一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法与流程

本发明涉及一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
类人润滑素(lubricin)一种具有软骨保护作用的黏液糖蛋白，由滑膜细胞及关节软骨浅表区的软骨细胞合成，这种由蛋白聚糖4(prg4)基因编码的表面润滑蛋白又叫做润华素、巨核细胞刺激因子(msf)或浅表层蛋白(szp)。润华素是从prg4基因表达的，全长跨12个外显子，但是也有报道过多种天然发生的截短的版本。940个氨基酸的大的“类黏液素”中央结构域(有外显子6编码)，包含一些70+类kepaptt序列并且是重度糖基化的。所述糖蛋白包含ii型核心糖基化残基和多样性i型核心聚糖(o-连接β(1-3)gal-galnac寡糖)，其中至少后者已经显示出介导其主要的生理学功能，界面润滑。prg4已被显示出有助于对接的关节软骨表面的界面润滑，prg4已被显示出不仅仅作为单体存在还可作为二聚体和多聚体(通过n-末端和c-末端处保守的富半胱氨酸结构域的二硫键)。在滑膜关节的软骨交界面，有至少两种润滑的物理化学模式在起作用。这些被分类为“流体薄膜”和“界面”。运作的润滑模式取决于关节连接组织上的正向力和切向力，取决于这些表面之间切向运动的相对速率，以及取决于载荷和运动随着时间的变化。摩擦系数μ(无量纲单位，相对运动中的两个表面之间所测量的摩擦力与所应用的正向力的比率)，提供了润滑的定量量度。被认为造成滑液出色润滑性质的两种机械成分是润滑素和透明质酸(ha)。润滑素已经被显示出在关节连接滑膜关节中作为界面润滑剂以及用于保护软骨的表面以防摩擦力、细胞黏连和蛋白沉积。例如，美国专利号6，960，562和6，743，774公开了包含基本纯的prg4同种型的通过全身性或者直接施用至组织润滑滑膜关节或者其它组织的方法。ha本身已经被显示出在界面模式润滑下于软骨-软骨界面处相对于盐水而言降低μ，而仅有润滑素将μ降低至更低的水平，但是包含ha以及润滑素的滑液可以将仅有润滑素或者ha与润滑素的合成混合物所不能实现的摩擦系数赋予给界面表面，尚未有润滑素与ha的合成混合物能够完全复制天然形式的滑液所赋予的低摩擦系数。类人润滑素(lubricin)是关节软骨表层的特异性标志，最早发现存在于人体膝软骨、眼球表面以及多处组织，被认为是滑液的主要成分之一，是人体内最重要的润滑及抗黏连成分之一，对于保持人体的正常生理功能有至关重要的作用。随着患者年龄的增大或体外实验中细胞培养周期的延长，软骨细胞分泌lubricin的能力显著降低。由于损伤、疾病以及老化导致的炎症会影响到人体正常水平lubricin的产生，重组lubricin的补充疗法可以消除表面摩擦，修损表面功能，特别适合开发用于干眼症、骨关节炎的治疗。骨关节炎是一种最常见的关节炎形式，这一痛苦的关节疾病可导致日常活动和生活质量受到严重影响。它可引起关节疼痛、肿胀、活动减少。尽管它可以发生于任何关节，其主要常见于手、膝、臀部和脊柱。根据美国疾病控制和预防中心的统计，骨关节炎从人45岁开始患病率增加，在美国导致2700万处于肥胖、衰老、关节损伤/创伤等风险因子中的成人受累。缺乏或突变lubricin，会导致浅表区软骨细胞消失及滑膜细胞增生，造成关节内摩擦力增高和关节过早磨损，即便是存在高水平的对关节起缓冲作用的粘性流体透明质酸存在的情况下，也会导致软骨细胞死亡。而以lubricin进行关节内治疗可取得明显效果，能够有效抑制但，目前，在适于商业拓展的规模上，还没有成功生产重组全长润滑素还没有取得成功，产量只能达到每升个位或者十位数毫克。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种在中华仓鼠卵巢细胞(cho)中表达生产重组类人润滑素的方法。本发明首先提供了一种表达生产重组类人润滑素(rh-lubricin)的重组cho细胞株，是将来源于人的rh-lubricin基因连接到表达载体pcho1.0，转化cho细胞株，经筛选达到分泌表达rh-lubricin的工程细胞株。在本发明的一种实施方式中，所述重组类人润滑素的氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明还提供了应用所述重组cho细胞表达生产重组类人润滑素的方法，所述方法是用基础培养基将二级种子细胞按(0.6±0.1)×106个/ml的接种密度稀释至3l细胞培养反应器中，初始培养体积为1l；设置搅拌转速为200～250r/min；ph设置为6.8～7.2，关联碳酸氢钠溶液和co2以调节ph；溶解氧设置为20～60％；前期培养温度设置为36.5±0.5℃；培养第5天降温至32～34℃；培养第14天收获。进一步地，在培养的第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补加补料培养基a和补料培养基b，补料培养基a的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基b的补料体积为初始培养体积的0.4％，葡萄糖浓度低于3.0g/l时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/l。