大豆生育期QNE1基因及其编码蛋白和应用的制作方法

本发明涉及一种大豆生育期基因及其编码蛋白和应用。
背景技术：
大豆不仅是世界上70％可食用蛋白的来源，也是生物柴油的新兴原料，但大豆属于典型的短日照作物，故大豆的产量和品种的适宜种植范围与其生育期密切相关。迄今已发现了10个主要影响大豆开花期和成熟期(生育期)基因位点e1—e9和j，然而有些大豆开花期的差异仍然不能很好地阐释。因此发现新的大豆生育期基因对于大豆产量的研究具有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种大豆生育期qne1基因及其编码蛋白和应用。本发明大豆生育期qne1基因的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。本发明大豆生育期qne1基因编码蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。本发明大豆生育期qne1基因在延迟大豆开花中的应用。本发明是利用绥农10号×岩姬及中黄13×黑农51分别杂交获得的两个f2代遗传群体，其父母本基因型均为e1遗传背景但f2代开花期却出现分离。本发明通过f2代基因芯片测序在6号染色体e1附近检测到一个大豆生育期的新qtl，通过f3代及f4代精细定位，成功地将大豆生育期qne1基因定位于e1上游区域，并确定候选基因为glyma.06g204300。本发明获得的qne1基因编码区全长序列1173bp，本发明获得的qne1基因翻译的蛋白质具有390个aa。同时，生物信息学表明本发明的qne1基因是转录因子，且通过注射烟草亚细胞定位结果显示qne1基因定位于细胞核内。该基因在氨基酸序列57～115区域存在着一个tcp结构域的区域，从大豆岩姬和中黄13中所克隆的该基因在碱基1063处都含有一个碱基的相同的非同义突变，由碱基c变为t。通过两个群体基因型与表型的情况，共同验证了qne1基因具有延迟大豆开花的生理功能，与大豆生产适应性密切相关，对于揭示大豆的光周期分子调节机制，实现将来的分子设计育种具有重要的指导作用。附图说明图1为绥农10号×岩姬遗传群体f2代开花情况；图2为中黄13×黑农51遗传群体f2代开花情况；图3为e4基因型鉴定；图4为e4-kam背景下，绥农10号×岩姬遗传群体f2:3代重组体基因型；图5为e4-kam背景下，绥农10号×岩姬遗传群体f2:3代的后代花期的精细定位分析；图6为e4背景下，绥农10号×岩姬遗传群体f2:3代重组体基因型；图7为e4背景下，绥农10号×岩姬遗传群体f2:3代的后代花期的精细定位分析；图8为中黄13×黑农51遗传群体f2:3代重组体；图9为中黄13×黑农51遗传群体f2:3代的后代基因型及花期的精细定位；图10为绥农10号，岩姬和中黄13，黑农51在qne1(glyma.06g204300)上dcaps分子标记d90基因型鉴定结果；其中1为酶切后岩姬，2为酶切后绥农10，3为未酶切岩姬，4为未酶切绥农10，5为酶切后中黄13，6为酶切后黑农51，7为未酶切中黄13，8为未酶切黑农51；图11为绥农10号，岩姬和中黄13，黑农51在qne1(glyma.06g204300)上dcaps分子标记d06-91基因型鉴定结果；其中1为酶切后岩姬，2为酶切后绥农10，3为未酶切岩姬，4为未酶切绥农10，5为酶切后中黄13，6为酶切后黑农51，7为未酶切中黄13，8为未酶切黑农51；图12为gfp未融合qne1基因的瞬时表达载体结构示意图；图13为gfp融合qne1基因的瞬时表达载体结构示意图；图14为gfp未融合qne1基因的激光共聚焦显微镜gfp通道下的亚细胞定位影像图；图15为gfp未融合qne1基因的激光共聚焦显微镜chlorophyll通道下的亚细胞定位影像图；图16为gfp未融合qne1基因的激光共聚焦显微镜明视野下的亚细胞定影像位图；图17为gfp未融合qne1基因的激光共聚焦显微镜gfp通道、chlorophyll通道与明视野融合后的亚细胞定位影像图；图18为gfp融合qne1基因的激光共聚焦显微镜gfp通道下的亚细胞定位影像图；图19为gfp融合qne1基因的激光共聚焦显微镜chlorophyll通道下的亚细胞定位影像图；图20为gfp融合qne1基因的激光共聚焦显微镜明视野下的亚细胞定位影像图；图21为gfp融合qne1基因的激光共聚焦显微镜gfp通道、chlorophyll通道与明视野融合后的亚细胞定位影像图。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式大豆生育期qne1基因的核苷酸序列如序列表中seqidno：1所示。具体实施方式二：本实施方式大豆生育期qne1基因编码蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。以下实施例中如无特别说明均为常规方法。实施例1：一、大豆生育期基因qne1的初定位以父母本基因型均为e1遗传背景但f2代生育期有差异的两个遗传群体绥农10号(e1/e2/e3t/e4)×岩姬(e1/e2/e3t/e4-kam)和中黄13(e1/e2/e3-mi/e4)×黑农51(e1/e2/e3-tr/e4)为研究对象，所有f2代子代均由父母本杂交后的f1代自交获得。对绥农10号×岩姬的281株，中黄13×黑农51的415株f2代个体进行开花期调查。