本发明涉及核酸检测技术，尤其是涉及一种人副流感病毒4型核酸检测试剂盒。
背景技术
急性呼吸道感染（acuterespiratorytractinfection，arti）是儿童发病和死亡的常见原因，严重威胁儿童的健康，大量文献报道人副流感病毒（humanparainfluenzavirus，hpiv）是儿童的重要病原，有资料显示大约30%-40%婴幼儿的病毒性呼吸道感染是由该类病毒引起。hpiv在arti的病毒病原中仅次于最常见的呼吸道合胞病毒。另有血清学流调资料证实，绝大多数6-10岁的儿童曾感染过hpiv。hpiv根据遗传学和抗原构造的不同分为1、2、3、4型。hpiv1型和hpiv3型属于副粘病毒亚科呼吸病毒属，hpiv2型和hpiv4型属于副粘病毒亚科病毒属。四型中的hpiv1、2、3是儿童arti的常见病原体，而hpiv4（根据抗原的不同又被分为a和b两个亚型）却被认为很少见。但是新近的研究结果表明，hpiv4作为病原体的地位被明显低估。
hpiv4是1958年从美国一名无热性上呼吸道疾病患者咽拭子中分离鉴定出来的。以往认为引起的疾病轻微而未引起人们足够的重视，故临床上也很少采用其它的方法来检测，但近年有血清学流调资料显示，在所有呼吸道感染患者中hpiv4抗体阳性约占3%，而儿童和青少年却高达50-90%。
荧光定量聚合酶链式反应，是在普通的反应体系中加入荧光基团，在把序列扩增过程中，随着反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加，荧光信号不断增强，并逐渐累积形成一条扩增曲线，通过荧光积累曲线实时监测整个进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性及定量分析的方法。目前在real-timeq-pcr方法中最广泛使用的为taqman系统。扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核普酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团发生荧光共振能量转移，因此探针完整时，检测不到该探针5’端荧光基团发出的荧光。但在扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，taq酶的5’一3’外切酶活性将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。
目前的对人副流感病毒4型的检测方法主要有以下几种：（1）病毒分离：为病毒学诊断的金标准，但费时、费力，且敏感性不高，不适宜临床检测需要。（2）抗原检测：采用免疫荧光技术检测的抗原，具有早期、快速检测的优点，但因所用抗体的差异，即使釆用特异性高的单克隆抗体，对一些变异的毒株也难以检出。（3）抗体检测：运用放射免疫或酵联免疫吸附技术检测血清抗体能间接反映机体感染hpiv4，但受抗体出现时相、机体免疫状况等多方面的影响，且还存在反复感染的可能，使得结果的评价存在一定的局限性。
因此，亟需一种灵敏度高，特异性强，覆盖面广，检测窗口期短的人副流感病毒4型检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种人副流感病毒4型核酸检测试剂盒，以解决现有技术中试剂盒灵敏度低，特异性差的技术问题。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的人副流感病毒4型核酸检测试剂盒，包括人副流感病毒4型核酸反应液，所述反应液包括反应缓冲液、脱氧核糖核普三磷酸、用于靶多核普酸扩增的两对上下游引物以及用于靶多核普酸检测的两条探针；其中：所述用于靶多核普酸扩增的两对上下游引物的序列为seqidno：1和2，seqidno：4和5；所述用于靶多核普酸检测的探针序列为seqidno：3和seqidno：6。
所述试剂盒还包括内标，所述内标的序列为seqidno：10。
所述试剂盒还包括用于内标片段扩增的上下游引物和用于检测内标的探针；所述用于内标片段扩增的上下游引物序列分别为seqidno：7和8；所述用于检测内标的探针序列为seqidno：9。
所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
所述试剂盒还包括由耐热dna聚合酶、反转录酶和尿嘧啶dna糖基化酶组成的酶混合液。
其中本发明中核普酸的序列如下表1所示：
