本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种产chloroeremomycin的基因工程菌及其制备方法和应用。
背景技术
随着万古霉素的使用越来越频繁，万古霉素耐药菌也已出现，自20世纪80年代万古霉素耐药性肠球菌被首次报道以来，耐药菌呈现不断增长的趋势，在世界范围内已引起数次医院内爆发流行，而且许多万古霉素耐药性肠球菌还对其他抗生素(如β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素)耐药，因此迫切需要进一步研制和开发新的或者抗菌活性更强的抗生素。但是目前的现状是，许多已被发现的天然化合物重复被发现，新的天然化合物的发现受阻，而且，由于化合物结构的限制使得分离纯化方法有待提高，这些因素还会使前期的开发成本变得很高，使得投资人望而却步，现在以基因工程为基础的组合生物合成方法为此打开了一扇窗。
中国专利cn200910053906.9公开了一株基因工程菌cgmccno.3053，其为利用万古霉素合成途径将从amycolatopsisbalhimyceticusnrrlb-24207中钓取到的糖基转移酶基因通过接合转移的方法异源置换到万古霉素产生菌amycolatopsisorientalishccb10007中而获得，产生比万古霉素多一个万古糖胺的三糖化合物lyv07ww01。该化合物与chloroeremomycin结构类似。所述cgmccno.3053工程菌的起始来源的菌株的基因组已公开，genbank数据库登记号为cp003410.1，其中含有vca基因，该基因包含万古糖胺生物合成相关的四个基因，分别编码ndp-己糖2,3-脱水酶(aori_1498)、c-4-酮基还原酶(aori_1499)、c-3-氨基转移酶(aori_1500)及差向异构酶(aori_1501)。
chloroeremomycin(结构式如图1所示)，又叫ly264826，a82846b或者chloroorienticina，是美国礼来公司于1987年发现的一种重要的糖肽类抗生素，文献报导chloroeremomycin具有抗mrsa、耐万古霉素肠球菌的活性，目前该化合物作为起始原料用于生产抗感染新药奥利万星。chloroeremomycin的产生菌为东方拟无枝酸菌a.orientalisnrrl18098，其基因组genbank登记号为aj223998.1，其中含有eva基因，该基因包含表万古糖胺生物合成相关的四个基因，分别编码ndp-己糖2,3-脱水酶(cds15)、c-4-酮基还原酶(cds16)、c-3-氨基转移酶(cds17)及差向异构酶(cds18)。该菌生长周期长，种子培养需要48小时，且chloroeremomycin的产量低，发酵260h后，chloroeremomycin的产量为100～150mg/l(us5843437a、cn104805161a)。
因此，亟待开发更多有价值的chloroeremomycin衍生抗生素，以大幅提高chloroeremomycin的产量。
技术实现要素：
本申请的发明人采用基因工程方法，在对cgmccno.3053进行基因工程改造以构建产chloroeremomycin的基因工程菌中发现，以cgmccno.3053为出发菌株，对其中的vca基因进行敲除，并插入eva基因，可以构建一种能大幅提高chloroeremomycin产量、缩短发酵时间的基因工程菌，从而解决了现有的东方拟无枝酸菌nrrl18098发酵时间长、产量低的问题。
因此，本发明的第一个目的在于，提供一种产chloroeremomycin的基因工程菌。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种产chloroeremomycin的基因工程菌，其特征在于，所述产chloroeremomycin的基因工程菌是将菌株cgmccno.3053的vca基因敲除，并导入eva基因构建获得。
根据本发明，所述eva基因来源于菌株a.orientalis。
本发明的第二个目的在于，提供一种如上述所述的产chloroeremomycin的基因工程菌用于发酵生产chloroeremomycin的应用。
本发明的第三个目的在于，提供一种chloroeremomycin的生产方法，通过发酵生产上述所述的产chloroeremomycin的基因工程菌获得chloroeremomycin。