调查显示：绥农10号×岩姬群体，中黄13×黑农51群体f2代开花期都存在严重的分离(如图1和图2)，预计该群体中存在着影响开花期的相关qtl。随后取绥农10号×岩姬及中黄13×黑农51的f2代个体叶片，液氮速冻后ctab法提取大豆叶片dna，通过dna芯片测序结合表型数据进行qtl定位分析。通过dna芯片测序结果发现在两个遗传群体绥农10号×岩姬和中黄13×黑农51的6号染色体上都定位到一个主效的qtl，qtl区间分别为17672411—41974978(275位置)和17453972—17672406(275位置)(见表1和表2)。表1绥农10号×岩姬的f2代开花期qtl定位分析表2中黄13×黑农51的f2代开花期qtl定位分析在绥农10号×岩姬遗传群体中该qtl区间比较大并且生育期e1基因也在该区间内，而在中黄13×黑农51遗传群体中该qtl则在生育期e1位置之前。然而，根据父母本e1基因pcr扩增产物鉴定结果，两个遗传群体父母本在e1基因编码区及启动子内无差异。这一结论同时也可通过父母本(绥农10号和岩姬)基因组重测序结果得以验证。因此，可以推测在两个遗传群体的6号染色体上分别定位到的花期相关的qtl是不同于e1的新的qtl，两个新的qtl是否为同一个有待进一步定位及分析。绥农10号和岩姬的开花期几乎一致，分别为35.0±2.1天和38.1±1.5天(见表3)，而由父母本基因型(绥农10号e1/e2/e3t/e4×岩姬e1/e2/e3t/e4-kam)可知，20号染色体上定位到的开花期qtl为e4。因绥农10号中存在延迟花期的e4基因，初步推测岩姬中存在着影响开花期的新基因，该新基因具有延迟开花期的功能。总之，绥农10号×岩姬在f2代6号染色体上定位的qtl是位于e1附近的一个新的影响花期的qtl。表3绥农10号和岩姬的r1及e1-e4基因型鉴定中黄13和黑农51开花期分别为76.4±2.3天和45.0±1.3天(见表4)，开花期相差较大，但父母本基因型基本相同，虽然在中黄13×黑农51遗传群体的13号染色体也检测到了一个花期相关的极小的qtl，但是否存在还需进一步验证。故中黄13×黑农51在f2代在6号染色体定位到的qtl应为影响其开花期差异的主效qtl。表4中黄13和黑农51的r1及e1-e4基因型鉴定二、分子标记开发及基因型鉴定根据父母本基因组重测序数据，利用igv软件，寻找父母本间有差异的片段和snp位点，分别设计成ssr、indel、dcap/dcaps引物，筛选父母本间有多态性的引物用于之后的基因精细定位。三、e4基因型鉴定绥农10号(e1/e2/e3t/e4)和岩姬(e1/e2/e3t/e4-kam)的开花期一致，但绥农10号存在延迟开花的e4基因，为了排除e4基因对开花期的影响，更好地定位6号染色体上的新qtl，根据在e4位点的基因型，把后代个体分成两组(e4，e4-kam)，分别在e4和e4-kam背景下，对新qtl位点进行定位和研究。使用引物e4-kamfw(见序列表seqidno：3)和e4-kamrv(见序列表seqidno：4)扩增基因组dna，pcr产物用aflii酶切，494bp为e4，aflii酶切为286bp和208bp条带的为e4-kam。(见图3所示)四、大豆生育期基因qne1的精细定位1、在绥农10号×岩姬遗传群体中根据绥农10号×岩姬遗传群体qne1初定位区间17672411—41974978(6号染色体，275位置)，利用筛选到的多态性分子标记对f2:3代群体共801个个体进行基因型鉴定。为排除生育期基因e4的影响，对e4和e4-kam两个遗传背景分别进行分析。图4-图7为绥农10号×岩姬遗传群体f3代重组体基因型及其后代花期的精细定位分析结果。其中，图4为e4-kam背景下，8个重要重组体不同分子标记处基因型数据(其中表示岩姬-qne1基因型，表示绥农10号-qne1基因型，表示杂合-h基因型)，图5为其后代田间表型(开花期)分离情况。图6为e4背景下，4个重要重组体不同分子标记处基因型数据(表示岩姬-qne1基因型，表示绥农10号-qne1基因型，表示杂合-h基因型)，图7为其后代田间表型(开花期)分离情况。结果显示，两个遗传背景(e4和e4-kam)下，引物d90、d100、d105、d81、d110鉴定的重组体基因型和开花期均完全对应，即具岩姬基因型(qne1)的后代整体表现为晚花，具绥农10号基因型(qne1)的后代整体表现为早花，同时具有父母本基因型的杂合型并且后代出现开花期分离现象，且符合3：1分离。据此，我们将qne1区间精细定位至标记d77和d82之间，对应的275位置为18883704—21251562，约2.37mb，该区间内包含基因glyma.06g202700—glyma.06g211900，共93个候选基因。对父母本进行全基因组重测序，根据重测序结果可知在93个候选基因中，本群体父母本间在基因编码区存在着有义突变的候选基因为9个，分别为glyma.06g202700、glyma.06g204000、glyma.06g204300、glyma.06g204500、glyma.06g205200、glyma.06g206100、glyma.06g208400、glyma.06g209800、glyma.06g21900。选择f3代群体中在初定位区间内杂合型个体种子进行种植，在f4代共得到1728株植株，筛选出了20株在18883704—21251562区间内重组的个体。