一种类芽胞杆菌菌株HB172198及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种类芽胞杆菌菌株hb172198及其应用。

背景技术

褐藻胶，又名海藻酸钠，是由1,4-β-d-甘露糖醛酸(1,4-β-d-mannuronicacid，m)和1,4-α-l-古罗糖醛酸(1,4-α-l-guluronicacid，g)两种糖醛酸单体通过α/β-1,4糖苷键链接、随机排列成的线性高分子，广泛存在于海带、马尾藻、巨藻、鹿角菜等褐藻的细胞中。褐藻胶作为一种极具应用价值的多糖类物质，可以被降解成由2～20个单糖聚合而成的寡糖片段，从而表现出多种生物活性，在食品、医疗及工业生产等行业应用广泛。褐藻胶的降解方法分为化学降解法、物理降解法和酶降解法。其中，酶解法是通过褐藻胶裂解酶将大分子褐藻胶降解成小分子的寡糖片段，反应条件温和、效率高、底物专一性强，不会产生对人体和环境有害的副产物，逐渐成为工业降解褐藻胶生产褐藻寡糖的主要手段。

自然界中褐藻胶裂解酶的来源广泛，可以从多种海洋动物、海洋和陆地微生物体内分离得到，其中微生物是产生褐藻胶裂解酶的主要类群。微生物中又以细菌产酶能力较强且研究较多，如弧菌属(vibrio)、假单胞菌属(pseudomonas)、盐单胞菌属(halomonas)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、黄杆菌属(flavobacterium)和芽胞杆菌(bacillus)等，其中绝大多数是革兰氏阴性菌，而革兰氏阳性菌的报道极少。芽胞杆菌具有适应能力强、生长速度快、存活时间长等特点，目前报道的产褐藻胶裂解酶的芽胞杆菌较少。芽胞杆菌产生的褐藻胶裂解酶可以作用于特定的糖苷键，形成较固定的产物，有着广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种类芽胞杆菌菌株hb172198，该菌株能够有效降解褐藻胶，还可作为一种新的褐藻胶裂解酶产生菌，也可直接用于褐藻生物降解的微生物资源。

本发明的目的还在于提供一种褐藻胶裂解酶及其制备方法，该褐藻胶裂解酶能有效降解褐藻胶，该方法工艺成熟，能获得大量的褐藻胶裂解酶。

本发明的第三个目的在于提供上述类芽胞杆菌菌株hb172198及褐藻胶裂解酶在降解褐藻胶中的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种类芽胞杆菌菌株hb172198，该菌株hb172198的分类命名为类芽胞杆菌(paenibacillussp.)，保藏编号为：cgmccno.15412，保藏日期为：2018年03月05日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明中的类芽胞杆菌hb172198属于细菌域、厚壁菌门、芽胞杆菌纲、芽胞杆菌目、类芽胞杆菌科、类芽胞杆菌属。

本发明所述类芽胞杆菌hb172198是由褐藻附生菌中分离筛选得到。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种褐藻胶裂解酶，采用上述的类芽胞杆菌菌株hb172198发酵制得。

上述的褐藻胶裂解酶的制备方法，优选包括以下步骤：

(1)菌株活化：将上述的类芽胞杆菌hb172198接种于固体培养基，于28～37℃培养24～48h，得活化的菌株；

(2)液体培养：将活化的菌株接入液体种子培养基中，于28～37℃、120～200r/min振荡培养12～24h，制成种子液；

(3)发酵培养：将种子液按体积百分含量为2～10％接种于液体发酵培养基中，于28～37℃、150～200r/min振荡培养24～60h，收集发酵液，离心，收集上清液得褐藻胶裂解酶粗酶液。

在该褐藻胶裂解酶的制备方法中：

步骤(1)中所述的固体培养基优选为海藻酸钠2216e固体培养基。

该海藻酸钠2216e固体培养基的组成为：海藻酸钠2～15g/l，蛋白胨3～10g/l，酵母粉0.5～5g/l，氯化钠5～35g/l，琼脂粉18～20g/l，ph6.5～7.8，以蒸馏水配制。

