本发明涉及一种d-氨基酸的制备方法。
背景技术：
自然界存在20种氨基酸，均为l-型氨基酸，它们是组成蛋白质的基本结构单元。所以，一般认为d-氨基酸在自然界中极少存在，近年来，随着科学研究的深入，人们发现d-氨基酸虽然不是构成蛋白质的基本结构氮源，但许多植物、微生物和高等植物中都有d-氨基酸的存在。研究结果显示d-型氨基酸在生命活动和药物制备中具有l-氨基酸所不能替代的地位，是重要的药物合成中间体和食品添加剂，被广泛应用于生产半合成抗体、激素、生物活性多肽和化学杀虫剂。特别是作为半合成抗生素的侧链原料，d-型氨基酸更受到学术界和产业界的关注。
目前d-型氨基酸的应用领域主要是：1.医药方面。用于合成多肽药物，如多肽抗生素（阿扑西林aspoxicillin），肠胃药（oxtreotide），利尿药，腹泻药（善得定sandostatinacetate），酶抑制剂，促皮质素类似物，止痛镇痛药，减肥药，ⅱ型糖尿病治疗药（那格列奈nateglinide）等。2.食品方面。天苯二肽（阿斯巴甜），天丙二肽（阿力甜）等新型甜味剂。d-型氨基酸还可用于食品调味剂、保鲜剂、防腐剂、食品发色剂、食品香料等产品。3.农药方面。氨基酸农药无需大面积使用，不但可减少人力物力和药用量，且具有毒性低、高效无公害，易被降解利用，原料来源广泛等特点，成为新型农药研究热点。4.科学研究。通过研究生物体内氨基酸d，l-异构体含量的改变，可作为年带记时器进行气候、水文研究。d-氨基酸还可用于酶的结构-功能分析方面的研究。
不对称转换是制备d-氨基酸的主要方法，根据制备手段和途径不同可分为化学不对称转换和生物不对称转换。根据初始原料不同可分为：不对称合成方法直接制备；合成外消旋体后拆分；由l-氨基酸或消旋氨基酸通过不对称转换制备。其中，现在国内外普遍使用的方法是先用化学法合成外消旋体，再进行拆分制备d-氨基酸。
化学法生产d-氨基酸的反应条件相对比较剧烈、污染大、产率低且费用高，因此不适合大规模生产。而发展较快并且最具有应用潜力的是生物制备方法。在生物制备方法中，根据初始原料不同，目前研究较多的分为以下几种：
1、以消旋的dl-氨基酸或衍生物为原料，用完整的微生物细胞或从微生物细胞中提取的酶作为催化剂，使氨基酸或其衍生物水解。由于生物催化剂的立体选择性强，只能选择性的水解某一旋光氨基酸或其衍生物，另一种不被水解或水解很少。因此，两种旋光氨基酸具有不同的结合形态，也就具有不同的理化性质，可以方便的借助于物理、化学手段加以分离。n-乙酰-氨基酰化酶（n-acyl-d-amioacidamidohydrolase）是拆分dl-型氨基酸制备d-氨基酸的主要酶类之一。从文献报道来看，大多数氨基酰化酶最适合的底物多为中性氨基酸。廖本仁等以dl-乙酰色氨酸为底物用氨基酰化酶拆分得到l-型色氨酸。没有被酶解的n-乙酰-d-色氨酸，再用盐酸水解得到d-色氨酸。d-色氨酸和l-色氨酸的收率和光学纯度都可以达到98％以上。
2、首先制备某一外消旋中间体，通过微生物体产生的水解酶和消旋酶在一定条件下使外消旋中间体向d-氨基酸转化。这一方面研究的比较多的是5-取代海因，5-取代海因在海因水解酶和氨甲酰基水解酶的作用下，生成相应的d-氨基酸。kyriakos等利用含d-海因酶和n-氨甲酰基-d-氨基酸水解酶的微生物一步转化dl-对羟基苯海因为d-对羟基苯甘氨酸，两步酶反应过程的理论收率可达100％。日本的ajinomoto、德国的bayer公司、荷兰的dsm等公司都在用海因酶法生产d-对羟基苯甘氨酸，其规模已达到几千吨/年。除此之外，海因酶法还可以用于制备d-色氨酸、d-缬氨酸等。
3、以来源广泛、价格相对便宜的l-型氨基酸为起始原料，在酶的催化作用下不对称转换为d-型氨基酸。yagasaki等分别构建了两株具有消旋酶活性和脱羧酶活性的重组菌株，l-氨基酸经消旋后得到dl-氨基酸，然后再拆分得到d-氨基酸，通过此方法得到的d-谷氨酸和d-脯氨酸ee值达到99％以上，但收率不到50％。ian等研究发现，l-氨基酸经过脱氨作用形成酮酸，酮酸在d-氨基酸氨基转移酶的作用下可生成d-氨基酸，根据此原理，构建具有l-氨基酸脱氨酶活性和d-氨基酸转氨酶活性的基因工程菌，能够不对称转换多种l-型氨基酸，其中亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸的收率和ee值均在90％以上。