本发明的第四个目的在于，提供所述构建方法是以cgmccno.3053为出发菌株，将菌株cgmccno.3053的vca基因敲除，并导入eva基因，构建获得所述的产chloroeremomycin的基因工程菌。
进一步的，所述的构建方法包括如下步骤：
步骤一、cgmccno.3053δvca菌株的构建：以东方拟无枝酸菌cgmccno.3053为出发菌株，构建敲除vca基因的cgmccno.3053δvca菌株；
步骤二、重组质粒ply-eva的构建：从a.orientalisnrrl18098菌株中钓取eva基因，构建重组质粒ply-eva；
步骤三、重组菌株hccb13460的构建：将步骤二获得的重组质粒ply-eva插入到步骤一获得的cgmccno.3053δvca中，获得含有eva基因的重组菌株hccb13460，即为所述的产chloroeremomycin的基因工程菌。
进一步的，所述构建方法包括：敲除质粒ply-δvca的构建：利用引物vca-up-f、vca-up-r、vca-down-f和vca-down-r钓取a.orientaliscgmccno.3053中万古糖胺合成基因的上游基因和下游基因片段，拼接成长片段，并整合上抗性标记构成敲除质粒ply-δvca。
进一步的，所述重组质粒ply-eva的构建方法为：利用引物eva-f和eva-rpcr调取a.orientalisnrrl18098中的表万古糖胺合成基因eva，用酶ndeⅰ、xbaⅰ同时酶切eva基因和敲除质粒ply-δvca，将酶切回收产物用t4连接酶连接起来，构成重组质粒ply-eva，
其中，eva-f的引物序列如seqidno：7所示，eva-r的引物序列如seqidno：8所示。
进一步的，所述重组菌株hccb13460的构建方法为：将重组质粒ply-eva电转化导入感受态化的敲除菌cgmccno.3053-δvca，通过含安普霉素bennet培养基筛选到转化子，转化子培养获得转化菌株hccb13460。
本发明的有益效果：提供了一种chloroeremomycin产量高、发酵时间短的基因工程菌，具有广泛的工业应用前景。具体体现在：在没有培养基优化的情况下，发酵260h的chloroeremomycin的产量达到860mg/l，远高于出发菌株东方拟无枝酸菌nrrl18098生产chloroeremomycin的产量，同时总发酵时间低于东方拟无枝酸菌nrrl18098，具备工业化生产能力。
附图说明
图1为chloroeremomycin的结构式。
图2为敲除质粒ply-δvca示意图。
图3(a)为ply-eva示意及电泳图。
图3(b)为酶切回收的eva和ply-δvca。
图4为ply-eva酶切验证图。
图5为双交换实验pcr验证电泳图。
图6为样品的hplc图，其中a为lyv07ww01对照、b为chloroeremomycin对照品、c为hccb13460发酵上清、d为hccb13460发酵上清加chloroeremomycin对照。
图7为cgmccno.3053-δvca及对照菌株发酵液的无糖万古霉素hplc检测图，其中a为cgmccno.3053发酵液，b为cgmccno.3053-δvca发酵液，c为hccb10007。
图8(a)和图8(b)为chloroeremomycin对照与hccb13460发酵液的uplc-ms图，其中a为hccb13460发酵样品，b为chloroeremomycin对照。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明以东方拟无枝酸菌cgmccno.3053为出发菌株，构建敲除vca基因的cgmccno.3053δvca菌株；接着，从东方拟无枝酸菌nrrl18098菌株中钓取eva基因，构建重组质粒ply-eva；最后，将重组质粒ply-eva插入到cgmccno.3053δvca中，获得含有eva基因的重组菌株。
以下实施例中涉及的菌株和质粒来源如下：
工具酶、pmd19载体购于大连宝生物公司；dna分子标记购于赛默飞公司；胶回收试剂盒购于爱思进生物技术(杭州)有限公司；dh5a和jm110感受态细胞购于北京天根生化公司；起始菌株为cgmccno.3053和a.orientalisnrrl18098；pij773、ply104质粒参照文献(朱丽等.在东方拟无枝酸菌中建立i-scei内切酶介导的无标记敲除系统.中国抗生素杂志,2015,(05):330-333.)所述方法构建，引物由上海英潍捷基公司合成。
