等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖的制备方法及应用与流程

本发明属于多糖制备领域，具体涉及等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖的制备方法及应用。

背景技术：

板蓝根是我国传统的中草药，是十字花科植物菘蓝的干燥根，最早记载于《神农百草经》，具有味苦、性寒、归心等性质，发挥清热解毒、凉血利咽等功能。板蓝根经常用于治疗瘟毒发斑、舌绛紫暗、痄腮、喉痹、烂喉丹痧、大头瘟疫、丹毒、痈肿等症状。多糖是板蓝根的主要活性成分，现代药理学研究表明板蓝根多糖具有抗病毒、抗菌消炎、抗氧化、免疫调节、抗内毒素、抗癌等活性。随着人们对多糖生物活性和特殊药用功能认识的进一步加深，意识到板蓝根多糖可能是板蓝根生物活性和特殊药用功能的主要作用因子之一。此外，板蓝根多糖分子链上含有大量的羟基基团，这些羟基基团为板蓝根多糖的化学改性提供了大量的反应位点，从而引入新的基团改变板蓝根多糖的性质。

常见的多糖改性方法有乙酰化改性、硫酸化改性、磷酸化改性、磺酰化和羧甲基化改性等。其中乙酰化、硫酸化、磷酸化和磺酰化等改性方式因使用较多毒性较强的有机溶剂，导致其应用受到一定的限制。羧甲基化作为一种常见的改性方式，其反应条件温和，改性剂毒性较小，逐渐成为人们关注的焦点。羧甲基改性就是将多糖在碱性条件下与氯乙酸反应，在多糖结构中引入带负电荷的羧基基团，使得其具有羧基的离子交换、絮凝和吸附等特点，从而改变和提高原多糖的某些性质，拓展多糖的应用。国内有一些关于多糖羧甲基化改善多糖性质的专利申请。相关专利报道了一种羧甲基化五味子多糖的制备方法，发现五味子多糖经羧甲基改性后提高了其对有机污染物免疫毒性的干预能力；相关专利报道了羧甲基化黑木耳多糖的抗氧化能力得到了显著提高。目前国内专利对羧甲基化多糖的研究主要集中在改善其抗氧化、抗病毒等方面，很少有研究报道羧甲基化多糖的抗菌效果的改变。虽然板蓝根多糖拥有一定的抗菌效果，但其抗菌效果不高，成本昂贵。利用羧甲基改性板蓝根多糖虽然可以改善板蓝根多糖的抗菌效果，但同样存在改性后性质不稳定的现象，因此可以采用等离子体技术进一步加强板蓝根多糖的抗菌效果，拓展其在食品中的抗菌应用。

等离子体又叫电浆，是由部分电子被剥夺后的原子以及原子团经电离后产生的正负离子组成的离子化气体状物质。等离子体处理迅速，反应温度低，且环保无污染。等离子体中的离子具有较高的能量，一般都高于聚合物中的化学键能，通过电场加速后等离子体完全有足够的能量引起聚合物表面的各种化学键断裂和重新组合，从而对聚合物的性质进行改造。例如利用等离子体处理抗菌纳米纤维膜表面，能够提高抗菌物质的释放，增强纳米纤维膜的抗菌能力。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，如：改性后性质不稳定、化学改性效果不明显等，本发明提供了一种等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖的制备方法。

(1)提取板蓝根多糖：

将板蓝根粉末溶于蒸馏水中，并进行水浴加热；将得到的溶液抽滤，滤液浓缩，得到浓缩液，加入无水乙醇，室温静置，离心，冷冻干燥，得到板蓝根多糖(irp)；

(2)羧甲基化处理板蓝根多糖：

将板蓝根多糖溶于氢氧化钠溶液中，加入氯乙酸，搅拌后，得到混合液，进行水浴反应，得到的反应液，调节ph，透析、浓缩、沉淀、干燥，得到羧甲基化板蓝根多糖(cirp)；

(3)等离子体处理羧甲基化板蓝根多糖：

将羧甲基化板蓝根多糖进行等离子处理，得到等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖(pcirp)。

步骤(1)中，所述水浴加热的温度为70℃，所述水浴加热的时间为1h，所述无水乙醇的添加量为浓缩液体积的四倍；所述室温静置为室温静置过夜。

步骤(2)中，所述板蓝根多糖、氢氧化钠溶液、氯乙酸的用量比为3-5g：20ml：1.5-2.5g，所述氢氧化钠溶液的浓度为3mol/l；所述水浴反应的温度为60℃，所述水浴反应的时间为8h；所述调节ph时，使用乙酸溶液将反应液的ph调整为7；所述透析时，使用截留分子量为4000da的透析袋，透析的方式为流水透析48h，蒸馏水透析24h；所述沉淀为采用无水乙醇进行沉淀。