以上的几种方法，都存在一定缺点或是对部分氨基酸不适用，或则是生产不经济。如海茵酶法在先合成底物海茵时用到有毒化学物质，会污染环境，而且海茵酶法对大部分d-氨基酸不适用。转氨酶法：转氨酶酶活普遍偏低，而且需要氨基供体，需要先制备酮酸。还有其它一些方法都存在一定的局限性。
上述方法中n-乙酰-d-氨基酰化酶（n-acyl-d-amioacidamidohydrolase）拆分dl-型n-乙酰氨基酸制备d-氨基酸方法。传统方案是n-乙酰-d-氨基酰化酶水解n-乙酰-d-型氨基酸制备d-氨基酸，剩余的n-乙酰-l-型氨基酸需要再次化学消旋。或则是采用n-乙酰氨基酸消旋酶消旋后再水解。而且未见报道采用固定化n-乙酰-d-氨基酰化酶和固定化n-乙酰氨基酸消旋酶进行生产d-氨基酸。并且存在副产物乙酸钠抑制消旋酶的缺点，造成产物浓度低，生产成本高的问题。
技术实现要素：
本发明克服现有d-氨基酸生物方法制备中存在的上述问题，提供一种d-氨基酸的制备方法，利用固定化d-氨基酰化酶和n-乙酰氨基酸消旋酶，实用性广，无污染、产物浓度高，生产成本低。
本发明采用如下的技术方案：一种d-氨基酸的制备方法，以d-氨基酰化酶和n-乙酰氨基酸消旋酶为酶催化剂，n-乙酰氨基酸为底物原料。
一种d-氨基酸的制备方法，包括如下步骤：1、重组菌构建：克隆n-乙酰-d-氨基酰化酶基因，基因连入pet系列载体或pkk223-3载体，转化至bl21(de3)宿主菌，构建d酰化酶重组菌（nlase）；克隆n-乙酰-氨基酸消旋酶基因，基因连入pet系列载体或pkk223-3载体，转化至bl21(de3)宿主菌，构建n-乙酰氨基酸消旋酶重组菌（naar）；2、重组菌发酵；3、固定化酶制备；4、固定化酶转化联合膜分离；5、产品结晶。
作为优选，n-乙酰-d-氨基酰化酶基因来源于反硝化产碱菌（alcaligenesdenitrificans）或米曲霉（aspergillusoryzae）或水杆菌属（defluvibacter）或菌寄生属嗜温菌（hypomycesmycophilus）或嗜中温甲基杆菌（methylobacteriummesophilicum）或西贝属（sebekia）或嗜麦芽寡养单胞菌（stenotrophomonasmaltophilia）或链霉菌（streptomyces）或木霉属（trichodermasp.）。
作为优选，n-乙酰-氨基酸消旋酶基因来源于sebekiabenihana或amycolatopsisorientalissubspecieslurida或amycolatopsisazurea或耐辐射奇球菌（deinococcusradiodurans）或geobacilluskaustophilus或defluvibacter或alcaligenesxylosoxydanssubsp.xylosoxydans。
作为优选，重组菌发酵的具体步骤包括：
(1)菌种活化：从甘油管或牛奶管接菌至kanlb琼脂平板，37℃培养12-14h。
(2)一级种子：从平板上挑取单菌至4mllb试管，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养过夜（16h）。
(3)二级种子：取新鲜菌液按2%接种量接种于lb（100ml/500ml）摇瓶，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养3.0-3.5h，od600为1.0左右。
(4)1l/5l的tb发酵：二级种子2%-10%的接种量接入tb培养基（1l/5l发酵摇瓶），加kan至25mg/l，37℃，220rpm，培养3h，开始降温25℃；加iptg至终浓度（0.1mm），220rpm，25度，培养过夜。
(5)发酵20-24h，3500rpm*25min离心收集菌体，菌置-30℃冰箱冷冻24h。
作为优选，固定化酶制备的具体操作步骤包括：
1）菌体加3倍体积的水，用高压均质机压榨破胞两次；
2）高速离心，获得上清酶液；
3）酶液加入菌体量50%-200%的固定化载体ep200，20-30℃震荡混合12-24h；
4）过滤，收集固定化粗酶，用磷酸钾缓冲液（20-100mm，ph7-8.5）洗涤多次，过滤，得固定化酶。
作为优选，固定化酶转化及膜分离的具体步骤：称取底物n-乙酰-l-氨基酸，加水溶解，调ph6-9，控制温度30-45℃，加入固定化酶nlase和固定化酶naar，加入氯化钴至终浓度为0.1-1mmol/l浓度，100-300rpm搅拌反应，反应完成后，滤液通过90-150nm的纳滤膜处理，副产物乙酸钠大部分透出，而底物和产物d-氨基酸被截留，截留液返回反应器继续反应直至底物完全水解为d-氨基酸。
