一种定位线粒体的RNA荧光探针的制作方法

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种rna荧光探针，尤其涉及一种能够定位线粒体的rna荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术

生物细胞内存在着各种各样的细胞器，它们有着特殊的生理功能，对生命过程起着至关重要的作用。线粒体是众多的细胞器中一个非常重要的动态细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被誉为细胞的“动力工厂”，在细胞生命活动中起着重要的作用。线粒体在细胞生理和稳态中起着至关重要的作用。线粒体功能障碍会导致固有的凋亡途径，导致各种神经退行性疾病。因此，要进一步了解线粒体功能，就需要在体内成像线粒体。

核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称rna）和脱氧核糖核酸（简称dna），在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。dna是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础。rna在蛋白质合成过程中起着重要作用——其中转运核糖核酸，简称trna，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mrna，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称rrna，是细胞合成蛋白质的主要场所。

rna主要存在细胞核的核仁去和细胞质中，其在生物体的生长、发育及凋亡的整个过程都起着重要的调控作用，并且许多疾病的发生都与rna有关。同时，rna的定位、活动、多寡、形态等包含着重要的生命科学信息。目前，与众多商业探针相比，只有分子探针公司提供的典型的商业探针sytorna-select可用于rna成像。因此，发展新型结构和功能的rna探针是非常有必要的。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种定位线粒体的rna荧光探针，该探针选择性好、可专一识别rna，并定位线粒体。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种定位线粒体的rna荧光探针，简称mpi，其化学结构式如式（i）所示：

式（i）。

其中，吡啶盐作为线粒体定位基团，通过探针与rna沟槽区域的嵌合作用识别rna分子。

一种上述rna荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）将4-甲基吡啶（1）与碘甲烷在甲醇中加热回流；反应结束后冷却至室温，将溶剂蒸干，所得固体用乙醚洗涤后过滤，得到黄色固体，即化合物2：

；

（2）化合物2和化合物3在甲醇中，以哌啶为催化剂，保护气氛下加热回流反应；反应结束后冷却到室温，乙酸乙酯萃取，萃取液用二氯甲烷和甲醇混合溶液为淋洗液过层析柱，得rna荧光探针：

。

步骤（1）中，所述4-甲基吡啶与碘甲烷的摩尔比为1:1-1.2。反应时间为12-20h。

步骤（2）中，所述化合物2与化合物3的摩尔比为1-1.2:1。反应时间为10-15h。

步骤（2）中，所述淋洗液中二氯甲烷与甲醇的体积比为10:1。

一种上述rna荧光探针在检测溶液或细胞中rna的应用。

本发明的有益效果为：

本发明所述的定位线粒体的rna荧光探针是一种新型的识别rna并定位线粒体的荧光探针分子，该探针合成路径简便，易于应用。可以单一性识别rna，实现检测rna的作用，并可以定位在线粒体。

附图说明

图1是荧光探针mpi的¹hnmr图谱；

图2是荧光探针mpi对rna/dna的响应；

图3是荧光探针mpi的选择性；

图4是荧光探针mpi对活细胞成像图像；

图5是荧光探针mpi对固定细胞成像图像；

图6是荧光探针mpi对rnase处理后固定细胞成像图像；

图7是荧光探针mpi与商业探针mtr对线粒体的共定位荧光成像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1rna荧光探针mpi的合成

（1）将1.0g(10.7mmol)的4-甲基吡啶（1），溶于20ml甲醇中，将碘甲烷0.7ml(10.7mmol)滴加至混合液中，加热回流15h，反应体系由淡黄色变为黄色。反应结束后冷却至室温，将溶剂蒸干，所得固体用乙醚洗涤过滤得到黄色固体（2）：

；

（2）将0.28g(1.2mmol)化合物2和0.11g(1mmol)化合物3，溶于20ml甲醇中，加入3滴哌啶做催化剂，在氮气保护下回流反应12h。反应结束后，冷却到室温，ea萃取，用dcm：meoh（10:1）淋洗液过柱提纯得黄色固体（荧光探针mpi），其¹hnmr图谱见图1：

