一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcS52及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抑制白斑综合症病毒(wssv)的短肽lvhcs52及其编码基因与应用。

背景技术

对虾白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus，wssv)是对虾养殖业中危害最大的一种病毒，该病毒传染力强、致死率高，对虾感染wssv后，7-10天死亡率可达100％，在过去二十多年来给全球范围内对虾养殖业造成了巨大的经济损失。至今仍未得到完全控制，成为对虾养殖业发展的主要障碍之一。

目前，对虾生产上均采用养殖抗病能力强的种类及切断wssv传播途径等方法防止wssv病害的传播。同时，多年来国内外许多学者试图通过增强对虾体质，提高抗病能力等对对虾wssv进行防治。有研究表明，一些富含多糖、生物碱、有机酸等多种成分的天然免疫物质给虾口服或注射后，既有抗菌作用，又有免疫刺激作用，它们能增强虾类机体的细胞免疫和体液免疫的功能，提高对虾的抗病力。

因此，通过寻找具有抑制wssv增殖的活性物质，添加到饲料中增强对虾体质，提高抗病能力等，不失为一种可行的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗wssv肽lvhcs52，以解决现有技术存在的问题。

从凡纳滨对虾的血淋巴中，通过大量的实验，最终获得了一种能够抑制wssv增殖的多肽lvhcs52，由55个氨基酸组成，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

本发明还提供一种上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗wssv肽lvhcs52的编码基因，如seqidno：2所示。

本发明还提供一种含上述编码基因的表达盒。

本发明还提供一种含上述编码基因的重组菌。

本发明还提供一种含上述编码基因的重组载体。

本发明还提供含上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗wssv肽lvhcs52、上述编码基因或上述重组载体制备抑制wssv的制剂中的用途。

本发明还提供一种用于抗wssv的制剂，包含上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗wssv肽lvhcs52、上述编码基因、上述重组载体中的一种或者多种混合。

一种含有上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗wssv肽lvhcs52的饲料添加剂。

一种含有上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗wssv肽lvhcs52的饲料。

本发明的抗wssv短肽lvhcs52可以采用本领域技术人员已知的方法合成，例如固相合成，并采用本领域技术人员已知的方法进行原核表达和纯化。

与现有技术相比，本发明对自然界生物内的多种天然多肽进行特异性选择，通过大量的实验，获得了一种能够抑制wssv增殖的约5.8kda，来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的肽段lvhcs52，并可用化学法合成。根据lvhcs52的氨基酸序列相对应的核苷酸，设计引物，克隆得到lvhcs52的核苷酸组成，并构建到原核表达载体中，转化到大肠杆菌中，通过诱导表达并纯化得到重组的lvhcs52。并在体内和体外原代培养的血细胞中验证lvhcs52的活性，结果表明该肽段不管在动物水平还是在体外细胞水平，均能显著抑制wssv极早期基因wsv069和晚期基因wsv421的转录，同时在体内还能显著抑制wssv的增殖。通过进一步的实验研究，发现lvhcs52能激活对虾血细胞内的stat信号通路，引发该信号通路下游抗菌肽的转录从而发挥抗wssv的功能。本发明的抗wssv短肽可以作为添加剂添加到饲料中，以期提高对虾的抗wssv能力。