作为优选，酶催化反应结束后，通过三足式离心机回收固定化酶（4℃保存用于下次转化），离心清液加活性炭脱色并过滤，滤液浓缩结晶，晶体干燥，得产品。
采用可反复多次使用的固定化酶并结合在线并行膜分离技术，降低了酶的成本，减少了副产物乙酸对消旋酶的抑制。同时由于转化液杂质很少，分离纯化简单，收率高，产品品质好，得到的d-氨基酸e.e.值达99.9%以上，含量99%以上，摩尔收率85%以上。
具体实施方式
实施例1：
1.重组菌构建
克隆来源于aspergillusoryzae的n-乙酰-d-氨基酰化酶，基因连入pet41a载体（novagen公司）或pkk223-3载体，转化至bl21(de3)宿主菌，构建d酰化酶重组菌（nlase）。
克隆来源于sebekiabenihana的n-乙酰-氨基酸消旋酶，基因连入pet41a载体（novagen公司），转化至bl21(de3)宿主菌，构建n-乙酰氨基酸消旋酶重组菌（naar）。
2.重组菌发酵制备酶
重组菌nlase和naar采用tb进行发酵。
1)培养基
(1)lb：
(2)琼脂lb-kan平板(g/l)：
注：培养基灭菌冷却至50-60℃，100mllb加100μlkan溶液（100mg/ml），混匀，倒平板（25-30ml/6cm平皿）。
(3)tb(g/l)：
2)发酵流程
(1)菌种活化：将重组菌nlase和naar分别接菌至kanlb琼脂平板，37℃培养12-14h。
(2)一级种子：从平板上挑取单菌至4mllb试管，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养过夜（16h）。
(3)二级种子：取新鲜菌液按2%接种量接种于lb（100ml/500ml）摇瓶，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养3.0-3.5h，od600为1.0左右。
(4)1l/5l的tb发酵：二级种子2%-10%的接种量接入tb培养基（1l/5l发酵摇瓶），加kan至25mg/l，37℃，220rpm，培养3h，开始降温25℃；加iptg至终浓度（0.1mm），220rpm，25度，培养过夜。
(5)发酵24h，3500rpm*25min离心收集菌体，菌置-30℃冰箱冷冻24h。
3.固定化酶制备
1）菌体加3倍体积的水，用高压均质机压榨破胞两次；
2）高速离心，获得上清酶液；
3）酶液加入菌体量50%的固定化载体ep200，20℃震荡混合12-24h；
4）过滤，收集固定化粗酶，用磷酸钾缓冲液（20mm，ph7）洗涤多次，过滤，得固定化酶。
4.固定化酶转化联合膜分离
在10l反应容器中，根据溶解度称取一定量的底物n-乙酰-l-氨基酸，加7l水溶解，调ph6，控制温度30℃，加入一定量的固定化酶nlase和固定化酶naar，加入氯化钴至终浓度为0.1mmol/l浓度，100rpm搅拌反应，反应过程中可以根据底物和产物的溶解度，添加底物。反应一段时间，拧开反应器底部侧面管道阀门，管道口有双层滤网截留固定化酶。滤液通过90nm的纳滤膜处理，副产物乙酸钠大部分透出，而底物和产物d-氨基酸被截留。截留液返回反应器继续反应直至底物完全水解为d-氨基酸。
5.产品结晶
酶催化反应结束后，通过三足式离心机回收固定化酶（4℃保存用于下次转化），离心清液加活性炭脱色并过滤，滤液浓缩结晶，晶体干燥，e.e.值达99.9%，含量99%，摩尔收率86%。
实施例2：
1.重组菌构建
克隆来源于alcaligenesdenitrificans的n-乙酰-d-氨基酰化酶，基因连入pkk223-3载体（novagen公司）或，转化至bl21(de3)宿主菌，构建d酰化酶重组菌（nlase）。
克隆来源于amycolatopsisazurea的n-乙酰-氨基酸消旋酶，基因连入pet28a载体（novagen公司），转化至bl21(de3)宿主菌，构建n-乙酰氨基酸消旋酶重组菌（naar）。
2.重组菌发酵制备酶
重组菌nlase和naar采用tb进行发酵。
1)培养基
同实施例1。
2)发酵流程
(1)菌种活化：将重组菌nlase和naar分别接菌至kanlb琼脂平板，37℃培养12-14h。
(2)一级种子：从平板上挑取单菌至4mllb试管，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养过夜（16h）。