步骤(3)中，所述等离子处理的功率为100-200w，所述等离子处理的时间为3-5分钟。

本发明还提供了一种等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖的应用，所述板蓝根多糖用于食品抗氧化、抗菌保鲜。

与现有技术相比较，本发明的有益效果体现如下：

(1)本发明利用羧甲基改性技术改善板蓝根多糖的抗菌效果，并利用等离子体技术克服化学改性不稳定的缺点，进一步提高板蓝根多糖的抗氧化能力和抗菌能力。

(2)本发明制备的等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖抗菌效果提升明显，如图3所示，10mg/ml的板蓝根多糖在猪肉肉汤中不显示抗菌效果，而经10mg/ml的等离子体处理羧甲基化板蓝根多糖处理后，李斯特菌的数量下降了2.2logcfu/ml；等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖抗氧化效果提升明显，在浓度为1mg/ml时，等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖(pcirp)dpph自由基的清除率为45.24％，高于板蓝根多糖(irp)的36.34％，说明等离子和羧甲基处理后，提高了板蓝根多糖(irp)的抗氧化能力。

因此，本发明制备的等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖抗菌效果的提升拓展了板蓝根多糖在食品中的抗氧化和抗菌应用，减少了板蓝根多糖的应用成本。

(3)本发明通过化学改性的方式对板蓝根多糖的分子链上引入新的基团，制备羧甲基化的板蓝根多糖，改善其功能特性；同时利用等离子的高能量的优势，对其进一步表面修饰，制备出等离子体处理的板蓝根多糖羧甲基化衍生物，旨在提高板蓝根多糖的抗氧化和抗菌效果，拓展其在食品中的应用。

附图说明

图1为本发明板蓝根多糖、羧甲基化板蓝根多糖和等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖对dppp自由基清除能力的比较，其中vc为维生素c，irp为板蓝根多糖，cirp为羧甲基化板蓝根多糖，pcirp为等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖；

图2为本发明板蓝根多糖、羧甲基化板蓝根多糖和等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖在pbs中对李斯特菌杀菌结果，其中irp为板蓝根多糖，cirp为羧甲基化板蓝根多糖，pcirp为等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖；

图3为本发明板蓝根多糖、羧甲基化板蓝根多糖和等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖在猪肉肉汤中对李斯特菌杀菌结果，其中irp为板蓝根多糖，cirp为羧甲基化板蓝根多糖，pcirp为等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。

实施例1：

实验材料与设备

(1)提取板蓝根多糖：

称取料液比为1:10的板蓝根粉末和蒸馏水放于烧杯内，置于磁力搅拌器(200rpm)上搅拌0.5h；搅拌结束后，将烧杯置于70℃的恒温水浴锅中水浴加热溶液1h；加热结束后，取出烧杯，冷却至室温，将冷却的溶液置于抽滤机中抽滤，收集滤液；收集到的滤液放入旋转蒸发仪中，温度为70℃，将滤液浓缩至原有体积的1/5；向浓缩液中加入四倍体积的无水乙醇，室温静置过夜；进一步的将浓缩液在3500r/min下离心10分钟，去除沉淀，收集滤液；将滤液置于-80℃的冷肼中冷冻2h，然后放于冷冻干燥机中冻干24h，得到板蓝根多糖(irp)。

(2)羧甲基化处理板蓝根多糖：

准确称取3g板蓝根多糖粉末缓慢加入装有20ml氢氧化钠溶液(3mol/l)的烧杯中，随后将烧杯置于磁力搅拌器中(200rpm)搅拌0.5h，至完全溶解后将溶液振荡培养1h；振荡结束后，称取1.5g氯乙酸加入烧杯中，继续搅拌0.5h至氯乙酸充分溶解，随后将烧杯放入60℃的恒温水浴锅内，加热时间为8h；加热结束后，取出烧杯，冷却至室温，用90％的乙酸溶液将混合液的ph调整为7；将得到的中性混合液，放入截留分子量为4000da的透析袋中，流水透析48h，蒸馏水透析24h；透析结束后，将透析液放入旋转蒸发仪中，70℃浓缩至原有体积的1/5；浓缩液加入八倍体积的无水乙醇，室温静置过夜，收集沉淀；沉淀置于-80℃的冷肼中冷冻2h，然后放于冷冻干燥机中冻干24h收集干燥粉末，得到羧甲基化板蓝根多糖(cirp)。羧甲基化板蓝根多糖的得率为65.6％，取代度为0.38。