附图说明

图1为本发明抑制wssv的短肽lvhcs52的高效液相色谱图；

图2为本发明抑制wssv的短肽lvhcs52的质谱图；

图3为本发明抑制wssv的lvhcs52短肽和对照gst的sds-page图；

图4为本发明抑制wssv的短肽lvhcs52在动物体内水平的wssv极早期基因wsv069基因的转录变化情况；

图5为本发明抑制wssv的短肽lvhcs52在动物体内水平的wssv晚期基因wsv421基因的转录变化情况；

图6为本发明抑制wssv的短肽lvhcs52在动物体内水平的wssvcopy数的变化情况；

图7为本发明抑制wssv的短肽lvhcs52在体外细胞水平的wssv极早期基因wsv069基因的转录变化情况；

图8为本发明抑制wssv的短肽lvhcs52在体外细胞水平的wsv421基因的转录变化情况；

图9为本发明抑制wssv的短肽lvhcs52在体外细胞水平验证stat信号通路stat基因的转录变化情况；

图10为本发明抑制wssv的短肽lvhcs52在体外细胞水平验证stat信号通路alf1基因的转录变化情况；

图11为本发明抑制wssv的短肽lvhcs52在体外细胞水平验证stat信号通路alf3基因的转录变化情况。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法

实施例1：抑制wssv的短肽lvhcs52的固相合成、切割、纯化及鉴定

先从凡纳滨对虾的血淋巴中，通过大量的实验，最终获得了一种能够抑制wssv增殖的多肽lvhcs52，再利用多肽合成仪采用固相合成法合成所述抑制wssv的短肽，具体固相合成方法如下：

(1)以dmf为溶剂，各种α-氨基被fmoc保护的氨基酸溶液的浓度为0.25m，hbtu溶液、hobt溶液的浓度为0.33m，哌啶溶液的浓度为200ml/l，diea溶液的浓度为174.2ml/l。

(2)称取0.05mmolfmoc-ala-wang树脂(官能团含量0.33mmol/g)置于固相反应器中，加8mldcm溶胀过夜，减压抽去溶剂。加入浓度为200ml/l的哌啶溶液8ml，室温下反应5min，抽干；再加入浓度为200ml/l的哌啶溶液8ml，室温下反应20min，抽干；依次用8ml的dmf洗涤3次，每次1min。准确量取0.2mmol的α-氨基被fmoc保护的氨基酸溶液、0.2mmol的hbtu溶液、0.195mmol的hobt溶液加入固相反应器中，反应5min后加入0.4mmol的diea，室温下氮气气泡振荡反应2h。依次用8ml的dmf洗涤3次，每次1min。加入浓度为200ml/l的哌啶溶液8ml，室温下反应5min，抽干；再加入浓度为200ml/l的哌啶溶液8ml，室温下反应20min，抽干；依次以8ml的dmf洗涤3次，每次1min。按照如上步骤从肽链的碳端到氮端逐一连续合成了本发明的抑制wssv的短肽lvhcs52，lys-gly-gly-lys-thr-ser-ile-glu-arg-lys-ser-thr-glu-ser-ser-val-thr-val-pro-asp-val-pro-ser-ile-his-asp-leu-phe-ala-glu-ala-glu-ala-gly-gly-ala-gly-leu-ala-lys-phe-glu-ser-ala-thr-gly-leu-pro-asn-arg-phe-leu-leu-pro-lys。

(3)待合成完毕后，分别用dmf和dcm先后清洗连有多肽链的树脂，后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。

(4)抑制wssv的短肽的切割：

(a)待树脂干燥后，用刮刀将树脂尽量打散，转移至鸡心瓶中，加入磁子，在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的切割液10ml(切割液中tfa：纯水：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇比例为82.5:5:5:5:2.5)，冰水浴下反应2h。

(b)待反应完成，将反应液连同树脂一同转移至过滤器中，用水泵抽滤，将得到的滤液置于圆底烧瓶中，并在氮气流下吹干。

(c)待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气管，在圆底烧瓶中倒入约20ml的4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷冻离心机内，4℃下8000r/min离心15min，弃上清，再于20ml的4℃冰乙醚中打散，离心；如此重复操作3次，将沉淀再次真空干燥，即得抑制wssv的短肽的粗品。

(5)抑制wssv短肽的纯化及鉴定：

用反向高效液相色谱法对抗wssv肽进行纯化鉴定。采用c18半制备柱，流动相：a相(水相)：去离子水(含0.1％tfa(m/v))；b相(有机相)：80％乙腈水溶液(含0.1％tfa(m/v))；流速：6ml/min；洗脱梯度：a相以每分钟1％的变化从55％降到10％，b相以每分钟1％的变化从45％升到90％。