该培养基中添加了海藻酸钠，能促进细菌产生褐藻胶裂解酶。步骤(2)中所述的液体种子培养基和步骤(3)中所述的液体发酵培养基优选为海藻酸钠2216e液体培养基。

该海藻酸钠2216e液体培养基组成为：海藻酸钠2～15g/l，蛋白胨3～10g/l，酵母粉0.5～5g/l，氯化钠5～35g/l，ph6.5～7.8，以蒸馏水配制。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的类芽胞杆菌菌株hb172198以及褐藻胶裂解酶在降解褐藻中的应用。

褐藻优选包括马尾藻、海带等褐藻种类。

本发明具有如下优点：

(1)本发明中的类芽胞杆菌菌株hb172198，该菌株能够有效降解褐藻胶，还可作为一种新的褐藻胶裂解酶产生菌，也可直接用于褐藻生物降解的微生物资源。

(2)本发明中的褐藻胶裂解酶，该褐藻胶裂解酶能有效降解褐藻胶，本发明中的褐藻胶裂解酶的制备方法，工艺成熟，能获得大量的褐藻胶裂解酶。

(3)本发明中的类芽胞杆菌菌株hb172198以及褐藻胶裂解酶能用于降解褐藻胶和马尾藻、海带等褐藻。

附图说明

图1为实施例1中获得菌株hb172198的电镜照片；

图2为实施例2中菌株hb172198的基于16srdna的系统发育树；

图3为实施例5中菌株hb172198粗酶液降解海藻酸钠形成寡糖的薄层层析图谱，其中1为标准品(单糖、三糖和五糖)、2～8分别为第2、6、10、14、20、36、48h的酶解样品。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

具体实施方式

实施例1类芽胞杆菌hb172198cgmccno.15412的分离与筛选

褐藻样品采集于海南省文昌市淇水湾近海。取10g样品，无菌状态下剪碎、溶浆，置于装有90ml无菌水及玻璃珠的250ml锥形瓶中，置于28℃、200r/min的恒温摇床中振荡30min，静置5min后，取上清液进行10倍梯度稀释，稀释成10^-1～10^-3的系列悬液。采用80℃水浴处理20min的方法以杀死非芽胞细菌，吸取系列悬液0.1ml，涂布于褐藻胶裂解酶分离培养基，置于30℃培养箱倒置培养2～5d。

待菌落长出时，根据菌落形状、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等表型特征，挑取生长好、形态不同的菌落进行划线纯化。

对分离获得的芽胞杆菌进行褐藻胶裂解酶活力测定，筛选出酶活性较强的芽胞杆菌hb172198。

具体过程如下：

用灭菌牙签挑取待检测菌株点接到褐藻胶裂解酶活性检测培养基上，30℃培养2d。待平板上长出明显的菌落后，测量菌落直径(d)。在平皿中加入1mol/l的cacl2溶液，静置30-60min。待平板上显现出水解圈后，测量水解圈直径(d)，以水解圈直径和菌落直径的比值(d/d)作为初筛指标。

其中芽胞杆菌hb172198的d/d值为10.5，活性明显。

所用到的培养基配方如下：

褐藻胶裂解酶分离培养基：海藻酸钠5g，酵母粉1g，蛋白胨5g，磷酸高铁0.01g，琼脂18g，以海水定容至1l，ph7.6。

褐藻胶裂解酶活性检测培养基：海藻酸钠5g，(nh4)2so45g，k2hpo42g，nacl20g，mgso4·7h2o1g，feso4·7h2o0.01g，琼脂18g，以海水定容至1l，ph7.6。

实施例2类芽胞杆菌hb172198cgmccno.15412的种属鉴定

菌株hb172198cgmccno.15412在2216e琼脂培养基上划线培养3d后，菌落呈圆形、边缘规则、表面无光泽、平整、浅黄色、不透明；菌体杆状，产芽胞，两端极生鞭毛(图1)。革兰氏染色可变，硝酸盐不还原、明胶不水解，不产生吲哚。