(3)等离子体处理羧甲基化板蓝根多糖：

将羧甲基化板蓝根多糖置于等离子体表面处理仪中，用100w的冷等离子处理5分钟，得到等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖(pcirp)。

实施例2：

(1)提取板蓝根多糖：

板蓝根多糖的提取步骤同实施例1。

(2)羧甲基化处理板蓝根多糖：

准确称取5g板蓝根多糖粉末缓慢加入装有20ml氢氧化钠溶液(3mol/l)的烧杯中，随后将烧杯置于磁力搅拌器中(200rpm)搅拌0.5h，至完全溶解后将溶液振荡培养1h；振荡结束后，称取2.5g氯乙酸加入烧杯中，继续搅拌0.5h至氯乙酸充分溶解，随后将烧杯放入60℃的恒温水浴锅内，加热时间为8h；加热结束后，取出烧杯，冷却至室温，用90％的乙酸溶液将混合液的ph调整为7；将得到的中性混合液，放入截留分子量为4000da的透析袋中，流水透析48h，蒸馏水透析24h；透析结束后，将透析液放入旋转蒸发仪中，70℃浓缩至原有体积的1/5；浓缩液加入八倍体积的无水乙醇，室温静置过夜，收集沉淀；沉淀置于-80℃的冷肼中冷冻2h，然后放于冷冻干燥机中冻干24h收集干燥粉末，得到羧甲基化板蓝根多糖(cirp)。羧甲基化板蓝根多糖的得率为87.4％，取代度为0.67。

(3)等离子体处理羧甲基化板蓝根多糖：

将羧甲基化板蓝根多糖置于等离子体表面处理仪中，用200w的冷等离子处理3分钟，得到等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖(pcirp)。

实施例3：

(1)提取板蓝根多糖：

板蓝根多糖的提取步骤同实施例1。

(2)羧甲基化处理板蓝根多糖：

准确称取4g板蓝根多糖粉末缓慢加入装有20ml氢氧化钠溶液(3mol/l)的烧杯中，随后将烧杯置于磁力搅拌器中(200rpm)搅拌0.5h，至完全溶解后将溶液振荡培养1h；振荡结束后，称取2g氯乙酸加入烧杯中，继续搅拌0.5h至氯乙酸充分溶解，随后将烧杯放入60℃的恒温水浴锅内，加热时间为8h；加热结束后，取出烧杯，冷却至室温，用90％的乙酸溶液将混合液的ph调整为7；将得到的中性混合液，放入截留分子量为4000da的透析袋中，流水透析48h，蒸馏水透析24h；透析结束后，将透析液放入旋转蒸发仪中，70℃浓缩至原有体积的1/5；浓缩液加入八倍体积的无水乙醇，室温静置过夜，收集沉淀；沉淀置于-80℃的冷肼中冷冻2h，然后放于冷冻干燥机中冻干24h收集干燥粉末，得到羧甲基化板蓝根多糖(cirp)。羧甲基化板蓝根多糖的得率为75.6％，取代度为0.51。

(3)等离子体处理羧甲基化板蓝根多糖：

将羧甲基化板蓝根多糖置于等离子体表面处理仪中，用150w的冷等离子处理4分钟，得到等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖(pcirp)。

实施例4：等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖的表征

(1)实验材料与设备

(2)实验方法

①将1g等离子体处理羧甲基化板蓝根多糖溶于10ml去离子水中，制作母液。

②取1ml母液加入19ml的去离子水中，稀释后的母液采用激光粒度仪(nanozs90)测定其粒径和多分散系数(pdi)。zeta电势采用电位仪(nanozs90zeta)进行测定。

(3)粒径、pdi和zeta电势

表1羧甲基化板蓝根多糖和等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖的参数表征

羧甲基化板蓝根多糖和等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖的参数表征如表1所示。由表中可以看出，经过羧甲基化和等离子处理后的板蓝根多糖的粒径与未处理的板蓝根多糖相比有所增加，这是由于处理后的板蓝根多糖的分子结构更加伸展，并相互纠缠在一起，形成更大的颗粒。同样，由zeta电势可以看出，处理后的板蓝根多糖所带负电荷的数量也高于板蓝根多糖，是由于处理后的多糖分子链上引入了负电性的羧基基团，导致了负电荷数量的增多。因此，与板蓝根多糖和羧甲基化板蓝根多糖相比，等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖的性质参数更加稳定。