根据高效液相色谱图，见图1采集5.6-6min的洗脱液，采用旋转蒸发仪除去洗脱液中的有机相乙腈，之后将剩余的抗wssv肽水溶液放入冰箱冷冻成冰块，最后用冷冻干燥机除去水分，得到蓬松固体粉末，为抑制wssv的短肽纯品。图2为抑制wssv的短肽lvhcs52的质谱图。

实施例2：基因克隆与原核表达该与抑制wssv有关的对虾血蓝蛋白降解肽段

(1)根据多肽的n端和c端序列，定位至血蓝蛋白氨基酸序列中，结合核苷酸序列：aagggtggaaaaacttcaattgaacgcaagtccacggaatcttcagtaactgtaccggacgtgccaagcatacatgacctgtttgcagaagccgaggcaggcggcgctggccttgccaaattcgagagtgcaacaggcctaccaaacaggttccttctccccaag，设计pcr引物，用肝胰腺的cdna为模板进行pcr扩增。目的条带使用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(上海生工)回收纯化，方法参见试剂盒说明手册，并测浓度，用于下一步实验。

(2)纯化后的pcr产物和pgex-6p-1用限制性内切酶进行酶切，胶回收后测浓度，并用t4连接酶于16℃过夜酶连。连接产物转化大肠杆菌菌株rosetta中，并在含有100μg/ml氨苄青霉素(amp)的lb固体培养基上，于37℃倒置培养。

(3)挑取单菌落，于含100μg/mlamp的lb液体培养基37℃中培养。并进行菌液pcr验证，根据验证结果，部分送至华大科技测序验证序列的正确性。并依据测序结果，保留序列正确的菌种。在菌液中加入终浓度为15％的甘油，-20℃保存备用。

(4)将测序正确的菌株用于诱导表达。测序正确的菌株按1：100的比例加入液体lb培养基中(含amp100μg/ml)；37℃，200rpm摇床培养至od600到0.6左右时加入iptg，终浓度为0.5mm，同时取出1ml菌液作为未诱导对照；诱导4h后的菌液转移至离心管中，4℃，5000g离心20min，收集菌体；加入适量超声破碎缓冲液(含50mmtris，5mmedta，100mmnacl，ph8.0，现加1mmpmsf)重悬浮菌体；置于冰上超声破碎菌体；4℃，20000g离心30min，分别收集上清和沉淀；进行sds-page分析，验证是否有诱导表达。

(5)尽可能将目的片段表达于上清，利于下一步的纯化。

(6)采用gst柱材(geheathercare，us)纯化gst标签的血蓝蛋白降解肽段。

(7)采用prescissionprotease(gehealthcare，us)将gst标签去除，获得抗wssv的血蓝蛋白降解肽段lvhcs52。

(8)按照上述步骤将转化了pgex-6p-1质粒的大肠杆菌bl21菌株进行诱导表达，用gst柱材纯化gst标签蛋白，采用10mm的还原性谷胱甘肽将gst从柱材上特异性洗脱下来，用于下一步实验。

图3的sds-page结果表明，得到重组表达的gst(rgst)和lvhcs52(rlvhcs52)。

实施例3：抑制wssv短肽的动物体内水平活性验证

(1)将重组表达的短肽用灭菌的0.01mpbs(ph7.4)稀释至10μm(阴性对照为重组表达的gst)，加入10²copy/μl的wssv，阳性对照为0.01mpbs(ph7.4)稀释的10²copy/μlwssv，均于室温中孵育2h。

