本发明属于基因工程领域，涉及一种mettl3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体。
背景技术
我国现在普遍采用集约型模式进行养猪生产，生猪在每个生长环节都会受到病原微生物的感染，容易造成仔猪肠道（屏障）功能损伤，导致养分消化吸收障碍，并往往伴随着抵抗力下降和较严重的腹泻。在主要养分中，又以作为主要能量物质的脂肪酸的吸收利用影响较大。针对这一现象，目前主要采取抗病育种和长期高剂量添加药物两方面的措施。由于抗病育种世代周期长和普及面小等问题难以大范围推广，因此目前普遍采用的措施是长期高剂量添加饲用抗生素和氧化锌，然而其存在的问题也是显而易见的：极易引发细菌耐药性、肉产品残留、扰乱动物肠道微生态区系平衡、环境污染。因此寻求解决这一问题的新方法迫在眉睫。
m6a甲基化的修饰主要位于mrna的腺苷a第六号氮原子上，是一种动态可逆的rna修饰，mettl3作为其甲基转移酶，通常和mettl14形成复合物，执行写入m6a的功能。有文章报道，mettl3所调控的rna甲基化水平变化参与到生物机体从基因的转录到蛋白质的翻译的整个过程，如敲除mettl3能够显著提高神经胶质瘤干细胞或类干细胞的增殖和自我更新(cuietal.,2017)；mettl3能够介导m6a依赖的cir-rna的翻译(yangetal.,2017)；mettl3能够通过与dna启动子区域相结合，调控基因转录，发挥着基因转录开关的作用(barbierietal.,2017)；敲除mettl3能够通过阻止炎症相关通路关键因子myd88的剪切，进而阻止炎症反应的发生(fengetal.,2018；江一舟等，2017)；同时有文章报道mettl3在成脂分化过程中能够通过促进细胞周期进而促进脂肪生成(batistaetal.,2014)。但是其在脂肪酸吸收转运过程中的作用，尚未报道。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种mettl3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体。
一种mettl3基因敲除的细胞系的构建方法，利用m6a甲基转移酶基因mettl3在通过基因编辑方法获得耐受lps刺激导致脂肪酸吸收障碍的猪肠道上皮细胞系。
所述的建立方法，包括以下步骤：
1）根据所述的m6a甲基转移酶基因mettl3设计shrna，
所述的mettl3序列如seqidno.1所示，所述的shrna序列如seqidno.2、seqidno.3所示；
2）针对m6a甲基转移酶基因mettl3shrna进行磷酸化；
3）将磷酸化的mettl3shrna连接到慢病毒表达载体获得mettl3shrna慢病毒表达载体；
4）以293a细胞作为受体，将步骤3）获得的mettl3shrna慢病毒表达载体进行慢病毒包被；
5）将步骤4）获得的mettl3shrna慢病毒侵染肠道上皮细胞，利用嘌呤霉素进行筛选，获得基因编辑敲除m6a甲基转移酶基因mettl3的肠道上皮细胞。
所述的mettl3shrna慢病毒表达载体的构建方法具体如下：对shrna慢病毒表达载体利用bbsi进行酶切，并进行胶回收获得线性载体；以步骤2）获得磷酸化的mettl3shrna，采用t4连接酶，连接到prsi9-u6慢病毒表达载体。
一种根据所述的建立方法得到的耐受lps刺激导致脂肪酸吸收障碍的猪肠道上皮细胞系。
一种针对猪源m6a甲基转移酶基因mettl3的基因干扰载体，
所述的干扰载体是将针对所述的m6a甲基转移酶基因mettl3设计shrna，插入到shrna慢病毒表达载体所得，用于敲除肠道上皮细胞内mettl3的表达。
本发明的有益效果为：
本发明公开了mettl3基因的一种新功能，参与调控肠道上皮细胞脂肪酸吸收转运，并提供了通过基因编辑手段改善lps刺激导致的脂肪酸吸收障碍的方法。mettl3能够调控肠道上皮细胞脂肪酸吸收为首次报道。转录水平和蛋白水平分析表明进行基因编辑的肠道上皮细胞mettl3表达量显著降低。脂肪酸吸收功能验证实验表明进行基因编辑的肠道上皮细胞能够耐受lps刺激导致的脂肪酸吸收障碍。本发明不仅为研究mettl3在脂肪酸吸收过程中的作用奠定基础，还利用基因编辑的方法改善了lps刺激导致的脂肪酸吸收障碍。
