本发明属于生物
技术领域：
，具体地说，尤其涉及一种磁约束离子四季培养基制备纳豆激酶的方法。
背景技术：
血栓性疾病是中老年人群的高发病，是现今仅次于癌症的第二大病症，具有很高的死亡威胁，目前，溶解血栓是治疗这一类疾病的重要手段。纳豆激酶是一种枯草杆菌蛋白酶，是纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，具有溶解血栓、降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。纳豆激酶通过刺激血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂t-pa，t-pa将纤溶酶激活为纤溶酶，溶解纤维蛋白，直接溶解血栓；同时将人体内的尿激酶原激活为尿激酶，尿激酶与t-pa一同激活纤溶酶原，达到溶解血栓。但是，目前国内的纳豆激酶产品在四季季节内采用统一的生产配方，无法做到随季节变化而变化，导致纳豆激酶产品活性低，功能差别大。技术实现要素：本发明目的在于提供一种生物磁场控制约束、适应微生物不同季节的营养需求、提高纳豆激酶代谢产量和生产稳定性的磁约束离子四季培养基制备纳豆激酶的方法。为了实现上述技术目的，本发明磁约束离子四季培养基制备纳豆激酶的方法采用的技术方案为：一种磁约束离子四季培养基制备纳豆激酶的方法，包括以下步骤：(1)将不同品种的纳豆放置于不同锥形瓶中，并添加无菌水至30ml，在磁场强度为500～550gs的磁场下，锥形瓶放入37℃摇床中振摇30min，取出后水浴沸煮5min，冷却后稀释涂布lb固体培养基，37℃培养过夜，挑取经培养后lb平板培养基上的单菌落点于酪蛋白初筛平板，37℃培养过夜，选取透明圈直径与菌落直径比大者转接至lb液体培养基中，得纳豆芽孢杆菌株；(2)按照以下质量的成分称取各组分，并根据适用季节分为四组，即a组(春季)：芸豆粉12～30g/l、绿豆粉9～15g/l、桑叶粉2～5g/l、麦苗粉2～5g/l、葡萄糖30～40g/l以及氯化钠0.05～4g/l，b组(夏季)：芸豆粉12～30g/l、赤豆粉9～15g/l、苦瓜粉2～5g/l、西红柿粉2～5g/l、葡萄糖30～40g/l以及氯化钠0.05～4g/l，c组(秋季)：芸豆粉12～30g/l、糯米粉2～5g/l、银杏粉2～5g/l、莲藕粉2～5g/l、葡萄糖30～40g/l以及氯化钠0.05～4g/l，d组(冬季)：芸豆粉12～30g/l、红薯粉2～5g/l、冬枣粉2～5g/l、青稞粉2～5g/l、葡萄糖30～40g/l以及氯化钠0.05～4g/l，将各组混合粉经高温灭菌后加入无菌发酵罐内，再加入适量去离子水，在磁场强度为500～550gs的磁场下，以100r/min的速度搅拌12h，即得生产纳豆激酶的离子培养基；(3)纳豆芽孢杆菌株被接种于离子培养基中，于36～37℃，磁场强度为500～550gs的振荡器摇瓶中，100～120r/min振荡培养8～12h，制得发酵种子；(4)按3～10％的接种比，将发酵种子投入步骤(2)中无菌发酵罐内，在管内压力为0.1mpa，每公斤发酵液的空气输入量为0.1m3/min，磁场强度为500～550gs的环境下，以100r/min的速度搅拌一段时间后，持续发酵培养24h；(5)持续发酵过程中，每两个小时对发酵液进行取样，测定丝氨酸酶活性值，当酶活性值达到20000u/ml时，加大磁场强度至5000gs，约束微生物活性和代谢能力，使其停止发酵；(6)发酵停止后，在24h以内进行干燥处理。优选的，所述步骤(1)中lb液体培养基包括以下质量的成分：葡萄糖30～40g/l，蛋白胨5～7g/l，mgso4·7h2o2～5g/l，谷氨酸8～10g/l，亮氨酸8～10g/l。优选的，所述步骤(3)中lb固体培养基包括以下质量的成分：葡萄糖30～40g/l，蛋白胨5～7g/l，mgso4·7h2o2～5g/l，谷氨酸8～10g/l，亮氨酸8～10g/l，琼脂3～5g/l。优选的，所述步骤(6)中干燥处理为浓缩发酵液后，于温度-20～30℃，真空度25～100pa条件下冷冻真空干燥。优选的，所述步骤(1)～(6)中，所有培养基存在环境均为人工受控磁场强度，确保微生物于受控磁场下生长和代谢。