以下实施例中涉及的培养基组分如下(除特别注明外，以下涉及的％皆为质量体积比)：
(1)lb培养基(用于培养大肠杆菌)
胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，nacl1％，121℃高压灭菌30min，若配置固体培养基添加1.6-2.0％琼脂；
(2)高氏1号合成培养基(用于培养东方拟无枝酸菌)
可溶性淀粉2％，nacl0.05％，k2hpo40.05％，kno30.1％，mgso4·7h2o0.05％，feso40.001％，琼脂2％，调ph至7.2-7.4，121℃高压灭菌30min；
(3)crm培养基(用于制备东方拟无枝酸菌感受态细胞)
葡萄糖1％，tsb1.5％，蔗糖10.3％，酵母提取物0.5％，牛肉浸膏0.1％，115℃高压灭菌30min，用前加入5mm的cacl2和mgcl2·7h2o；
(4)bennet培养基(用于培养东方拟无枝酸菌转化子)
葡萄糖1％，牛肉浸膏0.1％，蛋白胨0.2％，酵母提取物0.1％，甘油1％，琼脂1.6-2.0％，115℃高压灭菌30min；
(5)种子培养基(s1)(用于东方拟无枝酸菌发酵时种子培养)可溶性淀粉4％，甘油2％，熟黄豆粉2％，葡萄糖1.5％，kno30.6％，kh2po40.02％，mgcl2·6h2o0.04％，自来水配制，ph调至6.8，121℃高压灭菌30min；
(6)发酵培养基(f1)(用于东方拟无枝酸菌发酵)熟黄豆粉2％，甘油6％，kno30.6％，kh2po40.02％，mgcl2·6h2o0.04％，caco30.3％，自来水配制，ph调至6.8，121℃高压灭菌30min。
以下实施例中涉及的pcr引物序列信息如表1所示，其中，下划线所标示的为所用的酶切位点，斜体为酶切位点名称。
表1pcr引物序列
实施例1敲除质粒ply-δvca的构建
利用引物vca-up-f、vca-up-r、vca-down-f和vca-down-r钓取a.orientaliscgmccno.3053中万古糖胺合成基因的上游基因和下游基因片段，经overlappcr拼接成约5kb的长片段，利用引物apr-f和apr-r钓取pij773上的安普霉素抗性基因aac(3)ⅳ，将pcr得到的基因片段克隆到pmd19-tsimple载体上，经测序验证后用nheⅰ、sphⅰ同时酶切，并用t4连接酶连起来，构成敲除质粒ply-δvca，结果如图2所示。将构建好的质粒化学转化转入大肠杆菌jm110去甲基化，抽提质粒酶切验证。验证结果显示酶切片段与理论值一致。
实施例2敲除菌株cgmcc3053-δvca的构建
将验证正确的敲除质粒ply-δvca电转化导入感受态化的cgmccno.3053，通过含安普霉素培养基筛选到转化子。转化子经28℃、tsb振荡培养3天，pcr结果如图5所示，证明得到转入敲除质粒ply-δvca的菌株cgmccno.3053-ply-δvca。
将质粒plyzl104转入cgmccno.3053-ply-δvca进行双交换实验，挑选抗性板上不长、无抗性板上生长良好的菌株转接tsb(胰酪胨大豆肉汤培养基)振荡培养3天并pcr验证，进行双交换的菌株安普抗性会丢失，双交换成功的菌株能够pcr出验证片段，否则是回复突变菌株，验证结果表明得到了敲除vancosamine合成基因vcaa，vcab，vcac和vcad的cgmccno.3053。
实施例3重组质粒ply-eva的构建
利用引物eva-f和eva-rpcr调取a.orientalisnrrl18098中的表万古糖胺合成基因orf23-26(eva基因)，克隆测序正确后，用酶ndeⅰ、xbaⅰ同时酶切eva基因和敲除质粒ply-δvca，将酶切回收产物用t4连接酶连成重组质粒ply-eva，结果如图3(a)和图3(b)所示。
将质粒转入dh5α扩增，再转入jm110去甲基化，抽提质粒，用sphⅰ、hindⅲ、pstⅰ分别酶切验证，验证结果表明，1号和3号质粒酶切片段(如图4所示)与理论值一致，可用作转入cgmccno.3053-δvca的质粒。
实施例4重组菌株hccb13460的构建
将验证正确的重组质粒电转化导入感受态化的敲除菌cgmccno.3053-δvca，通过含安普霉素bennet培养基筛选到转化子。转化子经28℃、tsb振荡培养3天，pcr验证结果，得到5株导入ply-eva质粒的hccb13460。
