本发明涉及免疫学、分子生物学和细胞生物学技术领域，具体地说，是一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的t细胞制备与扩增方法及其应用。
背景技术
恶性胸腔积液是指原发于胸膜或其他部位的恶性肿瘤转移至胸膜引起的胸腔积液，亦是恶性肿瘤常见且难于控制的晚期并发症，增长迅速，常伴有胸闷、气急、心悸等症状，治疗不及时可造成患者呼吸循环功能障碍、低蛋白血症、贫血，严重者甚至危及生命，影响患者的生存质量。而出现恶性胸腔积液常常表明肿瘤播散或已进展至晚期，肿瘤多已耐受放化疗、突变量大，患者生存期缩短。因此有效地控制胸腔积液、控制转移瘤及原发恶性肿瘤，延长肿瘤患者生存期、提高生存质量是目前晚期恶性肿瘤治疗的一大难题。
根据恶性胸腔积液诊治专家共识，恶性胸腔积液一经确诊，应尽早考虑姑息治疗。对患者症状、一般情况及预期生存时间全面评估后制定治疗方案，主要目的为减轻呼吸困难。较常见的方法包括临床观察、治疗性胸腔穿刺、肋间置管引流、胸膜固定术、胸腔镜手术治疗等。临床采用方法较多，但总体疗效有限，临床亟需新的治疗策略。
以往文献报道，将大剂量il-2胸腔内注射，可使癌性胸水减少，甚至消失，局部症状缓解。理论上主要是通过il-2激活lak细胞产生过继性免疫效果，lak细胞可杀伤肿瘤细胞，同时增强nk细胞活性，调节机体免疫功能，抑制肿瘤生长。虽然应用该方法治疗效果不一，且大剂量应用可能出现心肺毒性反应，患者耐受差，但却是早期通过提高人体自身免疫效应杀伤恶性肿瘤的方法。目前治疗恶性胸腔积液时，对于大量胸腔积液的患者进行胸腔穿刺闭式引流，而引流出的胸水则被作为医疗废物由专门医疗废物处理单位回收，同时这种方法为姑息性的治疗手段，多为缓解患者胸闷症状，暂时改善呼吸功能。
过继性细胞免疫治疗(adopitvecelltherapy，act)是肿瘤治疗的新方法，用于癌症治疗的act有目前主流三种形式，分别为肿瘤浸润淋巴细胞(til)、t细胞受体(tcr)和嵌合抗原受体(car-t)细胞疗法。与传统治疗方式不同，肿瘤免疫疗法是一种针对人体免疫系统而非直接针对肿瘤的疗法，通过激发或者调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。
肿瘤浸润淋巴细胞是脱离血流后进入到肿瘤中的白细胞，当存在大量肿瘤浸润淋巴细胞时，表面机体启动了对抗肿瘤的免疫反应。肿瘤浸润淋巴细胞对黑色素瘤患者进行过继细胞治疗取得了很好的效果。与之相比恶性胸水中的单核淋巴细胞并非传统意义上的til，但其与til相似都是经转移性肿瘤抗原呈递，能够识别肿瘤变异抗原位点，靶向性强。通过体外细胞毒性实验可验证pemc具备极高的肿瘤靶向性及杀伤能力。而pemc较til具备多种优势：(1)患者多为肿瘤晚期，无法耐受手术，难以取得肿瘤组织或转移性淋巴结，而转移性胸水的收集是为缓解患者症状而进行的引流，其本身并未对患者增加任何创伤负担；(2)患者生存期短，传统方法提取及扩增til周期较长，而通过分步离心法即刻得到pemc，可快速进行扩增，及时满足临床治疗需要量；(3)在突变复合转移瘤的胸水中提取的pemc较原位肿瘤中提取的til可能识别更多的肿瘤特异性抗原。因此pemc在治疗恶性肿瘤晚期肺转移伴恶性胸腔积液的患者较传统til具有更多的优势，同时也为晚期肿瘤患者提供了免疫治疗新方法。
肿瘤的过继性细胞免疫治疗在一些恶性肿瘤中取得了显著成效，尤其在血液系统肿瘤中，过继性t细胞治疗因其靶向性高、疗效显著等优势已成为一种有效的新型免疫治疗方法。但在实体瘤中的治疗进展缓慢，疗效不稳定。随着新技术的应用与突破，免疫治疗将成为恶性肿瘤治疗中不可或缺的一部分。