与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、本发明根据不同的四季季节制备不同的发酵培养基配方，使微生物克服不同季节的温度、生物磁场以及微生物代谢活性变化的不利因素，保证了纳豆激酶生产的稳定性，提升微生物不同季节的营养需求；2、本发明整个发酵过程在受控磁场环境下进行，通过磁场辅助作用，不仅加快了纳豆发酵的速度，而且提升了对培养基的转化率，进而提升了纳豆激酶的产量和活性值；3、本发明中发酵成品所含纳豆激酶活性高于市场产品活性，实测可达100000u/g以上。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。本发明中纳豆激酶活性值作为评价指标，其测定方法为：将酪蛋白溶液水浴预热5min，向酪蛋白溶液中加入三氯乙酸，静置后离心分离，取上清液，加入碳酸钠溶液，再加入folin—酚乙液，摇匀显色，于405nm波长处比色定量测定nk活性值。实施例一一种磁约束离子四季培养基制备纳豆激酶的方法，包括以下步骤：(1)将不同品种的纳豆放置于不同锥形瓶中，并添加无菌水至30ml，在磁场强度为500～550gs的磁场下，锥形瓶放入37℃摇床中振摇30min，取出后水浴沸煮5min，冷却后稀释涂布lb固体培养基，37℃培养过夜，挑取经培养后lb平板培养基上的单菌落点于酪蛋白初筛平板，37℃培养过夜，选取透明圈直径与菌落直径比大者转接至lb液体培养基中，得纳豆芽孢杆菌株；(2)按照以下质量的成分称取各组分：芸豆粉12～30g/l、绿豆粉9～15g/l、桑叶粉2～5g/l、麦苗粉2～5g/l、葡萄糖30～40g/l以及氯化钠0.05～4g/l，将各组分混合后经高温灭菌加入无菌发酵罐内，再加入适量去离子水，在磁场强度为500～550gs的磁场下，以100r/min的速度搅拌12h，即得生产纳豆激酶的a组(春季)离子培养基；(3)纳豆芽孢杆菌株被接种于a组离子培养基中，于36～37℃，磁场强度为500～550gs的振荡器摇瓶中，100～120r/min振荡培养8～12h，制得发酵种子；(4)按3～10％的接种比，将发酵种子投入步骤(2)中无菌发酵罐内，在管内压力为0.1mpa，每公斤发酵液的空气输入量为0.1m3/min，磁场强度为500～550gs的环境下，以100r/min的速度搅拌一段时间后，持续发酵培养24h；(5)持续发酵过程中，每两个小时对发酵液进行取样，测定丝氨酸酶的活性值，当酶活性值达到20000u/ml时，加大磁场强度至5000gs，约束微生物活性和代谢能力，使其停止发酵；(6)发酵停止后，在24h以内浓缩发酵液后，于温度-20～30℃，真空度25～100pa条件下冷冻真空干燥。其中，所述步骤(1)中lb固体培养基包括以下质量的成分：葡萄糖30～40g/l，蛋白胨5～7g/l，mgso4·7h2o2～5g/l，谷氨酸8～10g/l，亮氨酸8～10g/l，所述步骤(3)中lb固体培养基包括以下质量的成分：葡萄糖30～40g/l，蛋白胨5～7g/l，mgso4·7h2o2～5g/l，谷氨酸8～10g/l，亮氨酸8～10g/l，琼脂3～5g/l。a组纳豆激酶活性值见表1。实施例二与实施例一的步骤相同，所不同的是：步骤(2)中按照以下质量的成分称取各组分：芸豆粉12～30g/l、赤豆粉9～15g/l、苦瓜粉2～5g/l、西红柿粉2～5g/l、葡萄糖30～40g/l以及氯化钠0.05～4g/l，并标记为生产纳豆激酶的b组(夏季)离子培养基。b组纳豆激酶活性值见表1。实施例三与实施例一的步骤相同，所不同的是：步骤(2)中按照以下质量的成分称取各组分：芸豆粉12～30g/l、糯米粉2～5g/l、银杏粉2～5g/l、莲藕粉2～5g/l、葡萄糖30～40g/l以及氯化钠0.05～4g/l，并标记为生产纳豆激酶的c组(秋季)离子培养基。c组纳豆激酶活性值见表1。实施例四与实施例一的步骤相同，所不同的是：步骤(2)中按照以下质量的成分称取各组分：芸豆粉12～30g/l、红薯粉2～5g/l、冬枣粉2～5g/l、青稞粉2～5g/l、葡萄糖30～40g/l以及氯化钠0.05～4g/l，并标记为生产纳豆激酶的d组(冬季)离子培养基。d组纳豆激酶活性值见表1。表1不同实施例中纳豆激酶的活性值处理方式纳豆激酶活性值/(u/g)实施例一/a组98344实施例二/b组100000实施例三/c组95342实施例四/d组89251市售纳豆激酶20000由表1可知，经本发明中四季培养基发酵后的纳豆激酶活性值几乎相等，且均优于市售纳豆激酶活性值。当前第1页12