传导能力。
进一步地，所述步骤二中，经250mmnacl处理，转基因株系的存活率显著高于野生型。
进一步地，所述步骤三中，经150mm和250mmnacl胁迫处理8天时，过表达的拟南芥株系叶绿素含量显著高于野生型植株。
进一步地，所述步骤四中，植物在盐胁迫处理8天后，与野生型相比，转基因株系中sod、cat和pod的活性显著提高，而氧化剂mda和h2o2含量较低。
进一步地，所述步骤五中，在盐胁迫条件下，这些盐响应基因在转基因植株中的表达水平显著高于野生型植株。
基于上述发现，本发明提供了棉花基因ghtom在培育耐盐胁迫转基因植物方面的应用。
更进一步地，所述转基因植物旨在将外源基因利用表达载体转化入植物稳定表达，获得耐盐胁迫的转基因株系。
所述外源基因为：
c)ghtom基因及其cds序列，
d)由ghtom基因或其cds序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的衍生核苷酸序列。
本发明利用高通量测序研究棉花耐盐碱的主效基因。从转录组水平，发现编码g蛋白偶联受体(g-proteincoupledreceptor，gpcr)的基因ghtom具有显著差异的表达水平。gpcr能够使植物检测到广泛的内源和外源信号，这些信号被植物用于调节发育和适应性中的各种反应，对植物抵御非生物逆境具有重要意义。我们进行了全基因组鉴定，分析并构建了gpcr功能基因成员ghtom(gh_a07g0747)的转基因纯合系。ghtom基因在盐胁迫下具有显著的调节作用，表明它是gpcr基因中一个重要的功能性成员。本发明通过转基因过表达方法获得的转ghtom基因的拟南芥纯合系对盐胁迫的耐受性显著提高，通过盐处理后表型变化、根长的比较、存活率统计、叶绿素含量测定、盐胁迫响应基因的表达分析、抗氧化酶活性和氧化剂含量测定多种验证。以上结果说明，ghtom在植物耐盐胁迫中扮演重要角色。
附图说明
图1是本发明实施例提供的棉花中的ghtom基因受300mmnacl诱导上调表达示意图；
图2是本发明实施例提供的pcr检测t0代拟南芥的ghtom的转化情况；m为marker2000，1-13为转化系，14为阳性对照(pwm101-ghtom)，15为阴性对照(wt)。
图3是本发明实施例提供的通过qrt-pcr分析t2代转基因系中ghtom的转录水平；
图4是本发明实施例提供的盐胁迫条件下野生型(wt)和ghtom转基因系(oe-3，oe-7和oe-9)比较分析。其中a、c为根长表型及数据统计，b、d为植株存活状况及存活率统计；
图5是本发明实施例提供的野生型(wt)和ghtom转基因系(oe-3，oe-7和oe-9)在盐胁迫响应下的表型及叶绿素含量统计；
图6是本发明实施例提供的盐胁迫下ghtom转基因系mda和h2o2的含量示意图；
图7是本发明实施例提供的野生型和ghtom转基因系中抗氧化酶活性示意图；
图8是本发明实施例提供的野生型和转基因系中盐胁迫响应基因的表达水平示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明从棉花中克隆了基因ghtom(gh_a07g0747)，并构建重组载体，通过农杆菌介导，利用蘸花法浸染野生型拟南芥(col-0)，通过培育和筛选获得t3代转基因拟南芥纯合系，表现出耐盐胁迫能力显著提高。农杆菌gv3101感受态细胞由上海唯地生物技术有限公司购入。
本发明首先提供了ghtom在植物耐盐碱方面的应用，所述棉花基因的基因id为gh_a07g0747，该基因的cds全长为978bp，编码g蛋白偶联受体(g-proteincoupledreceptors，gpcr)，功能域为pf06454，分布于细胞膜，在非生物胁迫信号转导过程中起重要作用。
为了验证该基因在植物耐盐胁迫反应中的作用，有以下步骤：
步骤一，t3代转基因纯合系及野生型拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至1/2ms固体培养基，培养5天后移至分别含有浓度为0mm、150mm和200mmnacl的1/2ms固体培养基，统计根长，7天后对野生型和转基因株系的根长进行统计，计算根长伸长量；
步骤二，t3代转基因纯合系及野生型拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至1/2ms固体培养基，培养5天后移至分别含有浓度为0mm和250mmnacl的1/2ms培养基，4天后对野生型和转基因株系存活率进行统计；