中国专利申请：cn103501816a公开了一种与t细胞相关的方法和组合物，其中使所述t细胞针对cd70重定向用于cd70阳性恶性肿瘤的免疫疗法。在该发明的多个方面，使用具有cd70特异性的t细胞。在具体方面，存在表达新分子的t细胞，所述t细胞包含与t-细胞受体复合物的ζ信号传导结构域融合的全长cd70受体(cd27)。这类t细胞识别cd70阳性肿瘤细胞并且具有针对cd70阳性癌细胞的溶细胞活性。但是关于本发明一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的t细胞制备与扩增方法及其应用目前还未见报道。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的t细胞制备及扩增方法。
本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的t细胞的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的t细胞制备及扩增方法，所述方法包括以下步骤：
(1)外周血单核细胞pbmc的制备；
(2)转移性胸水中单核细胞pemc的制备；
(3)原代肿瘤细胞的富集；
(4)目标pemc在经辐照异体pbmc联合高剂量il-2刺激下进行扩增。
作为本发明的一个优选实施方案，所述pbmc是由外周血中制得；pbmc的制备方法为：
(1)抗凝管采取外周静脉血，充分摇晃；
(2)外周血与pbs等体积充分混匀；
(3)将混合液体与淋巴细胞分离液按混合液体体积：淋巴细胞分离液体积＝4:3比例置于淋巴细胞分离液上层，离心法分离后取悬浮于中间的白膜层细胞；
(4)加入等体积pbs充分混匀，离心后去上清液；
(5)无血清细胞培养基重悬，离心后去上清，重复3次，沉淀即为所述pbmc。
作为本发明的一个优选实施方案，所述pemc是由恶性肿瘤肺转移患者转移性胸水中制得，pemc制备方法为：
(1)临床收集的胸腔引流液在无菌条件下通过40μm细胞滤网去除胸水中杂质，本发明所指标本来自骨与软组织恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的患者行胸腔闭式引流所引流出的组织液收集所得；
(2)按照步骤(1)的要求，从引流的胸腔组织液，无菌条件下分装于50ml离心管中，经300g离心5分钟后去上清，收集下层血性液体沉积；将收集得到的液体沉积与pbs体积比＝1:1等体积充分混匀，缓慢轻柔地移入ficoll分离液上层，450g离心30分钟，吸取中间白膜层。
(3)完成步骤(2)后，将上述制备得到的液体与pbs体积比＝1:1等体积充分混匀，1200rpm/min，离心5分钟，去上清液，用含有10％fbs的培养基重悬后，调节浓度至5×105/ml，每孔1ml置于24孔板中，每孔加入6000iu/mlil-2。
(4)在步骤(3)的基础上，将24孔板置于37℃，5％co2的培养箱中培养。
(5)在步骤(4)完成48小时后，轻轻吹起未贴壁细胞，与培养基一起移至新24孔板中。
(6)根据步骤(5)中pemc的生长情况，每隔1-3天进行半量换液，保持培养基il-2浓度6000iu/ml。
(7)待孔板内长满pemc，可收集各个长满孔中的胸腔积液中单核淋巴细胞。
作为本发明的一个优选实施方案，所述扩增pemc的方法为：
(1)准备扩增当天，取1×106/ml的上述制备的pemc加入10ml含10％fbs的培养基中，同时加入经过辐照的异体pbmc(feeder)，辐照剂量为40gy，pemc:feeder数量比＝1:20，il3000iu/ml。