进一步地，用于培养种子的种子培养基为：cdforticho24.4g/l，葡聚糖硫酸酯钠盐0.05g/l，mtx1.0mmol/l。进一步地，基础培养基为：actichopro22.2g/l，5mmol/l氢氧化钠7.56g/l，碳酸氢钠1.79g/l，聚糖硫酸酯钠盐0.05g/l。进一步地，补料培养基a为：cellboost7a170.0g/l，5mmol/l氢氧化钠20.5g/l。进一步地，补料培养基b为：cellboost7b90.1g/l，5mmol/l氢氧化钠179g/l。进一步地，在培养的第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补加补料培养基a、补料培养基b、酪氨酸和酵母水解物，补料培养基a的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基b的补料体积为初始培养体积的0.4％，酪氨酸的添加量为5g/l、酵母水解物的添加量为16g/l；葡萄糖浓度低于3.0g/l时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/l。进一步地，所述一级种子的制备方法是：用预热至36.5±0.5℃的种子培养基将细胞按0.3±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中，摇瓶置于二氧化碳摇床：36.5±0.5℃，6±1％co2，130r/min，每次扩增培养3±1天，活细胞密度不超过6.0×106个/ml，扩增三次。进一步地，所述二级种子的制备方法是：用预热至36.5±0.5℃的基础培养基将一级细胞按0.3±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中扩增培养，摇瓶置于二氧化碳摇床：36.5±0.5℃，6±1％co2，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增两次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×106个/ml。本发明还提供了从cho细胞表达生产重组类人润滑素的培养液中亲和纯化类人润滑素的方法，培养液进行澄清过滤后，澄清过滤液(每100ml)用含有5ml200mmtris，40mmmgcl2，ph8.2的溶液与400units核酸酶混匀后去除多聚核苷酸。室温下混匀4h后，加入37.8g尿素调整尿素浓度至6m，加入1nnaoh调整ph值为11，并加入0.01％吐温20至终体积120ml。处理后的溶液用geqbigbeadstm阴离子交换柱进行亲和纯化。柱子使用前用0.1nnaoh冲洗后，用100mmnapo4，1.5mnacl，ph7.2的溶液进行再次冲洗，前平衡液为200mmtris-borate，6m尿素，ph10。柱体积为30ml，上样体积120ml，流速为20ml/min。平衡液为100mmtris-borate，100mmnacl，6m尿素，0.01％吐温20，ph7.2。然后用0.1nnaoh和1mnacl进行洗脱收集目的蛋白。本发明的有益效果：本发明提供的重组类人润滑素在cho细胞中的表达、流加培养和纯化方法，在3l反应器水平上可使目的蛋白浓度达到0.73g/l，进一步优化培养基，表达量可以达到1.88g/l，纯化后重组类人润滑素的纯度达到98.2％。本发明提供的制备方法简单、便于使用，具有很好地应用前景。附图说明图1rh-lubricin表达过程中活细胞数变化曲线图2rh-lubricin表达过程中细胞活率变化曲线图3rh-lubricin表达过程中蛋白产量曲线具体实施方式种子培养基：cdforticho24.4g/l，葡聚糖硫酸酯钠盐0.05g/l，mtx1.0mmol/l；基础培养基：actichopro22.2g/l，5mmol/l氢氧化钠7.56g/l，碳酸氢钠1.79g/l，聚糖硫酸酯钠盐0.05g/l；补料培养基a：cellboost7a170.0g/l；补料培养基b：cellboost7b90.1g/l。cdforticho购自gibco，actichopro、cellboost7a、cellboost7b购自ge，其他试剂均购自sigma。实施例1重组细胞株的构建利用常规的dna重组技术将rh-lubricin基因正确置于cho细胞表达载体pcho1.0(thermo)，转化cho-s细胞，经筛选建立分泌表达rh-lubricin的重组细胞株。参考书有《分子克隆技术指南》、《分子生物学指南》、《动物细胞培养》。实施例2重组细胞株的复苏将种子培养基放置水浴锅中，37±0.5℃预热20min以上，取一支工作库细胞，37±0.5℃水浴速融，控制融解时间120±30s内，将细胞移入8.5ml种子培养基的15ml离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，用5ml的种子培养基重悬细胞并转移到125ml摇瓶内，补充体积至30±5ml，混合均匀后取0.5ml计数，后置于36.5±0.5℃、6±1％co2、130rpm的摇床中培养3±1天。