步骤三，t3代转基因纯合系及野生型拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至1/2ms固体培养基，培养8天后移栽至营养土。3周后，使用浓度分别为0mm、150mm和250mm的nacl溶液处理8天，对野生型和转基因株系的叶绿素含量进行测定，并在处理后的第8天及第16天记录野生型和转基因株系的表型；
步骤四，t3代转基因纯合系及野生型拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至1/2ms固体培养基，培育8天后转移至营养土，生长3周，分别用浓度为0mm和250mm的nacl溶液处理8天，对野生型和转基因株系的抗氧化酶pod、cat和sod活性和氧化剂mda和h2o2含量进行测定。
步骤五，t3代转基因纯合系及野生型拟南芥种子经消毒，4℃春化，播种至1/2ms固体培养基，培育8天后转移至营养土，生长3周，分别用浓度为0mm和250mm的nacl溶液处理4天，取适量叶片，提取叶片rna，并反转录为cdna，通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)技术，测定已广泛研究的盐胁迫响应基因(atabf4，atsos2，atcbl1和atrd29a)的表达量变化。
进一步地，所述步骤一中，与盐胁迫下的野生型植株相比，转基因拟南芥表现出较长的根，根长的增加提高了植物对水分摄入量和水分传导能力。
进一步地，所述步骤二中，经250mmnacl处理，转基因株系的存活率显著高于野生型。
进一步地，所述步骤三中，经150mm和250mmnacl胁迫处理8天时，过表达的拟南芥株系叶绿素含量显著高于野生型植株。
进一步地，所述步骤四中，植物在盐胁迫处理8天后，与野生型相比，转基因株系中sod、cat和pod的活性显著提高，而氧化剂mda和h2o2含量较低。
进一步地，所述步骤五中，在盐胁迫条件下，这些盐响应基因在转基因植株中的表达水平显著高于野生型植株。
基于上述发现，本发明提供了棉花基因ghtom在培育耐盐胁迫转基因植物方面的应用。
更进一步地，所述转基因植物旨在将外源基因利用表达载体转化入植物稳定表达，获得耐盐胁迫的转基因株系。
所述外源基因为：
e)ghtom基因及其cds序列，
由ghtom基因或其cds序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的衍生核苷酸序列。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1植物转化和过表达gh_a07g0747(ghtom)拟南芥筛选
通过特异性引物(f：cgggatccatgattaagtgttaccctttc；r：gctctagattaatttggacttgttcttg)，克隆目的基因gh_a07g0747(ghtom)，并构建pwm101-35s:gh_a07g0747(ghtom)重组载体，转化农杆菌gv3101感受态细胞，通过蘸花法侵染野生型拟南芥(col-0)。用于转化的渗透培养基包含ms4.3g/l，蔗糖50g/l(5％)，mes0.5g/l，silwet-77200μl/l(0.02％)，6-ba0.01mg/l，ph5.7。t0代转基因系在含有50mg/l潮霉素的1/2ms培养基进行阳性筛选，为最大限度地提高发芽率，首先在4℃条件下春化3天打破种子休眠，后将幼苗转移至光照培养箱，条件设定为22℃，16h光照/8h黑暗。选择培养基中培养一周后，当幼苗发育至3-4片子叶时，将幼苗移栽到以土壤为生长培养基的小盆中，幼苗(t0)生长到成熟，收获t1代种子。t1代种子在潮霉素选择培养基上发芽，通过检查选择培养基中幼苗存活与死亡的分离比(3:1)鉴定单拷贝系。然后t2代种子再次在潮霉素选择培养基上萌发，通过检查选择培养基中所有幼苗存活来鉴定单拷贝系。在t2代幼苗，通过qrt-pcr，对基因gh_a07g0747(ghtom)(f：tgcgaaagctttttcatcattgg；r：acttgtagacggggctggta)的表达株系进行筛选，得到三个高表达的纯合株系(oe-3，oe-7和oe-9)，t2代幼苗生长成熟后，收获t3代种子，进行表型调查。
实施例2根伸长和存活率测定