(2)完成步骤(1)第4天，培养瓶内65％培养液更换为新的含10％fbs的培养基，并保持il-2浓度3000iu/ml。
(3)完成步骤(1)第5天，细胞计数，加入辐照过的异体pbmc(feeder)，pemc:feeder数量比＝1:20，总计50ml含10％fbs的培养基，保持il-2浓度3000iu/ml，加入t-75培养瓶，竖立悬浮培养。
(4)完成步骤(1)第8天，培养瓶内65％培养液更换为新的含10％fbs的培养基，并保持il-2浓度3000iu/ml。
(5)完成步骤(1)第9天，细胞计数，加入辐照过的异体pbmc(feeder)，pemc:feeder数量比＝1:20，总计100ml含10％fbs的培养基，保持il-2浓度3000iu/ml。
(6)完成步骤(1)第16天收集细胞，计数，并对扩增后的pemc进行原代肿瘤细胞毒性实验验证其杀伤性及靶向性。
作为本发明的一个优选实施方案，所述原代肿瘤的富集的具体方法为：
(1)临床收集的胸腔引流液在无菌条件下通过40μm细胞滤网去除胸水中杂质，本发明所指标本是骨与软组织恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的患者行胸腔闭式引流所引流出的组织液收集所得；
(2)按照步骤(1)的要求，从引流的胸腔组织液，无菌条件下分装于50ml离心管中，经300g离心5分钟后去上清，收集下层血性液体沉积；将收集到的液体沉积与pbs1:1等体积充分混匀，缓慢轻柔地移入应用ficoll分离液上层，450g离心30分钟，吸取中间白膜层。
(3)完成步骤(2)后，将上述制备得到的液体与pbs1:1等体积充分混匀，1200rpm/min，离心5分钟，去上清液，用含有10％fbs的培养基重悬后，调节浓度至5×105/ml，每孔1ml置于24孔板中。
(4)在步骤(3)的基础上，将24孔板置于37℃，5％co2的培养箱中培养；
(5)在步骤(4)完成48小时后，轻轻吹起未贴壁细胞，与培养基一起移至新24孔板中另培养，原孔中加入含10％fbs的高糖highglucosedmem培养基1ml。
(6)在步骤(5)的基础上，将24孔板置于37℃，5％co2的培养箱中培养；
(7)根据步骤(6)中贴壁细胞的生长情况，观察其与原发肿瘤形态一致及扩增速度24-48小时。
(8)根据步骤(7)孔中细胞长满后去培养基，500μl胰蛋白酶消化细胞，约2-5分钟，镜下观察细胞变圆，加入含10％的高糖dmem1500μl，收集细胞悬液后，1200rpm/min，离心5分钟，去上清液；加入pbs重悬，离心后去上层，重复3次。
(9)完成步骤(8)后加入含10％的高糖dmem，计数3×106细胞置入6cm培养皿中，共加入6ml上述培养基，置于37℃，5％co2的培养箱中培养。余下细胞可记录、冻存。
作为本发明的一个优选实施方案，所述细胞毒性试验的具体方法为：
(1)应用胰蛋白酶消化解离贴壁的原代肿瘤细胞，预置荧光剂，计数5×103/孔，置于96孔板中；
(2)将制备扩增完毕的pemc与原代肿瘤共培养，将pemc与原代肿瘤细胞按照效靶比为20:1、10:1、5:1、1:1的比例共培养，每组3个重复；
(3)培养4小时后置于分光光度计下计读数，计算pemc细胞毒性效率。