如图5所示，转化子经过双交换筛选，再将抗性平板上不长、无抗性平板上生长良好的菌株转接tsb振荡培养3天并pcr验证，共挑选了12株菌，其中7号菌株并未完全进行重组，仍为单交换菌株，理论上此菌株pcr结果应有1000bp和5000bp，但是一般pcr倾向扩增出较短的条带。菌株3-6号、8-14号进行了重组，除了13号为重组成功的菌株以外，其他的重组菌株均为回复突变菌株。图中验证敲除菌株的基因为糖胺合成基因上下游片段连接处的片段1000bp，当表万古糖胺合成基因成功插入后，所得到的条带为5160bp，图中条带大小符合理论值，表明得到了一株染色体上替换到表万古糖胺合成基因的菌株。
实施例5cgmccno.3053-δvca和hccb13460的发酵验证
cgmccno.3053-δvca和hccb13460的发酵培养基为f1、发酵条件为220rpm28℃培养5天，同发酵液经hcl酸化离心后，取上清进行hplc分析。结果如图5所示。
如图(6)的a、b所示，出发菌株cgmccno.3053的主产物为lyv07ww01，保留时间时间为16.07min，万古霉素的保留时间在18.32min，敲除菌株cgmccno.3053-δvca的发酵液中，在lyv07ww01和vancomycin保留时间处都没有相应的峰出现，且t＝35.50处的无糖骨架的峰面积有所增加(如图7所示)，进一步说明cgmccno.3053-δvca中万古糖胺基因已被敲除，且没有其他代谢途径合成万古糖胺进行补偿。
如图(6)的c、d所示，hccb13460发酵液和chloroeremomycin标准品同时在t＝17.min处有相应的峰出现；将chloroeremomycin标准品和hccb13460发酵液以1：1的量同时进样，出现单一峰，初步说明hccb13460发酵液中存在chloroeremomycin。
所用hplc检测方法如表2所示。
表2hplc分析流动相梯度
分析时间：30min
流速：1.0ml·min-1
柱温：30℃。
检测波长：240nm
色谱柱：agilentzobaxsb120-c18柱4.6μm×250mm5μm
实施例6hccb13460发酵液中chloroeromomycin的分离纯化和质谱分析
发酵hccb13460，发酵液经酸化处理后，4℃条件下4000rpm离心20min，去掉沉淀并重复一次。将上清ph调回中性，以xad-1600树脂柱分离，用含不同浓度hcl的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱液经hplc检测得到粗提液。将粗提液进行旋蒸浓缩，并用naoh溶液将ph调回中性，再用unips40-300树脂、不同浓度甲醇水进行分离纯化，最后进行冷冻干燥，得粗提物。粗提物经去离子水溶解后进行质谱检测。ms结果显示，粗提物的分子量为m/z＝1590，与所报导的chloroeremomycin的分子量及标准品的分子量一致，且其它碎片特征也一致。所以进一步说明hccb13460的发酵样品为chloroeremomycin，如图6(a)和图6(b)所示。
实施例7nrrl18098和hccb13460发酵chloroeremomycin产量对比
以上述s1培养基为种子培养基、f1培养基为发酵培养基，对hccb13460进行了发酵。种子培养24～36小时，发酵培养4天后，发酵液用盐酸进行酸化处理，高速离心，获取上清液进行hplc检测。hplc结果表明hccb13460发酵液中，chloroeremomycin产量约为860mg/l。明显地，在没有优化的情况下，hccb13460生产chloroeremomycin的能力远高于东方拟无枝酸菌nrrl18098，且总发酵时间短于东方拟无枝酸菌nrrl18098。
综上所述，将cgmccno.3053工程菌的vca基因敲除，并插入a.orientalisnrrl18098的eva基因构建获得的基因工程菌发酵生产chloroeremomycin的产量高、菌种稳定性好，具有广泛的工业应用前景。
序列表
<110>上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司；上海交通大学
<120>一种产chloroeremomycin的基因工程菌及其制备方法和应用
<130>171016
<160>12
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