实施例3一级种子的制备用预热至36.5±0.5℃的种子培养基将细胞按0.3±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中，混匀后取样0.5ml细胞液用于计数。摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％co2，130r/min，扩增培养3±1天，活细胞密度不超过6.0×106个/ml，扩增3次。实施例4二级种子的制备用预热至36.5±0.5℃的基础培养基将一级种子细胞按0.3±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中，混匀后取样0.5ml细胞液用于计数。摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％co2，130r/min，扩增培养3±1天，活细胞密度不超过6.0×106个/ml，扩增2次。实施例5反应器连续流加培养用基础培养基将二级种子细胞按0.6×106个/ml的接种密度稀释至3l细胞培养反应器中，初始培养体积为1l；设置搅拌转速为250r/min；ph设置为7.00，deadband设置为0.10，关联碳酸氢钠溶液(nahco390.7g/l)和co2进行调节；溶解氧设置为40％(溶氧饱和时的溶解氧设定为100％)，前期培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至32.0℃；培养第14天收获。第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补加补料培养基a和补料培养基b，补料培养基a的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基b的补料体积为初始培养体积的0.4％，每天取样3ml检测活细胞密度、细胞活率和ph，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.0g/l时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/l。细胞培养的密度曲线如图1所示，培养过程中的细胞活力如图2所示。如图3所示，最终培养上清液中类人润滑素蛋白含量达到0.73g/l。进一步地，对补料培养基进行优化，每次在补加补料培养基a和补料培养基b的同时，添加酪氨酸、胱氨酸和酵母水解物。如表1所示，添加酪氨酸和酵母水解物均能大幅提高产量，添加胱氨酸对产量的提高作用不显著。添加终浓度为5g/l的酪氨酸、终浓度为16g/l的酵母水解物，能够将表达量提高到1.64g/l，比原产量0.73g/l提高了124％。表1序号酪氨酸(g/l)胱氨酸(g/l)酵母水解物(g/l)表达量(g/l)10000.73200161.230500.82405161.3355000.91650161.6475501.02855161.8892.52.581.28102.52.581.31112.52.581.30实施例6培养液澄清纯化采用实施例5优化后的添加5g/l酪氨酸、16g/l酵母水解物的方法培养制备重组类人润滑素，将培养液进行澄清过滤后，澄清过滤液(每100ml)用含有5ml200mmtris，40mmmgcl2，ph8.2的溶液与400units核酸酶混匀后去除多聚核苷酸。室温下混匀4h后，加入37.8g尿素调整尿素浓度至6m，加入1nnaoh调整ph值为11，并加入0.01％吐温20至终体积120ml。处理后的溶液用geqbigbeadstm阴离子交换柱进行亲和纯化。柱子使用前用0.1nnaoh冲洗后，用100mmnapo4，1.5mnacl，ph7.2的溶液进行再次冲洗，前平衡液为200mmtris-borate，6m尿素，ph10。柱体积为30ml，上样体积120ml，流速为20ml/min。平衡液为100mmtris-borate，100mmnacl，6m尿素，0.01％吐温20，ph7.2。然后用0.1nnaoh和1mnacl进行洗脱收集目的蛋白。纯化后的目的蛋白采用sec-hplc(waterse2695)分析，色谱柱为toshtskgelg3000swxl，流动相为100mm的磷酸盐缓冲液，ph7.5，流速0.5ml/min，进样量50μl，检测波长280nm。检测结果表明纯化后蛋白纯度达到98.2％。对比例1反应器连续流加培养用基础培养基将二级种子细胞按0.6×106个/ml的接种密度稀释至3l细胞培养反应器中，初始培养体积为1l；设置搅拌转速为250r/min；ph设置为7.00，deadband设置为0.10，关联碳酸氢钠溶液和co2进行调节；溶解氧设置为40％(溶氧饱和时的溶解氧设定为100％)，前期培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至32.0℃；培养第14天收获。