附图说明
图1为pcr鉴定mettl3shrna慢病毒表达载体琼脂糖凝胶电泳图（agarosegelelectrophoresis）；
图2为prsi9-u6慢病毒载体的示意图；
图3a为mettl3shrna慢病毒侵染上皮细胞之后mettl3的蛋白表达水平western-blot图；
图3b为基因编辑后的肠道上皮细胞mettl3的转录水平；数据平均值代表3个生物学重复，误差线表示标准误差(se)。显著性分析*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图4为激光共聚焦检测基因编辑肠道上皮细胞的脂肪酸吸收情况图。
图5为流式细胞法检测基因编辑肠道上皮细胞的脂肪酸吸收情况，左部分是不同处理组脂肪酸的吸收情况图，右部分是对左图的量化统计；数据平均值代表3个生物学重复。误差线表示标准误差(se)。显著性分析*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图6为紫外分光法检测基因编辑肠道上皮细胞的脂肪酸吸收情况；数据平均值代表3个生物学重复。误差线表示标准误差(se)。显著性分析*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图7为转入mettl3质粒对基因编辑敲除mettl3基因的肠道上皮细胞脂肪酸吸收的影响。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1mettl3shrna慢病毒表达载体的获得
本发明中的mettl3shrna是利用在线的shrna设计工具：http://www.broadinstitute.org/rnai/public/seq/search，根据所述的m6a甲基转移酶基因mettl3设计；其中，mettl3基因序列如如seqidno.１所示，shrna序列包括上游序列p1，下游序列p2，如下所示：
p1（上游序列）：accgggagatcctagaactattaaatctcgagatttaatagttctaggatctcttttttg（seqidno.2）；
p2（下游序列）:cgaacaaaaaagagatcctagaactattaaatctcgagatttaatagttctaggatctcc（seqidno.3）。
并利用t4polynucleotidekinase，37°c反应30分钟后，95°c反应2分钟，然后自然冷却至室温，对mettl3shrna进行磷酸化。
对shrna慢病毒表达载体利用bbsi进行酶切，并进行胶回收获得线性载体；以获得磷酸化的mettl3shrna，采用t4连接酶，室温孵育2小时，将其连接到prsi9-u6慢病毒表达载体上，通过热激法转化大肠杆菌dh5α菌株，提取质粒进行pcr鉴定，引物序列如下所示，
forward:5`-gagggcctatttcccatgattcc-3`（seqidno.4），
reverse:5`-acagtccgaaaccccaaacgcacgaa-3`（seqidno.5）。
反应条件为反应条件94℃预变性3min，94℃变性15s，56℃退火30s，72℃延伸2min，25个反应循环，获得阳性克隆，如图1所示，所挑克隆pcr产物均大于阴性对照组，表明mettl3的shrna确实插入到如图2所示的prsi9-u6慢病毒表达载体上。
实施例2mettl3shrna慢病毒的包被
将2μg实施例1中的方法获得的mettl3shrna慢病毒表达质粒，利用脂质体lipo2000，同时转入慢病毒元件0.25μgvsvg和1μgpspax；24小时后换成1.5ml完全培养基；48小时后收集病毒，获得mettl3shrna的慢病毒。
实施例3基因编辑肠道上皮细胞系的获得
将500μl实施例2中的方法获得的mettl3shrna慢病毒加入到肠道上皮细胞ipec-j2中，24小时后换成完全培养基，48小时后加入4μg/ml嘌呤霉素进行筛选，至通过荧光定量pcr及western-blot法验证获得基因编辑敲除mettl3基因的肠道上皮细胞。如图3a-3b所示，与空载体组相比，mettl3shrna慢病毒侵染组的肠道上皮细胞mettl3的表达水平显著降低。