绥农10号×岩姬遗传群体的f4代r1和精细定位分子标记基因型数据见表5，并结合f3代精细定位结果：与岩姬(b)基因型相同的表现为晚花，与绥农10号(a)基因型相同的表现为早花，从而可以将qtl区间由d77-d82缩小至分子标记d77-d81之间。表5绥农10号×岩姬f4代精细定位分子标记基因型利用ibmspssstatistics20软件对花期和基因型做相关显著性检测，结果如表6所示，分子标记d90与开花期显著相关，其显著性水平分别为0.018和0.000，从而将qtl区间由d77-d81缩小至分子标记d77和d100之间(对应275位置：18883704—19395996)，该范围内本群体父母本间存在差异的候选基因有5个：glyma.06g202700、glyma.06g204000、glyma.06g204300、glyma.06g204500、glyma.06g205200，其中在基因编码区有义突变的候选基因为2个：glyma.06g204000和glyma.06g204300。表6绥农10号×岩姬群体f4代分子标记与花期的相关显著性检测2、在中黄13×黑农51遗传群体中根据中黄13×黑农51遗传群体qne1初定位区间17453972—17672406(6号染色体，275位置)，利用筛选到的多态性分子标记对f2:3代群体共750个杂合个体进行基因型鉴定。如图8为中黄13×黑农51遗传群体f3代重组体基因型(其中表示中黄13-qne1基因型，表示黑农51-qne1基因型，表示杂合-h基因型)，图9为其后代田间表型(开花期)分离情况。结果显示引物in392、in393、in06-15、d06-21、d06-91、d06-27、d06-30、d06-37、d06-20鉴定的重组体基因型和开花期均完全对应，即具中黄13基因型(qne1)的后代整体表现为晚花，具黑农51基因型(qne1)的后代整体表现为早花，同时具有父母本基因型的杂合型并且后代出现开花期分离现象。据此，我们将qne1区间精细定位至标记in393和d06-20之间，对应的275位置为19005509—19258732，约253.223kb，该区间内包含基因glyma.06g203300—glyma.06g204400，共12个候选基因。对父母本进行全基因组重测序，根据重测序结果可知在12个候选基因中，本群体父母本间存在差异的候选基因为6个，分别为glyma.06g203300、glyma.06g203400、glyma.06g203600、glyma.06g204000、glyma.06g204200、glyma.06g204300，本群体父母本间编码区存在有义突变的候选基因为2个，分别为glyma.06g203600，glyma.06g204300。同时，综合绥农10号×岩姬和中黄13×黑农51两个遗传群体精细定位的情况，glyma.06g204300为两个遗传群体共有候选基因，且在两个遗传群体中分子标记d90，d06-91都在在glyma.06g204300上，其父母本差异鉴定如图10和图11，并且通过在f2:4群体中基因型与表型相关性鉴定，发现其与开花期显著相关(见表7)，因此初步推测候选基因glyma.06g204300即为qne1基因，结合其后代表型花期情况统计(见表8、9、10)，验证了qne1具有延迟开花的功能。表7在y162f2:4群体中qne1基因型与花期的相关性分析表8y162群体的f2:3代基因型鉴定结果表9e4背景下杂14群体的f2:4代基因型鉴定结果名称基因型花期(天)岩姬qne138.1±1.5绥农10号qne135.0±2.1r1qne161r2qne169r3qne131r4h52r5h33r6qne131r7qne147r8h74表10e4背景下杂14群体的f2:4代基因型鉴定结果实施例2：大豆生育期qne1基因的核定位研究一、以大豆中黄13品系的叶片为材料，用购买自invitrogen公司的trizol试剂盒的操作手册提取叶片总rna；二、采用dnasei处理步骤一提取的总rna，处理后的总rna采用nanodrop检测其dna含量及质量，当dna含量及质量达到标准后，进行下一步操作；三、取1μg步骤二处理后的总rna用于cdna的合成，cdna的合成操作按照购买自transgenbiotech公司的easyscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒的使用手册进行，获得cdna；四、分别以qne1基因gm204300sl-fw(见序列表seqidno：5)与gm204300sl-rv(见序列表seqidno：6)为引物，采用购买自takara公司的高保真酶primerstar扩增qne1基因，pcr反应条件如下：98℃预变性30s，98℃变性10s，55℃退火15sec，72℃延伸1min30s,共36个循环；再72℃延伸7min，获得qne1基因编码区产物；五、将步骤四获得的qne1基因编码区产物利用同源重组的方法重组到pentr/dtopo(invitrogen)入门载体中，鉴定成功后提取质粒在abi3130测序仪(abi公司)上进行测序，即为本发明的大豆生育期qne1基因，如序列表seqidno：1所示，测序正确的质粒进行lr反应连接到ph7wgf2.0瞬时表达载体上，形成一个35spro启动子驱动的qne1与egfp融合体质粒(即35spro：egfp：qne1)。