作为本发明的一个优选实施方案，所述恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液包括左股骨骨肉瘤肺转移伴左胸腔积液、右肱骨骨肉瘤肺转移伴右侧胸腔积液、骨盆骨肉瘤肺转移伴右侧胸腔积液。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述所述方法制备得到的pemc在制备治疗恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的药物中的应用。
作为本发明的一个优选实施方案，所述药物是一种以pemc为主要成分的免疫治疗性疫苗。
本发明优点在于：
1、本发明是利用被作为医疗废物的胸水，从中提取与具有识别并杀伤肺转移瘤肿瘤抗原的pemc，进一步增殖后用于肿瘤免疫治疗，不仅有望杀伤肺部转移瘤，因其识别原发肿瘤突变产生转移的新肿瘤抗原，能够对原发及循环系统中的肿瘤同样有杀伤效果，为晚期恶性肿瘤患者提供一种新的过继性细胞免疫治疗。
2、本发明通过体外细胞毒性实验已验证pemc具备极高的肿瘤靶向性及杀伤能力。pemc较til具备多种优势：(1)患者多为肿瘤晚期，无法耐受手术，难以取得肿瘤组织或转移性淋巴结，而转移性胸水的收集是为缓解患者症状而进行的引流，其本身并未对患者增加任何创伤负担；(2)患者生存期短，传统方法提取及扩增til周期较长，而通过分步离心法即刻得到pemc，可快速进行扩增，及时满足临床治疗需要量；(3)在突变复合转移瘤的胸水中提取的pemc较原位肿瘤中提取的til可能识别更多的肿瘤特异性抗原。
3、本发明所提供的pemc扩增方法效率更高、工艺相对便捷，扩增效率达到1000倍，并具备高强的细胞毒杀伤作用。
附图说明
附图1是不同转移性胸水患者每升胸水中分离得到的pemc数量。
附图2是不同转移性胸水患者pemc的扩增数量。
附图3是pemc攻击原代肿瘤的镜下表现(箭头；左图pemc：tumor＝10:1，右图pemc：tumor＝1:1)。
附图4是同一患者pemc对原代肿瘤的杀伤作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1pemc的获得、扩增、原代肿瘤细胞的获得
一、pemc的获得
所述的pemc的获得是指由肺转移患者恶性胸腔积液中经处理培养后从组织液中分离出来。
(1)临床收集的胸腔引流液在无菌条件下通过40μm细胞滤网去除胸水中杂质，本发明所指标本是骨与软组织恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的患者行胸腔闭式引流所引流出的组织液收集所得；
(2)按照步骤(1)的要求，从引流的胸腔组织液，无菌条件下分装于50ml离心管中，经300g离心5分钟后去上清，收集下层血性液体沉积；将收集得到的液体沉积与pbs体积比＝1:1等体积充分混匀，缓慢轻柔地移入ficoll分离液上层，450g离心30分钟，吸取中间白膜层。
(3)完成步骤(2)后，将上述制备得到的液体与pbs体积比＝1:1等体积充分混匀，1200rpm/min，离心5分钟，去上清液，用含有10％fbs的aim-v培养基重悬后，调节浓度至5×105/ml，每孔1ml置于24孔板中，每孔加入6000iu/mlil-2。
(4)在步骤(3)的基础上，将24孔板置于37℃，5％co2的培养箱中培养。
(5)在步骤(4)完成48小时后，轻轻吹起未贴壁细胞，与培养基一起移至新24孔板中。
(6)根据步骤(5)中pemc的生长情况，每膈1-3天进行半量换液，保持培养基il-2浓度6000iu/ml。
(7)待孔板内长满pemc，可收集各个长满孔中的胸腔积液中单核淋巴细胞。
二、pemc的扩增