通过pcr扩增、测序获得hb172198的16srdna序列1477bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示。将该序列与ezbiocloud数据库中的序列进行比对，发现菌株hb172198与paenibacilluslemnael7-75^t同源性最高(97.6％)，与其它菌株同源性均在97.0％以下。选择同源性高的相关菌株，利用软件mega5.0采用neighbor-joining法构建系统发育树(图2)，可以看出，菌株hb172198与paenibacilluslemnael7-75^t处于同一分支上，二者亲缘关系较近。比较二者的基因组ani值，仅为75.3％，小于国际细菌系统分类学委员会规定的95％的种的界限。

比较两株菌的形态学、生理生化与分子特征，鉴定本发明中的菌株hb172198(cgmccno.15412)为类芽胞杆菌属的一个新种，暂命名为paenibacillussp.hb172198。

该菌株已于2018年3月05日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为cgmccno.15412。保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

该菌株具有较强的产褐藻胶裂解酶活性，能有效降解马尾藻、海带等褐藻藻体，可用于发酵制备褐藻胶裂解酶，也可开发成一种新型应用于褐藻生物降解的微生物菌剂。

实施例3褐藻胶裂解酶及其制备方法

本发明中的褐藻胶裂解酶是由实施例1中的保藏编号为cgmccno.15412的类芽胞杆菌hb172198发酵制成的，具体方法包括以下步骤：

(1)菌株活化：将实施例1中的类芽胞杆菌hb172198接种于固体培养基，于30℃培养48h，得活化的菌株；

(2)液体培养：将活化的菌株接入液体种子培养基中，于30℃、180r/min振荡培养12～24h，制成种子液；

(3)发酵培养：将种子液按体积百分含量为3％接种于液体发酵培养基中，于30℃、180r/min振荡培养36h，收集发酵液，离心，收集上清液得褐藻胶裂解酶粗酶液。

步骤(1)中的固体培养基为海藻酸钠2216e固体培养基。

海藻酸钠2216e固体培养基的组成为：海藻酸钠2～15g/l，蛋白胨3～10g/l，酵母粉0.5～5g/l，氯化钠5～35g/l，琼脂粉18～20g/l，ph6.5～7.8，以蒸馏水配制。

步骤(2)中的液体种子培养基为海藻酸钠2216e液体培养基。

步骤(3)中的液体发酵培养基为海藻酸钠2216e液体培养基。

海藻酸钠2216e液体培养基组成为：海藻酸钠2～15g/l，蛋白胨3～10g/l，酵母粉0.5～5g/l，氯化钠5～35g/l，ph6.5～7.8，以蒸馏水配制。

实施例4褐藻胶裂解酶酶活测定

采用紫外吸收法进行褐藻胶裂解酶酶活力测定。过程如下：

收集发酵液，离心，以上清液作为粗酶液(实施例3中制得的)。

取1.8ml底物(3.0g海藻酸钠溶于1l50mmph7.0磷酸盐缓冲液)于40℃预热5min，加入0.2ml待测粗酶液，40℃温浴10min，以灭活的酶液体系为空白对照，测定反应体系在od235下的紫外吸收值。定义在上述酶活测定方法下od235紫外吸收值每分钟增加0.1的酶量为酶的一个活力单位(1u)。

结果显示，菌株hb172198发酵36h时褐藻胶裂解酶最大，酶活力为14.6u/ml。

实施例5褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠

本发明中褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠的效果测定方法：收集发酵液，离心，以上清液作为粗酶液(即褐藻胶裂解酶)，配制质量百分含量为2％的海藻酸钠溶液，加入体积比为20％的粗酶液，反应温度30℃，反应2、6、10、14、20、32、48h时分别取溶液5ml加无水乙醇至终浓度为70％，离心，取上清，冷冻干燥，加少量水溶解进行薄层层析(tlc)。展开剂为正丁醇∶甲酸∶水＝4∶5∶1，用5％的硫酸乙醇作为显色剂，110℃下保持10min显色。可发现主要降解产物聚合度在1～7之间，薄层层析图谱如图3所示，图中样品1为标准品(单糖、三糖和五糖)、样品2～8分别为第2、6、10、14、20、36、48h的酶解样品，结果表明菌株hb172198产生的褐藻胶裂解酶能有效降解海藻酸钠。