检验转基因系(oe-3，oe-7和oe-9)的盐胁迫耐受性，首先在1/2ms培养基上生长5天，然后分别转移到含0mm，150mm和200mmnacl的1/2ms培养基上垂直生长6天，在第7天记录根长伸长。测定转基因系和野生型拟南芥在盐胁迫下的存活率，野生型和转基因株系种子在1/2ms培养基上生长5天，然后转移至含有0mm和250mmnacl的1/2ms培养基上，4天后测定幼苗的存活率。
实施例3过表达gh_a07g0747(ghtom)拟南芥对盐胁迫耐受性的响应和叶绿素含量测定
t3纯合转基因系用10％漂白剂溶液(v/v)灭菌10min并用无菌水洗涤3次。然后将灭菌的种子铺在1/2ms培养基上，在4℃下在春化3天，移至22℃，16h光照/8h黑暗的光周期生长室。8天后，将幼苗移栽到含有营养土的小盆中，其中蛭石与腐殖质的混合比例为1:1。生长3周后，用分别含有0mm，150mm和250mmnacl的水溶液每四天浇灌一次。8天后进行叶绿素含量测定，在16天时观察表型性状。
从处理和对照组样品中获得200mg的叶片，在液氮中速冻，然后置于5ml乙醇(99.9％)中，并在80℃的水浴加热20min。使用合适的消光系数，检测总叶绿素含量。叶绿素含量(mg/g鲜重)为100×a654/(39.8×样品鲜重)。
实施例4过氧化氢酶(cat)、超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)提取和测定
从野生型及过表达拟南芥的处理组和对照组中，收获0.5g新鲜叶样品并速冻于液氮中，-80℃保存备用。每个样品用含有50mm磷酸钾缓冲液和0.1mmna2edta(ph7.6)的5ml提取缓冲液涡旋。混合物以15000rpm离心15min，上清液用于分析各种酶。制备酶提取物的所有步骤均在4℃下进行。通过监测h2o2的下降水平来确定cat活性。
从盐处理和对照组拟南芥植株获得三组重复叶片样品，每个样品1g，收集后在液氮中冷冻。将样品在含有50mmhepes和0.1mmna2edta(ph7.6)的10ml缓冲液的研钵中研磨2min。将匀浆在4℃以10000rpm离心20min，上清液用于sod分析，通过监测硝基蓝四唑(nitrobluetetrazolium，nbt)光化学还原的抑制来测定sod活性。为测定总sod，制备5ml反应混合物，其包含50mmhepes(ph7.6)，0.1mmedta，50mmna2co3(ph10.4)，13mmmet，0.025％(w/v)tritonx-100，75μmnbt，2μmvb2和等量的酶提取物，在350μmol/m2/s的光照强度下照射10min。在对照反应中，除了用等体积的磷酸盐缓冲液(ph7.8)代替粗酶之外，所有步骤和组分与上述相同。在560nm，以抑制50％nbt光化学还原所需的酶量，作为sod的酶活性单位。
实施例5拟南芥rna提取，盐响应基因qrt-pcr分析
为分析转基因拟南芥中盐响应基因的表达，3周大的野生型(col-0)和转基因拟南芥在空白对照(ck)和250mmnacl下生长4天，取叶片样品，使用rna试剂盒(easyspinplusplantrnakit，aidlab)提取样品总rna。利用琼脂糖凝胶电泳和nanodrop2000分光光度计测定每个rna样品的质量和浓度，符合标准(260/280：1.9-2.2)的rna样品储存在-80℃。将提取的rna反转录成cdna，然后作为模板用于pcr分析。使用荧光染料(fastastartuniversalsybr-greenmaster，rox，roche)，以拟南芥atactin2(f：ttgtgctggattctggtgatgg；r：ccgctctgctgttgtggtg)作为内参基因，通过盐响应基因的特异性引物，进行qrt-pcr分析。qrt-pcr反应体系：反应混合物总体积为20μl，其中含有10μlsybr荧光染料，2μlcdna模板，6μlddh2o2和2μl引物(上下游引物各1μl)。pcr反应程序为：95℃10min；循环阶段：95℃5s，60℃30s和72℃30s，40个循环；溶解曲线阶段：95℃15s，60℃1min，95℃30s和60℃15s。采用
本发明比较了野生型拟南芥(wt)及过表达ghtom转基因拟南芥对盐胁迫的耐性，比较盐处理后第16天的植株，结果显示盐胁迫下野生型拟南芥表现出明显的叶片失绿，生长发育受阻，而过表达的转基因系显示出更好的生长态势，表明该基因对植物耐盐性起到了显著的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。