(1)准备扩增当天，取1×106/ml的pemc加入10ml含10％fbs的aim-v培养基中，同时加入经过辐照的异体pbmc(feeder)，辐照剂量为40gy，pemc:feeder数量比＝1:20，il3000iu/ml。
(2)完成步骤(1)第4天，培养瓶内65％培养液更换为新的含10％fbs的aim-v培养基，并保持il-2浓度3000iu/ml。
(3)完成步骤(1)第5天，细胞计数，加入辐照过的异体pbmc(feeder)，pemc:feeder数量比＝1:20，总计50ml含10％fbs的aim-v培养基，保持il-2浓度3000iu/ml，加入t-75培养瓶，竖立悬浮培养。
(4)完成步骤(1)第8天，培养瓶内65％培养液更换为新的含10％fbs的aim-v培养基，并保持il-2浓度3000iu/ml。
(5)完成步骤(1)第9天，细胞计数，加入辐照过的异体pbmc(feeder)，pemc:feeder数量比＝1:20，总计100ml含10％fbs的aim-v培养基，保持il-2浓度3000iu/ml。
(6)完成步骤(1)第16天收集细胞，计数，并对扩增后的pemc进行原代肿瘤细胞毒性实验验证其杀伤性及靶向性。
三、原代肿瘤细胞的获得
(1)临床收集的胸腔引流液在无菌条件下通过40μm细胞滤网去除胸水中杂质，本发明所指标本是骨与软组织恶性肿瘤肺转移伴恶性胸腔积液的患者行胸腔闭式引流所引流出的组织液收集所得；
(2)按照步骤(1)的要求，从引流的胸腔组织液，无菌条件下分装于50ml离心管中，经300g离心5分钟后去上清，收集下层血性液体沉积；将收集得到的液体沉积与pbs1:1等体积充分混匀，缓慢轻柔地移入应用ficoll分离液上层，450g离心30分钟，吸取中间白膜层。
(3)完成步骤(2)后，将上述制备得到的液体与pbs1:1等体积充分混匀，1200rpm/min，离心5分钟，去上清液，用含有10％fbs的aim-v培养基重悬后，调节浓度至5×105/ml，每孔1ml置于24孔板中。
(4)在步骤(3)的基础上，将24孔板置于37℃，5％co2的培养箱中培养；
(5)在步骤(4)完成48小时后，轻轻吹起未贴壁细胞，与培养基一起移至新24孔板中另培养，原孔中加入含10％fbs的高糖highglucosedmem培养基1ml。
(6)在步骤(5)的基础上，将24孔板置于37℃，5％co2的培养箱中培养；
(7)根据步骤(6)中贴壁细胞的生长情况，观察其与原发肿瘤形态一致及扩增速度24-48小时。
(8)根据步骤(7)孔中细胞长满后去培养基，500μl胰蛋白酶消化细胞，约2-5分钟，镜下观察细胞变圆，加入含10％的高糖dmem1500μl，收集细胞悬液后，1200rpm/min，离心5分钟，去上清液；加入pbs重悬，离心后去上层，重复3次。
(9)完成步骤(8)后加入含10％的高糖dmem，计数3×106细胞置入6cm培养皿中，共加入6ml上述培养基，置于37℃，5％co2的培养箱中培养。余下细胞可记录、冻存。
四、细胞毒性试验
(1)将上述取得的原代肿瘤细胞经胰蛋白酶消化后，用培养基重悬、离心清洗，应用培养基调整细胞数量，使其达到1x106细胞/ml。
(2)根据步骤(1)的细胞悬液，将5μl的荧光增强配体加入2-4ml的细胞悬液中。置于37℃，5％co2的培养箱中培养30分钟。
(3)完成步骤(2)后，离心1200rpm/min，离心5分钟，去上清液，pbs重悬，重复3次。
(4)完成步骤(3)后，培养基重悬，调整细胞至5x104/ml，将100μl的原代肿瘤细胞(5000个细胞)装入一个v型底板。
(5)完成步骤(4)后，添加100μl的同源pemc细胞，按照不同的细胞浓度。pemc与原代肿瘤比值从1:1到20:1。