实施例4 激光共聚焦法分析基因编辑肠道上皮细胞的脂肪酸吸收情况
用实施例3中的方法获得的基因编辑敲除mettl3基因的肠道上皮细胞，以正常细胞（scramble）作为对照，分别用100μg/ml脂多糖lps刺激0小时，3小时，6小时后；加入bodipy标记的脂肪酸，37℃孵育5min，激光共聚焦检测脂肪酸的吸收情况。结果表明基因编辑敲除mettl3基因的肠道上皮细胞对lps刺激导致的脂肪酸吸收障碍的耐受显著高于正常细胞，如图4所示，分别针对对照组和mettl3基因编辑后的肠道上皮细胞进行lps刺激处理，结果表明，对照组在lps刺激条件下，脂肪酸的吸收明显受阻，但是mettl3基因编辑后的肠道上皮细胞则表面出明显的耐受。
实施例5流式细胞分析法基因编辑肠道上皮细胞的脂肪酸吸收情况
用实施例3中的方法获得的基因编辑敲除mettl3基因的肠道上皮细胞，以正常细胞（scramble）作为对照，分别用100μg/ml脂多糖lps刺激0小时，3小时，6小时后；加入bodipy标记的脂肪酸，37℃孵育5min，流式细胞仪（波长488nm）检测脂肪酸的吸收情况。结果表明基因编辑敲除mettl3基因的肠道上皮细胞对lps刺激导致的脂肪酸吸收障碍的耐受显著高于正常细胞。如图5所示，分别针对对照组（scramble）和mettl3基因编辑后的肠道上皮细胞（shmettl3）进行lps刺激处理0小时，3小时，6小时。流式细胞法检测细胞荧光标记脂肪酸的吸收情况。
实施例6紫外分光法检测基因编辑肠道上皮细胞的脂肪酸吸收情况
分别将正常的和基因编辑的ipce-j2细胞种植明胶包被、96孔、黑色、透明底板，过夜培养后，用无fbs培养基对血清进行饥饿培养至少8小时，用1mg/mllps处理0小时、3小时、6小时，然后用磷酸盐缓冲盐水（pbs）进行短暂洗涤。同时在pbs中加入bodipyfa（分子探针γ-d3823）和无脂肪酸牛血清白蛋白（bsa）（2:1摩尔比）在37℃水浴中预孵育10分钟；加入细胞后在37℃下孵育5分钟，用加入0.5%bsa的pbs洗涤2次，每次2min，为了抑制细胞外荧光，加入0.4%台盼蓝（每孔50ul），并用紫外分光光度计立即测量细胞内荧光（激发488nm，发射515nm，cut-off495nm）。如图6所示，分别针对对照组（scramble）和mettl3基因编辑后的肠道上皮细胞（shmettl3）进行lps刺激处理0小时，3小时，6小时。紫外分光法检测细胞荧光标记脂肪酸的吸收情况。
实施例7转入mettl3质粒对基因编辑敲除mettl3基因的肠道上皮细胞脂肪酸吸收的影响
用实施例3中的方法获得的基因编辑敲除mettl3基因的肠道上皮细胞，用lipo2000分别转入pcdna3.1空质粒和mettl3质粒，24小时后，分别用100μg/ml脂多糖lps刺激0小时，3小时，6小时后；加入bodipy标记的脂肪酸，37℃孵育5min，流式细胞仪（波长488nm）检测脂肪酸的吸收情况。结果表明相比于空载体组，转入mettl3质粒组在lps刺激下脂肪酸吸收水平显著降低，表明确实是mettl3在耐受脂肪酸吸收障碍中发挥着重要作用。如图7所示，对基因编辑敲除mettl3基因的肠道上皮细胞转入pcdna3.1空质粒和mettl3质粒后，进行lps刺激处理0小时，3小时，6小时。激光共聚焦法检测细胞荧光标记脂肪酸的吸收情况。
序列表
<110>浙江大学
<120>mettl3基因敲除的细胞系及其构建方法与干扰载体
<141>2018-07-05
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2088
<212>dna
<213>猪(susscrofa)
<400>1
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<213>人工序列(artificialsequence)
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