FGFR-Fc融合蛋白及siRNA的制作方法

本发明属于蛋白质和基因工程领域，具体而言，本发明涉及fgfr-fc融合蛋白，其可用于抑制血管生成，另外本发明涉及sirna，其可用于抑制fgfr1蛋白的表达。

背景技术：

中国专利申请第201110303377.0号公开了特异性bfgf结合肽，其具有结合bfgf的能力而同时没有与afgf和fgf21的结合活性，其中两种结合肽中，效果较差的一种一直没有得到重视。

然而，本发明人发现，该肽的效果还是很不错的，尤其是在抑制血管生成方面。另外，本发明还在研究中令人意外地发现了一种sirna，其可用于抑制fgfr1蛋白的表达。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于提供了新的fgfr-fc融合蛋白和sirna，用于抑制血管生成和抑制fgfr1蛋白的表达。另外，本发明还提供了该fgfr-fc融合蛋白和sirna的编码核酸、载体、细胞、制备方法以及应用等。

在第一个方面，本发明提供了用于抑制血管生成的fgfr-fc融合蛋白，其氨基酸序列如seqidno：2所示。

在第二个方面，本发明提供了编码本发明第一个方面所述的fgfr-fc融合蛋白的核酸。本发明的核酸，可以是dna形式，也可以是rna形式，优选dna形式。dna形式包括重组的dna和人工合成的cdna，dna可以是编码链或模板链。通过常规技术，如pcr方法、dna重组技术或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的编码融合蛋白的核苷酸序列或其片段。事实上，根据设计的多核苷酸序列，当前已经能够通过商业渠道规范地制备出相应的dna。一旦获得核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核苷酸序列。在本发明的具体实施方式中，本发明的核酸的多核苷酸序列如seqidno.1所示。

在第三个方面，本发明提供了载体，其含有本发明第二个方面所述的核酸。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”，有时仅称“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如his，leu，trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在本发明的具体实施方式中，本发明的载体是pn24，其适合在哺乳动物细胞中表达。

在第四个方面，本发明提供了细胞，其特征在于，所述细胞含有本发明第三个方面所述的载体，或者所述细胞转化或转染有本发明第二个方面所述的核酸。本发明的细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。本领域技术人员熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法、原生质体融合法、脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法。令人惊讶的是，本发明人从当前天文数字般的宿主细胞中发现了鼠骨髓瘤细胞能够分泌表达转染入其中的本发明的bfgf结合剂，由此无需破碎细胞即可利用相对杂质成分较少的培养上清液直接进行纯化。因此，本发明优选所述细胞是转化或转染有本发明第二个方面所述的核酸的鼠骨髓瘤细胞，尤其是ns0细胞。

在第五个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的fgfr-fc融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：用本发明第四个方面所述的细胞表达本发明第一个方面所述的fgfr-fc融合蛋白，并分离所述的fgfr-fc融合蛋白。表达本发明第一个方面所述的fgfr-fc融合蛋白的细胞可以通过常规方法培养和/或诱导来表达所需要的fgfr-fc融合蛋白。表达的fgfr-fc融合蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。分离(纯化)的方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等电聚焦以及变性、复性处理等。由于鼠骨髓瘤细胞能够分泌表达转染入其中的本发明的bfgf结合剂，因此优选直接将细胞表达的培养上清液用以分离。优选在本发明的第五个方面中，分离过程包括，将细胞表达的培养上清液依次用proteina亲和层析、sp-sepharose离子交换层析和q-sepharose层析纯化。

在第六个方面，本发明提供了用于抑制血管生成的药物组合物，其包括本发明第一个方面所述的fgfr-fc融合蛋白以及药学上可接受的载体。所述的药物组合物能预防或治疗抑制血管生成，尤其是抑制新生血管的生成。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂、或喷雾剂型。

在第七个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的fgfr-fc融合蛋白在制备用于抑制血管(尤其是新生血管)生成的药物中的应用。

在第八个方面，本发明提供了用于抑制fgfr1蛋白表达的sirna，其多核苷酸序列为gcuugccaauggcggacucaatt。

在第九个方面，本发明提供了载体，其含有本发明第八个方面所述的sirna。在本发明的具体实施方式中，本发明的载体是lipofectamine2000，其适合转染细胞。

在第十个方面，本发明提供了细胞，其特征在于，所述细胞含有本发明第九个方面所述的载体，或者所述细胞转化或转染有本发明第八个方面所述的sirna。本发明优选所述细胞是表达fgfr1的细胞。

在第十一个方面，本发明提供了用于抑制fgfr1蛋白表达的药物组合物，其包括本发明第八个方面所述的sirna以及药学上可接受的载体。

在第十二个方面，本发明提供了本发明第八个方面所述的sirna在制备用于抑制fgfr1蛋白表达的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明的fgfr-fc融合蛋白和sirna可用于抑制血管生成和抑制fgfr1蛋白的表达，为提供相应药物的新选择，提供了坚实的基础。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了本发明的fgfr1-fc融合蛋白对鸡胚尿囊膜(cam)血管生成的影响。