(6)完成步骤(5)后，置于37℃，5％co2的培养箱中培养4小时。取上层液5μl加入铕溶液，室温下孵育5分钟，测量荧光剂光度值。
(7)完成步骤(6)后，统计光度值计算pemc对肿瘤的细胞毒性作用。
实施例2pemc的效果评价
1资料
1.1一般资料
临床患者3例。第1例患者为19岁男性，诊断为左股骨骨肉瘤肺转移伴左胸腔积液(ennekingiii期)；第2例患者为23岁女性，诊断为右肱骨骨肉瘤肺转移伴右侧胸腔积液(ennekingiii期)；第3例患者为25岁男性，诊断为骨盆骨肉瘤肺转移伴右侧胸腔积液(ennekingiii期)。
1.2诊断标准
x线胸片上常表现为孤立性球形病灶，一般小于2cm，多为圆形，边缘较光整，密度较淡，无明显毛刺及分叶特征。
1.3纳入标准
(1)符合上述肺转移性肿瘤诊断标准；
(2)年龄在18-60岁之间，男女不限；
(3)受试者签署知情同意书。
1.4剔除标准：
不符合纳入标准而误纳入的病例；虽符合纳入标准而纳入后未曾用本研究方案治疗的病例；非疗效原因及不良反应而试验中途停止的脱落病例；加用其他药物者；资料不全不能统计者。
1.5终止和撤除临床试验标准：在试验中出现其他疾病，影响试验进行者；不可预见的其他情况。
2方法
第一例患者于住院期间行左侧胸腔闭式引流术，每日引流800ml淡血性液体；第二例患者住院期间行右侧胸腔闭式引流术，每日引流约400ml淡黄色液体；第三例患者住院期间行右侧胸腔闭式引流术，每日引流约800ml淡血性液体。每日引流液当天全部收集，通过细胞筛滤网过滤杂质，分装50ml离心管，1200rpm/min5分钟，离心后去上层清澈组织液，加入等体积pbs充分混匀，电动移液枪将收集的下层液体缓慢置于ficoll淋巴细胞分离液上，分离法提取中间白膜层单核细胞，离心后去上清，pbs重悬、离心3次。用含10％fbs的aim-v培养基重悬，对收集细胞计数，每升胸水中可提取约2.4-4.5×106，再调整细胞浓度至5×106/ml，每孔1ml置于24孔板中，准备进行扩增。
将从上述3例临床患者分离出的pemc，置于24孔板中，每孔中加入6000ui/mlil-2。将24孔板置入37℃5％co2细胞培养箱中进行培养。24-48小时后轻轻吹起未贴壁细胞，将上层培养基移至新的24孔板中，每天通过显微镜观察各个孔中pemc的生长情况。依据细胞增殖情况1-3天换液，待pemc长满细胞孔后收集各孔内的细胞。取正常人的外周血，离心后去上层血浆，与等体积pbs充分混匀，缓慢加入ficoll淋巴细胞分离液上，离心法分离提取中间白膜层，离心后，将提取的同种pbmc冻存备用，待扩增前进行x线辐照40gy。提取1×106/ml的pemc加入10ml含10％fbs的aim-v培养基中，同时加入经过辐照的pbmc(feeder)，辐照剂量为40gy，pemc：feeder数量比＝1:20，同时加入3000iu/mlil-2，重悬于t25培养瓶培养。培养第4天，培养瓶内65％培养液更换为新的含10％fbs的aim-v培养基，并保持il-2浓度3000iu/ml。第5天，细胞计数，同时加入辐照过的pbmc(feeder)，pemc：feeder数量比＝1:20，总计50ml含10％fbs的aim-v培养基，保持il-2浓度3000iu/ml，重悬于t75培养瓶培养。第8天，培养瓶内65％培养基更换为新的含10％fbs的aim-v培养基，保持il-2浓度3000iu/ml，第9天，细胞计数，加入辐照过的pbmc(feeder)，pemc：feeder数量比＝1:20，总计100ml含10％fbs的aim-v培养基，保持il-23000iu/ml，重悬于t175培养瓶。扩增约2周后收取pemc，计数统计，满足临床应用数量要求。