本发明试剂盒操作快速，方法简便，检测的特异性好、灵敏度高且检测范围宽；采用本试剂盒可对未知样本中的人副流感病毒4型a和b两个不同亚型核酸进行快速检测，为诊断人副流感病毒4型a和b两个不同亚型核酸提供可靠的实验依据，彻底解决了现有技术中试剂盒检测效率低、特异性差以及灵敏度低的问题。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以本领域技术人员更好的理解本发明。如无特殊说明，本实施例中所用的实验仪器和试剂均为常规使用的仪器和试剂。
实施例1制备人副流感病毒4型核酸检测试剂盒
本发明所述的人副流感病毒4型核酸检测试剂盒，包括人副流感病毒4型（a和b两个不同亚型）核酸反应液，该核酸反应液包括：反应缓冲液，10mm的脱氧核糖核普三磷酸，用于靶多核普酸检测的探针，其中探针的核苷酸序列为seqidno：3和6；用于靶多核普酸扩增的上下游引物其核苷酸序列分别为seqidno：1和2，seqidno：4和5；用于内标片段扩增的上下游引物和用于检测内标的探针，其核苷酸序列分别为seqidno：7和8以及seqidno：9。
设计一种人工合成的由外壳蛋白包裹的含特定rna序列（seqidno：10）的慢病毒作为内标质控，另设计一对检测内标质控序列的引物（seqidno：7和8）及一条探针taqman探针（seqidno：9），探针5’和3’分别标记hex和bhq1，对靶序列的提取及扩增过程进行监控，避免假阴性。
此外，本试剂盒还包括mlv酶、dna酶以及催化dna聚合酶所需要的金属阳离子，本发明实施例1中pcr反应体系的配比如下表2所示：
表2
本发明还可以包括阴性对照和阳性对照：阴性对照采用无菌水，阳性对照为人工合成的浓度（1×104copies/ml）的假病毒。
实施例2样本检测实验
1、本发明的检测方法为realtimert-pcr，将rna逆转录和dna扩增结合起来。realtimert-pcr反应过程为：（1）cdna合成；（2）预变性，时间和长度取决于靶核普酸长度及碱基组成，预变性的温度一般为90℃-105℃，时间一般为1-10min，预变性的目的为使双链核普酸序列彻底分离为单链；（3）变性，温度一般为90℃-105℃，时间一般为10sz-30s；（4）退火，使各引物退火至人副流感病毒4型或内标质控核酸的靶序列上。退火的温度通常为40℃-60℃，退火的时间可以是10s-60s；（5）延伸，引物与模板结合，开始合成新的dna双链，延伸温度一般为40℃-80℃，延伸时间可以是10s-5min。
荧光检测通道选择：（1）选择fam通道（reporter：fam，quencher：none），检测人副流感4型病毒核酸；（2）选择hex通道，检测内标；（3）参比荧光（passivereference）设置为none。荧光定量实时反应条件如表3所示。
表3
2、结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析，也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阂值线值进行分析，然后记录样本ct值和定值结果。具体测试结果分析如下：
(1)当fam通道无值，且hex通道ct值≤37（一般为15-30）时，可报告检测结果为阴性。
(2)当fam通道ct值≤37，且hex通道ct值≤37时，可报告检测结果为阳性。
(3)当fam通道ct值≧37，且hex通道ct值≤37时，可报告样本浓度低于检测下线，结果仅供参考。
(4)当hex通道ct值≥37时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。
(5)当出现阴性对照有ct值或呈典型型s扩增曲线、阳性对照无ct值或无扩增曲线两种情况中的任一种时，该检测结果无效，应查找并排除原因，并重复试验。
实施例3本发明试剂盒功能性试验
1、最低检测限（lod）试验
（1）人副流感病毒4型核酸检测试剂配制
通过采用实施例1的方法制备人副流感病毒4型核酸检测试剂。
（2）病毒样本提取
将管中5个不同浓度的人副流感病毒4型病毒（a和b两个不同亚型）咽拭子洗脱液用移液器混匀,取出200µl于一个新的离心管中，12000rpm离心5min,小心弃去上清；向沉淀中加入200µl的病毒裂解液，充分混匀,100℃水浴5min，10000rpm离心5min备用。
（3）样本检测
将25µl处理好的标本上清加入到人副流感病毒4型核酸检测反应管中，每个浓度20个复孔，同时加入25µl纯净水到检测液中作为阴性对照，，按照实例2中检测方法进行检测。