第3、5、7、9、11天进行补料，补加补料培养基a、酪氨酸和酵母水解物，不补加补料培养基b，补料培养基a的补料体积为初始培养体积的4％，酪氨酸的添加量为5g/l、酵母水解物的添加量为16g/l；每天取样3ml检测活细胞密度、细胞活率和ph，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.0g/l时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/l。最终培养上清液中类人润滑素蛋白含量达到1.27g/l。对比例2反应器连续流加培养用基础培养基将二级种子细胞按0.6×106个/ml的接种密度稀释至3l细胞培养反应器中，初始培养体积为1l；设置搅拌转速为250r/min；ph设置为7.00，deadband设置为0.10，关联碳酸氢钠溶液和co2进行调节；溶解氧设置为40％(溶氧饱和时的溶解氧设定为100％)，前期培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至32.0℃；培养第14天收获。第3、5、7、9、11天进行补料，补加补料培养基b、酪氨酸和酵母水解物，不补加补料培养基a，补料培养基b的补料体积为初始培养体积的0.4％，酪氨酸的添加量为5g/l、酵母水解物的添加量为16g/l；每天取样3ml检测活细胞密度、细胞活率和ph，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.0g/l时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/l。最终培养上清液中类人润滑素蛋白含量达到0.93g/l。对比例3反应器连续流加培养用基础培养基将二级种子细胞按0.6×106个/ml的接种密度稀释至3l细胞培养反应器中，初始培养体积为1l；设置搅拌转速为250r/min；ph设置为7.00，deadband设置为0.10，关联碳酸氢钠溶液和co2进行调节；溶解氧设置为40％(溶氧饱和时的溶解氧设定为100％)，前期培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至32.0℃；培养第14天收获。第3、5、7、9、11天进行补料，补加补料培养基a、补料培养基b、酪氨酸和酵母水解物，补料培养基a的补料体积为初始培养体积的2％，补料培养基b的补料体积为初始培养体积的0.4％，酪氨酸的添加量为5g/l、酵母水解物的添加量为16g/l；每天取样3ml检测活细胞密度、细胞活率和ph，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.0g/l时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/l。最终培养上清液中类人润滑素蛋白含量达到1.39g/l。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>苏州迈缔姆生物技术有限公司<120>一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1404<212>prt<213>人<400>1metalatrplysthrleuproiletyrleuleuleuleuleuserval151015phevalileglnglnvalserserglnaspleusersercysalagly202530argcysglygluglytyrserargaspalathrcysasncysasptyr354045asncysglnhistyrmetglucyscysproaspphelysargvalcys505560thralagluleusercyslysglyargcysphegluserphegluarg65707580glyargglucysaspcysaspalaglncyslyslystyrasplyscys859095cysproasptyrgluserphecysalagluvalhisasnprothrser100105110proproserserlyslysalaproproproserglyalaserglnthr115120125ilelysserthrthrlysargserprolysproproasnlyslyslys130135140thrlyslysvalilegluserglugluilethrglugluhisserval145150155160sergluasnglngluserserserserserserserserserserser165170175serthrilearglysilelysserserlysasnseralaalaasnarg180185190gluleuglnlyslysleulysvallysaspasnlyslysasnargthr195200205lyslyslysprothrprolysproprovalvalaspglualaglyser210215220glyleuaspasnglyaspphelysvalthrthrproaspthrserthr225230235240thrglnhisasnlysvalserthrserprolysilethrthralalys245250255proileasnproargproserleuproproasnseraspthrserlys260265270gluthrserleuthrvalasnlysgluthrthrvalgluthrlysglu275280285thrthrthrthrasnlysglnthrserthraspglylysglulysthr290295300thrseralalysgluthrglnserileglulysthrseralalysasp305310315320leualaprothrserlysvalleualalysprothrprolysalaglu325330335thrthrthrlysglyproalaleuthrthrprolysgluprothrpro340345350thrthrprolysgluproalaserthrthrprolysgluprothrpro355360365thrthrilelysseralaprothrthrprolysgluproalaprothr370375380thrthrlysseralaprothrthrprolysgluproalaprothrthr385390395400thrlysgluproalaprothrthrprolysgluproalaprothrthr405410415thrlysgluproalaprothrthrthrlysseralaprothrthrpro420425430lysgluproalaprothrthrprolyslysproalaprothrthrpro435440445lysgluproalaprothrthrprolysgluprothrprothrthrpro450455460lysgluproalaprothrthrlysgluproalaprothrthrprolys465470475480gluproalaprothralaprolyslysproalaprothrthrprolys485490495gluproalaprothrthrprolysgluproalaprothrthrthrlys500505510gluproserprothrthrprolysgluproalaprothrthrthrlys515520525seralaprothrthrthrlysgluproalaprothrthrthrlysser530535540alaprothrthrprolysgluproserprothrthrthrlysglupro545550555560alaprothrthrprolysgluproalaprothrthrprolyslyspro565570575alaprothrthrprolysgluproalaprothrthrprolysglupro580585590alaprothrthrthrlyslysproalaprothrthrprolysglupro595600605alaprothrthrprolysgluthralaprothrthrprolyslysleu610615620thrprothrthrproglulysleualaprothrthrproglulyspro625630635640alaprothrthrproglugluleualaprothrthrprogluglupro645650655thrprothrthrproglugluproalaprothrthrprolysalaala660665670alaproasnthrprolysgluproalaprothrthrprolysglupro675680685alaprothrthrprolysgluproalaprothrthrprolysgluthr690695700alaprothrthrprolysglythralaprothrthrleulysglupro705710715720alaprothrthrprolyslysproalaprolysgluleualaprothr725730735thrthrlysgluprothrserthrthrserasplysproalaprothr740745750thrprolysglythralaprothrthrprolysgluproalaprothr755760765thrprolysgluproalaprothrthrprolysglythralaprothr770775780thrleulysgluproalaprothrthrprolyslysproalaprolys785790795800gluleualaprothrthrthrlysglyprothrserthrthrserasp805810815lysproalaprothrthrprolysgluthralaprothrthrprolys820825830gluproalaprothrthrprolyslysproalaprothr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