六、将步骤五得到的35spro：egfp：qne1质粒和不含有qne1的ph7wgf2.0(35spro：egfp)质粒作为对照分别转化至gv3101农杆菌中并保存单菌落菌株。利用瞬时侵染烟草方法，注射烟草叶片然后置于激光共聚焦显微镜下观察，其中ph7wgf2.0gateway载体质粒由中国科学院东北地理与农业生态研究所卜庆云研究员惠赠，dnasei购买自takara公司，pentr/dtopo入门载体购自invitrogen公司，nanodrop购买自thermoscientific公司，中黄13由吉林省农业科学院大豆研究中心馈赠。ph7wgf2.0gateway载体质粒在以下文章中公开。wangz,tianx,zhaoq,etal.thee3ligasedroughthypersensitivenegativelyregulatescuticularwaxbiosynthesisbypromotingthedegradationoftranscriptionfactorroc4inrice[j].theplantcell,2018,30(1):228-244.karimim,inzéd,depickera.gatewaytmvectorsforagrobacterium-mediatedplanttransformation[j].trendsinplantscience,2002,7(5):193-195.其中，瞬时侵染烟草方法如下：一、种植烟草于光照培养箱中，22℃，光照/黑暗(16h/8h)，培养至4-6片真叶，避免抽薹。二、取出-80℃冰箱保存的目标载体及p19载体的菌液各200μl分别于50mllb液体培养基，同时加入50μl卡那素(kan)、50μl壮观霉素(spe)、100μl利福平(rif)、500μlmes(ph＝5.6)、20p19载体las中，28℃震荡培养过夜至菌液od600达到3时，3200g离心10min，去上清，收集菌体，用10mmmgcl2溶液重悬菌体，并将菌液浓度调至od600为1.5，而携带病毒的ptgs抑制子p19菌液浓度调为od600为1.0，并在重悬菌液中添加乙酰丁香酮至浓度200p19载体m；三、室温放置3h后，将含目的质粒的农杆菌重悬液与含p19的农杆菌重悬液1：1混合后，选择生长良好的烟草叶片，用1ml注射器(去掉针头)吸取混合好的侵染液，从叶片背面下表皮注射烟草，注射后，将烟草重新移回光照培养箱中培养；四、注射后2-3天，剪取注射过的叶片在激光共聚焦显微镜下观察转染后的烟草不同器官中大豆生育期qne1基因的分布，确定核定位，初步确定大豆生育期qne1基因定位于细胞核中。其中，图12和图13为qne1基因核定位研究所用载体的结构示意图，图12为对照载体，即egfp(绿色荧光蛋白)未融合qne1；图13为本试验构建的qne1与egfp融合蛋白载体。在荧光显微镜下观察大豆生育期qne1基因蛋白在不同器官中的分布情况如图14至21所示。由图14至图21可知qne1蛋白(seqidno：2)主要定位于细胞核中。序列表<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所<120>大豆生育期qne1基因及其编码蛋白和应用<160>6<210>1<211>1173<212>dna<213>大豆属(glycinemax(l.)merr.)<220><223>大豆生育期qne1基因<400>1atgatgttgacgatgatggcaagttcaagagaaggttatcaagcaaagcaagagggtgac60acaaccactaatattgacaagttctccaaggcatcttctactacttcaagacaatggtca120gcgttcagaaatccaagaattgtgagagtgtctcgttcttttggagggaaagataggcat180agcaaggtttgcaccataagagggttgagggacagaaggattaggctctcggttcccaca240gctattcagctatatgatcttcaagacaagcttggactaagccaaccaagcaaagtgata300gattggttgcttgaagccactaaatttgacattgacaagctccctccactccaattccct360cagggttttggtcaatttcatcatcatccacaaaccctattcccttttcatgaatcaagt420gctgcctctcatcagctgtctcttggacccttcagtgatgctagctccacttttgtgagg480gatggagggattcaaaacctcatggcaaagtcaaggtattgggagaacataaactcaatg540tcaagattaagaggcaataaggaagctgaaaagggcaagtggatcaaaacaagtgaagaa600gagaatcatgatcaagatggtgttgttggaggttacaacaacttgcaagtttctactcaa660aggcttttcccaatgggtagtagtactactactactactcactcccttttacctggtttg720ttaaacaattccatgccatataacgcctacagttctgagccttctagtttatctttatcc780caatttggaagccatggattgttcccttctcaacaagtagatcctaatccaagcagtggc840aacaatggtgtgcaattccaatcttctttgtcattaccttcatcgggctctcaattattg900tttggctcatcttctgctacaccatcaatgttcaccacctatgctccatttattgcaccc960tcagtggaccctgatccaagacagttcaaccacattcatcagttcttgaactcaggctct1020caaatcttgcctcctcatcctctcataccatctcttcatcactcattcaattcacagatc1080agacccttcccagcagcactctttagttcaaagcttttggattcagacagcagcaaccat1140agccaacaagatcataagggtagcacttcttga1173<210>2<211>390<212>prt<213>大豆属(glycinemax(l.)merr.)<220><223>大豆生育期qne1基因编码蛋白<400>2metmetleuthrmetmetalaserserarggluglytyrglnala51015lysglngluglyaspthrthrthrasnileasplyspheserlys202530alaserserthrthrserargglntrpseralapheargasnpro354045argilevalargvalserargserpheglyglylysasparghis505560serlysvalcysthrileargglyleuargaspargargilearg657075leuservalprothralaileglnleutyraspleuglnasplys808590leuglyleuserglnproserlysvalileasptrpleuleuglu95100105alathrlyspheaspileasplysleuproproleuglnphepro110115120glnglypheglyglnphehishishisproglnthrleuphepro125130135phehisgluserseralaalaserhisglnleuserleuglypro140145150pheseraspalaserserthrphevalargaspglyglyilegln155160165asnleumetalalysserargtyrtrpgluasnileasnsermet170175180serargleuargglyasnlysglualaglulysglylystrpile185190195lysthrsergluglugluasnhisaspglnaspglyvalvalgly200205210glytyrasnasnleuglnvalserthrglnargleuphepromet215220225glyserserthrthrthrthrthrhisserleuleuproglyleu230235240leuasnasnsermetprotyrasnalatyrsersergluproser245250255serleuserleuserglnpheglyserhisglyleupheproser260265270glnglnvalaspproasnproserserglyasnasnglyvalgln275280285pheglnserserleuserleuproserserglyserglnleuleu290295300pheglyserserseralathrprosermetphethrthrtyrala305310315propheilealaproservalaspproaspproargglnpheasn320325330hisilehisglnpheleuasnserglyserglnileleupropro335340345hisproleuileproserleuhishisserpheasnserglnile350355360argpropheproalaalaleupheserserlysleuleuaspser365370375aspserserasnhisserglnglnasphislysglyserthrser380385390<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物e4-kamfw<400>3cttaataaagccatgactggtttg24<210>4<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物e4-kamrv<400>4cttgagtttcaatgaggtttcaac24<210>5<211>43<212>dna<213>人工序列<220><223>引物gm204300sl-fw<400>5aaagcaggctcaggggatatcatgatgttgacgatgatggcaa43<210>6<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物gm204300sl-rv<400>6agctgggtgcagggcgatatctcaagaagtgctacccttat41当前第1页12