(2)用无菌的1ml注射器取100μl混合溶液从对虾第3腹节进行肌肉注射。

(3)于0、2、6、12和24hpi取对虾全血细胞，分别用海洋动物组织基因组dna提取试剂盒(tiangen生化)和总rna抽提试剂盒(上海飞捷生物有限公司)提取对虾基因组dna和总rna。

(4)用反转录试剂盒(全式金生物科技有限公司)将mrna反转录成cdna，并根据模板浓度稀释5-10倍；用无菌水将基因组dna浓度调成一致。

(5)wssvcopy数的计算。以基因组dna为模板，wsv421的qpcr引物检测对虾血细胞基因组dna中的wssvcopy数。

(6)wssv极早期基因wsv069和晚期基因wsv421转录水平的qpcr检测。用wsv069、wsv421和内参基因ef-1α进行qpcr分析，检测其转录情况。

图4-图6为lvhcs52在动物体内水平的抗wssv活性验证，图4为wsv069基因的转录变化情况；图5为wsv421基因的转录变化情况；图6为wssvcopy数的变化情况。可以得出，与对照相比lvhcs52在wssv感染后2h显著提高wsv069的转录，在12h显著抑制wsv069的转录，同时在6h和12h显著抑制wsv421的转录，同时可以显著的抑制wssv的增殖。

实施例4：抑制wssv短肽的体外细胞水平活性验证

(1)用抗凝剂(ph6.0)收集对虾全血细胞，并用昆虫培养基insertxpress稀释，细胞计数后，细胞培养板中的每个孔接种10⁶个全血细胞，待细胞贴壁后更换含3％双抗的培养基，于27℃细胞培养箱中培养24h。

(2)将化学固相合成的短肽用昆虫培养基稀释至10μμ[阴性对照为化学固相合成的绿色荧光蛋白(gfp)片段]，加入10⁶copy的wssv，阳性对照为昆虫培养基稀释的10⁶copywssv，均于27℃细胞培养箱中孵育2h。

(3)将细胞培养板取出，小心吸出培养基，用0.01mpbs(ph7.4)洗细胞三次，每孔加入含有10μμ短肽和10⁶copywssv的培养基混合液处理细胞。

(4)于处理后的0、2、6和12h用总rna抽提试剂盒(上海飞捷生物有限公司)提取细胞的总rna，再用反转录试剂盒(全式金生物科技有限公司)将mrna反转录成cdna，并根据模板浓度稀释5-10倍。

(5)wssv极早期基因wsv069和晚期基因wsv421转录水平的qpcr检测。

图7-8为lvhcs52在体外细胞水平的抗wssv活性验证，图7为wsv069基因的转录变化情况；图8为wsv421基因的转录变化情况。结果表明，与对照相比lvhcs52在wssv感染体外原代培养的血细胞2h后可显著提高wsv069的转录，在12h显著抑制wsv069的转录，同时在6h和12h显著抑制wsv421的转录，与体内动物水平的结果相似。

实施例5：抑制wssv短肽激活stat信号通路，引发下游抗菌肽基因的表达

(1)按实施例4进行对虾血细胞的原代培养，处理细胞时只用含10μμ短肽的培养基，对照为合成的gfp肽段和溶解多肽的h2o。

(2)按上述实施例，于0、2、6和12h提取细胞总rna并进行cdna的反转录，将浓度调成一致。

(3)利用qpcr技术检测stat信号通路相关重要基因以及下游抗菌肽基因的转录变化情况。

图9-11为lvhcs52在体外细胞水平验证stat信号通路相关基因的转录变化情况，图9为stat基因的转录情况；图10为alf1基因的转录变化情况；图11为alf3基因的转录变化情况。结果表明，与对照相比lvhcs52能显著提高stat基因的转录；同时在多肽处理细胞2和6h后，其可以显著抑制下游抗菌肽基因alf1和alf3的转录，而在12h显著提高这两个抗菌肽基因的转录。

sequencelisting

<110>汕头大学

<120>一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗wssv肽lvhcs52及其应用

<130>2018

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