图2显示了fgfr1的sirna沉默效果，其中a显示了wb的效果，该sirna对fgfr1的表达有抑制，而对对照蛋白gapdh无影响，b显示了qrt-pcr结果，表明50pmol与80pmol的sirna对fgfr1的表达抑制效果无显著区别。

具体实施方式

本发明将通过具体的实施例来进行示例性的说明，其中，如有未尽之处，可参见《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，北京)等实验手册以及市售的试剂和试剂盒的使用说明。

实施例1本发明的fgfr-fc融合蛋白的表达和纯化

根据中国专利申请第201110303377.0号公开的方法，表达和纯化获得本发明的fgfr-fc融合蛋白，其氨基酸序列如seqidno：2所示，其编码的多核苷酸序列如seqidno：1所示。

实施例2本发明的fgfr-fc融合蛋白的抑制新生血管生成的作用

实验过程如下：

1)鸡胚准备：购买鸡种蛋80只，表面用75％酒精擦拭消毒，然后放入37℃恒温箱(湿度60％～80％)中孵育，将气室朝上，鸡蛋要始终倾斜45°；每天早、晚各翻蛋一次，以防胚胎发生粘连，同时促进羊膜运动。第3天用检卵灯观察，将无血管出现的鸡蛋丢弃。

2)假气室制备：孵化第四天，在超净台上，用75％酒精擦拭消毒蛋胚，用一次性注射器针头在蛋顶端搓一小孔，然后用镊子小心地去掉周围蛋壳和壳膜，出现约1.5cm×1.5cm大小的开口。此时，可以看到气室底部隔着一层气室膜就是cam膜，并可以清晰地观察到cam膜上血管的分布和鸡胚的位置待确定具体加样位置后，用新的一次性注射器针头小心地挑拨气室膜，往破口处滴入1～2滴无菌水。此时cam膜往下塌陷，与气室膜分开，然后用镊子小心的去除气室膜，暴露出下层的尿囊膜。

3)配药：将实施例1制备的fgfr1-fc和bfgf按照一定的浓度溶解于pbs，设置pbs组，pbs+bfgf组，pbs+bfgf+fgfr1-fc(80μg/ml)组和pbs+bfgf+fgfr1-fc(20μg/ml)组，其中bfgf加药浓度为50ng/ml。

4)加药：准备灭菌的定性滤纸剪成5mm×5mm大小，用镊子轻轻地将滤纸置于鸡胚绒毛尿囊膜表面血管较少的部位，将10μl的药品加到滤纸，然后用灭菌的胶布封闭假气室。继续孵育4天后，用镊子除去封口胶布和气室段周围的蛋壳，最大程度暴露cam膜，拍照保存图像，其中实例性的照片如图1所示。

由照片可观察到各组鸡胚生长状态良好，血管分支正常。与pbs组比较，bfgf刺激后鸡胚囊肿血管数量明显增加，呈现出非常明显的血管生成反应；实施例1制备的fgfr1-fc给药处理后，对血管的生长有抑制作用，这种抑制作用与剂量呈正相关，其中高剂量组的血管数量几乎恢复到正常水平。由此可以证明，实施例1制备的fgfr1-fc可以抑制由bfgf诱导的血管生成作用。

实施例3本发明的sirna干扰fgfr1表达的作用

如表1所示，我们设计并合成了sirna。

表1sirna基因序列

使用lipofectamine2000转染sirna的步骤如下：

1)细胞接种：转染前一天接种适当数量的细胞至培养皿中，使转染时的细胞密度能够达到50～60％，注意要使用无抗生素培养基。细胞密度的控制是实验的关键。

2)sirna-lipo2000混合液的配制：将lipo2000转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清的培养基稀释，轻轻混合，室温孵育5min。之后用无血清的培养基稀释sirna，轻轻混合，室温孵育5min。稀释好的lipo2000与稀释好的sirna轻轻混合，室温培养20min以形成sirna-lipo2000混合物。

3)转染：将混合液加入含有细胞的培养皿中，轻轻摇晃，使之混合，置于37℃培养箱中6h之后，更换新鲜的含血清抗生素的培养基。继续培养48h。

4)沉默效率检测：分别用qrt-pcr和westernblot实验检测蛋白质的表达量。

结果如图2。从实验结果可知，fgfr1蛋白的表达以及mrna相对含量均明显下降。根据wb灰度分析可知沉默fgfr1蛋白的表达效率大约在70％左右，干扰fgfr1表达的有效浓度为50pmol。

序列表

<110>温州医科大学

<120>fgfr-fc融合蛋白及sirna

<130>2018

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1779

<212>dna

<213>人工合成(synthetic)

<400>1

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tacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga1779

<210>2

<211>592

<212>prt

<213>人工合成(synthetic)

<400>2

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