实施例6褐藻胶裂解酶降解马尾藻

将实施例3制备的褐藻胶裂解酶，按2～10％的接种量(质量百分含量，优选3％)接入已灭菌的马尾藻粉固体基质，基质组成为：马尾藻粉30～50％，玉米粉10～30％，豆粕10～30％，麸皮10～30％，含水量30～60％(优选马尾藻粉30％，玉米粉30％，豆粕20％，麸皮20％，含水量45％)。置于28～37℃(优选30℃)的培养箱中静置培养，每天振荡分散固体培养基数次，培养10-20d(优选12d)。

称取适量固体发酵样品置于离心管，加入适量纯水，混匀，离心，收集上清液进行薄层层析(tlc)。展开剂为正丁醇∶甲酸∶水＝4∶5∶1，用5％的硫酸乙醇作为显色剂，110℃下保持10min显色，可发现主要降解产物为聚合度为2-7的寡糖。

实施例7菌株hb172198对海带的降解

干海带浸泡1h，清洗干净，剪块(1cm×1cm)，平放于培养皿中，加入适量无机盐培养液，成份是：(nh4)2so45g，k2hpo42g，nacl20g，mgso4·7h2o1g，feso4·7h2o0.01g，加入蒸馏水至1l，ph7.5。

接入按实施例3制备的处于对数生长末期的hb172198新鲜菌液，接种量2％，混匀，30℃培养7d，观察不同时间点培养基的浑浊度及海带块形状。

观察发现，随着培养时间的延长，海带块逐渐溶解，无色培养液颜色逐渐加深变为褐色，到第7d时完全降解海带块至无固定形态，海带块得到完全降解。这表明菌株hb172198及其发酵液能有效降解海带。

上面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是上述具体实施例只用于对本发明作进一步的说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明作出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

序列表

<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120>一种类芽胞杆菌菌株hb172198及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1477

<212>dna

<213>类芽胞杆菌(paenibacillus)

<400>1

gacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggagttaatggagtgcttgc60

actcctgatgcttagcggcggacgggtgagtaacacgtaggcaacctgccctcaagactg120

ggataactaccggaaacggtagctaataccggatagttgatttcgctgcatagtgagatc180

tggaaaggcggagcaatctgtcacttgaggatgggcctgcggcgcattagctagttggtg240

gggtaacggcctaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgaacggccacact300

gggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatgg360

acgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctct420

gttgccagggaagaacgtcttctagagtaactgctagaagagtgacggtacctgagaaga480

aagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcaagcgttgtccg540

gaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttgttaagtctggtgtttaaacctgggg600

ctcaacctcaggtcgcactggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaatt660

ccacgtgtagcggtgaaatgcgtagatatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactct720

ctgggctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccct780

ggtagtccacgccgtaaacgatgaatgctaggtgttaggggtttcgatacccttggtgcc840

gaagttaacacattaagcattccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaagg900

aattgacggggacccgcacaagcagtggagtatgtggtttaattcgaagcaacgcgaaga960

accttaccaggtcttgacatccctctgaccggtatagagatatacctttccttcgggaca1020

gaggagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcc1080

cgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcaggttatgctgggcactctaaggtg1140

actgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatga1200

cctgggctacacacgtactacaatggctggtacaacgggaagcgaaggagcgatctggag1260

cgaatcctaaaaagccagtctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagtc1320

ggaattgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtaca1380

caccgcccgtcacaccacgagagtttacaacacccgaagtcggtggggtaacccgcaagg1440

gagccagccgccgaaggtggggtagatgattggggtg1477