(3)二级种子：取新鲜菌液按2%接种量接种于lb（100ml/500ml）摇瓶，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养3.0-3.5h，od600为1.0左右。
(4)1l/5l的tb发酵：二级种子2%-10%的接种量接入tb培养基（1l/5l发酵摇瓶），加kan至25mg/l，37℃，220rpm，培养3h，开始降温25℃；加iptg至终浓度（0.1mm），220rpm，25度，培养过夜。
(5)发酵20h，3500rpm*25min离心收集菌体，菌置-30℃冰箱冷冻24h。
3.固定化酶制备
1）菌体加3倍体积的水，用高压均质机压榨破胞两次；
2）高速离心，获得上清酶液；
3）酶液加入菌体量100%的固定化载体ep200，20℃震荡混合24h；
4）过滤，收集固定化粗酶，用磷酸钾缓冲液（100mm，ph8.5）洗涤多次，过滤，得固定化酶。
4.固定化酶转化联合膜分离
在10l反应容器中，根据溶解度称取一定量的底物n-乙酰-l-氨基酸，加7l水溶解，调ph8，控制温度45℃，加入一定量的固定化酶nlase和固定化酶naar，加入氯化钴至终浓度为0.5mmol/l浓度，200rpm搅拌反应，反应过程中可以根据底物和产物的溶解度，添加底物。反应一段时间，拧开反应器底部侧面管道阀门，管道口有双层滤网截留固定化酶。滤液通过100nm的纳滤膜处理，副产物乙酸钠大部分透出，而底物和产物d-氨基酸被截留。截留液返回反应器继续反应直至底物完全水解为d-氨基酸。
5.产品结晶
酶催化反应结束后，通过三足式离心机回收固定化酶（4℃保存用于下次转化），离心清液加活性炭脱色并过滤，滤液浓缩结晶，晶体干燥，e.e.值达99.9%，含量99%，摩尔收率88%。
实施例3：
1.重组菌构建
克隆来源于alcaligenesdenitrificans的n-乙酰-d-氨基酰化酶，基因连入pet28a载体（novagen公司），转化至bl21(de3)宿主菌，构建d酰化酶重组菌（nlase）。
克隆来源于deinococcusradiodurans的n-乙酰-氨基酸消旋酶，基因连入pet28a载体（novagen公司），转化至bl21(de3)宿主菌，构建n-乙酰氨基酸消旋酶重组菌（naar）。
2.重组菌发酵制备酶
重组菌nlase和naar采用tb进行发酵。
1)培养基
同实施例1。
2)发酵流程
(1)菌种活化：将重组菌nlase和naar分别接菌至kanlb琼脂平板，37℃培养14h。
(2)一级种子：从平板上挑取单菌至4mllb试管，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养过夜（16h）。
(3)二级种子：取新鲜菌液按2%接种量接种于lb（100ml/500ml）摇瓶，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养3.0-3.5h，od600为1.0左右。
(4)1l/5l的tb发酵：二级种子2%-10%的接种量接入tb培养基（1l/5l发酵摇瓶），加kan至25mg/l，37℃，220rpm，培养3h，开始降温25℃；加iptg至终浓度（0.1mm），220rpm，25度，培养过夜。
(5)发酵24h，3500rpm*25min离心收集菌体，菌置-30℃冰箱冷冻24h。
3.固定化酶制备
1）菌体加3倍体积的水，用高压均质机压榨破胞两次；
2）高速离心，获得上清酶液；
3）酶液加入菌体量200%的固定化载体ep200，25℃震荡混合20h；
4）过滤，收集固定化粗酶，用磷酸钾缓冲液（100mm，ph7）洗涤多次，过滤，得固定化酶。
4.固定化酶转化联合膜分离
在10l反应容器中，根据溶解度称取一定量的底物n-乙酰-l氨基酸，加7l水溶解，调ph9，控制温度45℃，加入一定量的固定化酶nlase和固定化酶naar，加入氯化钴至终浓度为1mmol/l浓度，100rpm搅拌反应，反应过程中可以根据底物和产物的溶解度，添加底物。反应一段时间，拧开反应器接近底部的侧面管道阀门，管道口有双层滤网截留固定化酶。滤液通过150nm的纳滤膜设备处理，副产物乙酸钠大部分透出，而底物和产物d-氨基酸被截留。截留液返回反应器继续反应直至底物完全水解为d-氨基酸。
5.产品结晶
酶催化反应结束后，通过三足式离心机回收固定化酶（4℃保存用于下次转化），离心清液加活性炭脱色并过滤，滤液浓缩结晶，晶体干燥，e.e.值达99.9%，含量99%，摩尔收率90%。