从3例临床患者的恶性胸水中通过贴壁分离，分离出原代转移瘤细胞。将经过ficoll分离液离心收集的白膜层，置于24孔板中，24-48小时后，轻轻吹起未贴壁细胞，与培养基一起移至新24孔板中另培养，原孔中加入含10％fbs的高糖highglucosedmem培养基1ml。24孔板置于37℃，5％co2的培养箱中培养，观察贴壁细胞的生长情况，观察其与原发肿瘤形态一致及扩增速度24-48小时。孔中细胞长满后去培养基，500μl胰蛋白酶消化细胞，约2-5分钟，镜下观察细胞变圆，加入含10％的高糖dmem1500μl，收集细胞悬液后，1200rpm/min，离心5分钟，去上清液；加入pbs重悬，离心后去上层，重复3次。加入含10％的高糖dmem，计数3×106细胞置入6cm培养皿中，共加入6ml上述培养基，置于37℃，5％co2的培养箱中培养。将取得的原代肿瘤细胞经胰蛋白酶消化后，用培养基重悬、离心清洗，应用培养基调整细胞数量，使其达到1x106细胞/ml。将5μl的荧光增强配体加入2-4ml的细胞悬液中。置于37℃，5％co2的培养箱中培养30分钟。离心1200rpm/min，离心5分钟，去上清液，pbs重悬，重复3次。培养基重悬，调整细胞至5x104/ml，将100μl的原代肿瘤细胞(5000个细胞)装入一个v型底板。添加100μl的同一患者pemc细胞，按照不同的细胞浓度。pemc与原代肿瘤比值从1:1到20:1。置于37℃，5％co2的培养箱中培养4小时。镜下观察pemc对原代肿瘤的杀伤作用，取板孔内上层液5μl加入铕溶液，室温下孵育5分钟，测量荧光剂光度值。计光度值计算pemc对肿瘤的细胞毒性作用。可见同一患者转移性胸水中的pemc对原代肿瘤具有很强的细胞毒性作用。
3结果
不同转移性胸水患者每升胸水中分离得到的pemc数量如图1所示，不同转移性胸水患者pemc的扩增数量如图2所示，pemc对原代肿瘤的杀伤作用结果如图3所示，从图中可以看到pemc对原代肿瘤具有很好的杀伤作用；pemc对肿瘤的细胞毒性检测结果如图4所示，结果表明同一患者转移性胸水中的pemc对原代肿瘤具有很强的细胞毒性作用。
4结论
以上实施例表明，通过本发明的方法制备得到的pemc可用于肿瘤免疫治疗，pemc扩增方法效率更高、工艺相对便捷，并具备高强的细胞毒杀伤作用。
本发明是利用被作为医疗废物的胸水，从中提取与具有识别并杀伤肺转移瘤肿瘤抗原的pemc，进一步增殖后用于肿瘤免疫治疗，不仅有望杀伤肺部转移瘤，因其识别原发肿瘤突变产生转移的新肿瘤抗原，能够对原发及循环系统中的肿瘤同样有杀伤效果，为晚期恶性肿瘤患者提供一种新的过继性细胞免疫治疗。
本发明通过体外细胞毒性实验已验证pemc具备极高的肿瘤靶向性及杀伤能力。pemc较til具备多种优势：(1)患者多为肿瘤晚期，无法耐受手术，难以取得肿瘤组织或转移性淋巴结，而转移性胸水的收集是为缓解患者症状而进行的引流，其本身并未对患者增加任何创伤负担；(2)患者生存期短，传统方法提取及扩增til周期较长，而通过分步离心法即刻得到pemc，可快速进行扩增，及时满足临床治疗需要量；(3)在突变复合转移瘤的胸水中提取的pemc较原位肿瘤中提取的til可能识别更多的肿瘤特异性抗原。
本发明所提供的pemc扩增方法效率更高、工艺相对便捷，扩增效率达到1000倍，并具备高强的细胞毒杀伤作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。