。

实施例2荧光探针mpi对rna/dna的响应

配制实施例1中制备的荧光探针mpi的dmf母液，浓度为1mm。然后分别取5μl探针母液加入5ml容量瓶中，每个容量瓶中加入同浓度不同体积的rna或dna溶液，最后用hepes缓冲液定容到5ml，使rna或dna的浓度与探针浓度的当量比分别为0，26，52，78，104，156，208，260，312，364，416，468，572，624，676，728，780，832，884，936，988，1040，1092。然后进行荧光检测（激发波长460nm）。以rna或dna的浓度为横坐标，以525nm处相对荧光强度为纵坐标作图2；由图2可知，rna或dna的浓度与探针浓度的当量比均为1092时，与探针本身的相对荧光强度相比，加入rna后荧光强度增强了6倍，而加入同当量的dna只增强了两倍。

实施例3荧光探针mpi的选择性

配制实施例1中制备的荧光探针mpi的dmf母液，浓度为1mm；再稀释为浓度为1μm的稀释液。取5ml的mpi稀释液，加入探针和各种干扰物质（氨基酸：arg、ser、ile、phe、asp、val、ala、his、thr；gsh、hcy、glucose，s2o3^2-；醋酸，no2^-，n3^-，br^-；ca²⁺，k⁺，na⁺，al³⁺，fe²⁺，cu²⁺；g-m（抗体），lps（脂多糖），fbs（胎牛血清蛋白））的溶液，再以pbs缓冲液定容，使探针和各种干扰物质的最终浓度分别为1mm，然后进行荧光检测（激发460nm）；不同干扰物质525nm处的相对荧光强度如图3所示。图3结果表明，加入rna后，探针响应倍数为探针本身的6倍左右，探针mpi对rna具有高选择性。

实施例4荧光探针mpi对活细胞的荧光成像

配制实施例1中制备的荧光探针mpi的dmf母液，浓度为1mm。再取20μl用1ml培养基稀释，得终浓度为20μm的探针稀释液。

将接种好的细胞在探针稀释液中37℃孵育30min，用pbs洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长488nm，发射波段500-550nm），结果如图4所示：荧光探针mpi能够染色活细胞的细胞质和核仁，发出绿色荧光。

实施例5荧光探针mpi对固定细胞的荧光成像

配制实施例1中制备的荧光探针mpi的dmf母液，浓度为1mm。再取20μl母液用培养基稀释至1ml，得终浓度为20μm的探针稀释液。

将接种好的细胞用1ml多聚甲醛处理30min后用pbs洗3次，然后用0.5ml5%的tritontmx-100处理3min，最后在探针稀释液中室温孵育30min，用pbs洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长488nm，发射波段500-550nm），结果如图5所示：荧光探针mpi能够染色固定细胞的细胞质和核仁，发出绿色荧光。

实施例6荧光探针mpi对rnase处理后固定细胞的荧光成像

配制实施例1中制备的荧光探针mpi的dmf母液，浓度为1mm。再取20μl母液用培养基稀释至1ml，得终浓度为20μm的探针稀释液。

将接种好的细胞用1ml多聚甲醛处理30min后用pbs洗3次，然后用0.5ml5%的tritontmx-100处理3min，再加入3μl的rnase（5mg/ml）处理2h，最后在探针稀释液中室温孵育30min，用pbs洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（激发波长488nm，发射波段500-550nm），结果如图6所示：与图5相比，用rnase处理固定细胞后，细胞内的绿色荧光明显变弱。

实施例7荧光探针mpi与商业探针mtr定位于线粒体的荧光成像

配制实施例1中制备的荧光探针mpi的dmso母液，浓度为1mm。再取5μl母液用培养基稀释至1ml，得终浓度为5μm的探针稀释液。

商业探针mtr配制为1mm的dmso母液。再取1μl母液用培养基稀释成终浓度为1μm的探针稀释液。

分别将接种好的细胞在两种探针稀释液中37℃孵育30min，用pbs洗3次，贴壁生长的细胞置于载玻片上；然后用荧光显微镜进行明场成像与荧光成像（mpi激发波长488nm，发射波段500-550nm；mtr激发波长561nm，发射波段570-620nm），结果如图7所示：商业探针mtr能够定位线粒体中，发出红色荧光；荧光探针mpi能够在线粒体中发出绿色荧光；两者的荧光图像叠加后计算得共定位系数达0.8以上，说明探针mpi能够成功定位于线粒体中。