（4）结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对人副流感病毒4型各浓度梯度的样本进行检测，表明本检测方法的检测灵敏度（lod）人副流感病毒4型（a亚型）为280tcid50/ml，人副流感病毒4型（b亚型）为280tcid50/ml，具体数据表4，表5。
表4：人副流感病毒4型病毒（a亚型）检测限确认
表5:人副流感病毒4型病毒（b亚型）检测限确认
2、与其它疾病的交叉反应情况
（1）人副流感病毒4型核酸检测试剂配制
通过采用实施例1的方法制备人副流感病毒4型核酸检测试剂。
（2）病毒样本提取
将管中的人副流感病毒4型中的1a和1b、人副流感病毒1型、2型、3型病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒1e-6型、腺病毒、呼吸道合胞病毒咽拭子洗脱液用移液器混匀,取出200µl于一个新的离心管中，12000rpm离心5min,小心弃去上清；向沉淀中加入200µl的病毒裂解液，充分混匀,100℃水浴5min，10000rpm离心5min备用。
（3）样本检测
将25µl处理好的标本上清加入到人副流感病毒4型核酸检测反应管中，同时加入25µl纯净水到检测液中作为阴性对照，提取的人副流感病毒4型中的1a和1b病毒核酸作为阳性对照试验，按照实例2中检测方法进行检测。
（4）结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对人副流感病毒4型以外的其它病原体进行检测，结果表明：本发明试剂盒对人副流感病毒4型（1a和1b亚型）阳性对照为阳性，阴性对照为阴性，人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、风疹病毒、腮腺炎病毒、鼻病毒1e-6型、腺病毒、呼吸道合胞病毒等病原体感染样本无交叉反应，表明其具有高特异性，具体结果如表7。
表7：交叉反应实验
3、对潜在外源物质的抗干扰性
（1）人副流感病毒4型核酸检测试剂配制
通过采用实施例1的方法制备人副流感病毒4型核酸检测试剂。
（2）样本处理
选取人副流感病毒4型病毒1a和1b两个不同亚型高值和低值两个浓度值。人副流感病毒4型（1a）病毒两个浓度值分别为2.8×107tcid50/ml和2.8×103tcid50/ml，人副流感病毒4型（1b）病毒两个浓度值分别为2.8×107tcid50/ml和2.8×103tcid50/ml。同时将干扰物质以3倍的峰值浓度（cmax）加入到对应病毒样本中，采用实例3中交叉反应方法处理样本，按照实例2中检测方法进行检测。
（3）结果分析
干扰判断：干扰率%小于项目所在行标允许的正确度偏倚（设定为10%），即可判断为通过。
干扰率计算公式：（干扰样本浓度-对照样本浓度）/对照样本浓度×100%。
试验表明，当样本中含有利巴韦林、齐多夫定、替诺福韦、拉米夫定、洛匹那韦立托那韦、阿德福韦醋，替比夫定，恩替卡韦、扑热息痛、扎那米韦（200ug/ml）等常见的抗病毒药物时，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰，具体见表8。
表8：外源物质的抗干扰性实验
4、对潜在内源物质的抗干扰性
（1）人副流感病毒三联核酸检测试剂配制
通过采用实施例1的方法制备人副流感病毒4型核酸检测试剂。
（2）样本处理
选取人副流感病毒4型病毒1a和1b两个不同亚型高值和低值两个浓度值。人副流感病毒4型（1a）病毒两个浓度值分别为2.8×107tcid50/ml和2.8×103tcid50/ml，人副流感病毒4型（1b）病毒两个浓度值分别为2.8×107tcid50/ml和2.8×103tcid50/ml。同时将200mg/dl血红蛋白、3000mg/dl甘油三酯、20mg/dl胆红素等干扰物质浓度加入到对应病毒样本中，采用实例3中交叉反应方法处理样本，按照实例2中检测方法进行检测。
（3）结果分析
干扰判断：干扰率%小于项目所在行标允许的正确度偏倚（设定为10%），即可判断为通过。
干扰率计算公式：（干扰样本浓度-对照样本浓度）/对照样本浓度×100%。
试验表明，当样本中含有200mg/dl血红蛋白、3000mg/dl甘油三酯、20mg/dl胆红素等内源性干扰物质时，本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰，具体见表9。
表9：内源物质的抗干扰性实验
序列表
sequencelisting
<110>郑州安图生物工程股份有限公司
<120>人副流感病毒4型核酸检测试剂盒
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