实施例5：等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖的抗氧化评价

(1)实验材料与设备

dpph国药集团化学试剂有限公司

甲醇国药集团化学试剂有限公司

tu-1800紫外分光光度计北京普析通用仪器有限公司

(2)实验方法

将板蓝根多糖(irp)、羧甲基化板蓝根多糖和等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖(pcirp)配制成不同浓度的溶液，各取2ml与0.5ml的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)溶液(0.4mmol/l)混合，混合均匀，置暗处反应30分钟后于517nm处测定其紫外吸光度(as)，蒸馏水代替样品与dpph溶液反应测定空白吸光度(ab)，乙醇代替dpph溶液与样品反应测定对照吸光度(ac)。样品的dpph清除率由以下公式得到：

(3)抗氧化效果评价

板蓝根多糖(irp)、羧甲基化板蓝根多糖(cirp)和等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖(pcirp)抗氧化能力如图1所示。由图中可以看出，维生素c最高清除率可达到92.25％。然而在浓度为1mg/ml时，板蓝根多糖的dpph清除率可达到39.83％，低于羧甲基化板蓝根多糖的47.25％。说明经过羧甲基改性后，板蓝根多糖的抗氧化效果得到了提升。此外等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖(pcirp)dpph自由基的清除率为56.24％，说明经等离子进一步处理后，羧甲基化板蓝根多糖的抗氧化能力得到了提高。

实施例6：等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖的抗菌能力评价

(1)实验材料与设备

(2)实验方法

a在磷酸缓冲液(pbs)中的抗菌效果评价

①将李斯特菌加入到液体培养基中，置于37℃的空气摇床中(150rpm)振荡培养48h，获得对数生长期的菌悬液。

②将对数生长期的李斯特菌悬液加入到无菌pbs溶液中，使其初始浓度在10⁴-10⁵cfu/ml的范围内，然后加入irp(5mg/ml)、cirp(5mg/ml)和pcirp(5mg/ml)。

③将经过不同处理过程的李斯特菌悬液37℃培养4天，每隔24h计算其残存菌数。残存菌落用平板计数法计算。不经任何处理的李斯特菌悬液作为对照(control)。

b在pbs中的抗菌结果

由图2可以看出，对照组的李斯特菌数量基本不变。与对照组相比，板蓝根多糖(irp)、羧甲基化板蓝根多糖(cirp)和等离子体处理羧甲基化板蓝根多糖(pcirp)对李斯特菌都起到了抑制效果，其中李斯特菌经板蓝根多糖处理后，数量下降了1.26logcfu/ml，低于羧甲基化板蓝根多糖的1.67logcfu/ml。说明板蓝根多糖经羧甲基化改性后，抗菌效果得到了提升。此外李斯特菌经等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖处理后，数量下降了2.20logcfu/ml，说明经等离子体处理后，羧甲基化板蓝根多糖的抗菌效果得到了进一步的提升。

c在猪肉肉汤中的抗菌效果评价

①称取一定量刚购买的新鲜猪肉于均质袋中，加两倍体积的蒸馏水，使用均质机进行均质破碎，再使用四层纱布进行过滤，将滤液分装与蓝色盖试剂瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min备用。

②向各试剂瓶中加入一定量生长至对数期的李斯特菌，使得每个试剂瓶中李斯特菌浓度大致为10^3-4cfu/ml。

③将一定量的板蓝根多糖(irp)、羧甲基化板蓝根多糖(cirp)和等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖(pcirp)分别加入到上述试剂瓶中，使其浓度为10mg/ml，接种有李斯特菌而不添加抗菌剂的肉汤作为对照组(control)。

④将上述不同的试剂瓶放入37℃的恒温培养箱中培养4天，每隔24h计算其残存菌数。残存菌落用平板计数法计算。

d在猪肉肉汤中的抗菌结果

由图3可以看出，不添加抗菌剂的猪肉肉汤中，李斯特菌的数量持续增长，说明肉汤中的营养物质促进了李斯特菌的增殖。猪肉肉汤经板蓝根多糖处理后，李斯特菌数量基本保持不变。然而猪肉肉汤经等羧甲基化板蓝根多糖处理后，李斯特菌数量从3.08logcfu/ml下降为2.54logcfu/ml。此外，李斯特菌经等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖处理后，李斯特菌数量从3.08logcfu/ml下降到2.02logcfu/ml，说明即使在肉汤中，等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖和羧甲基化板蓝根多糖与板蓝根多糖相比，依然发挥较好的抑菌效果。

本发明利用羧甲基改性技术改善板蓝根多糖的抗氧化和抗菌效果，并利用等离子体技术克服化学改性不稳定的缺点，进一步提高板蓝根多糖的抗氧化能力和抗菌能力。本发明制备的等离子体处理的羧甲基化板蓝根多糖，可用于蔬菜水果、肉类食品的抗氧化、抗菌保鲜。