抗VWF蛋白单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合vwf蛋白的单克隆抗体oti9f3、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术

vwf即血管性血友病因子，是一种多聚血浆糖蛋白，可以结合血小板糖蛋白ib、糖蛋白iib/iiia、胶原蛋白及肝素，介导血小板对血管损伤位点的粘附。vwf主要由内皮细胞和巨核细胞合成，存在于血浆、血小板中α-颗粒及内皮细胞中的棒管状小体中。vwf对于止血与血栓形成非常重要，vwf结构和修饰的遗传缺陷会导致血管性血友病(vwd)，这是人体中最常见的先天性出血性疾病。或者说vwf水平升高表明与急性冠状动脉血栓形成有关，可作为动脉粥样硬化的一个临床风险标记物。

vwf是鉴定肿瘤内皮细胞(或巨核细胞)最有用的标志物之一。研究表明，vwf可作为许多白细胞亚群的黏附位点在炎症中发挥作用。目前临床上常用免疫组织化学(ihc)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而ihc实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对vwf蛋白的单克隆抗体对ihc检测vwf表达水平具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的vwf蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测vwf蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc)，保藏日期为2018年4月26日，保藏编号为cgmccno.15594。

本发明还提供了一种特异性结合vwf蛋白的单克隆抗体oti9f3，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据vwforf核苷酸序列(vwforf核苷酸序列如seqidno.1所示，8442bp；vwf氨基酸序列如seqidno.2所示)

设计引物pcr扩增vwforf第2292bp位到第3789bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点sgfi和mlui，插入表达载体pfastbac-c-ddk，构建vwf重组表达质粒pfastbac-ddk-rvwf。

(2)vwf重组蛋白的表达与纯化：将vwf重组表达质粒转染sf9细胞，获得的培养上清加入sf9细胞，然后裂解离心获得上清，ddk亲和层析柱纯化，获得纯化的vwf重组蛋白。

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的vwf重组蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，elisa法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗vwf特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为oti9f3，亚型鉴定为igg2b；通过收集腹水制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得vwf单克隆抗体oti9f3。分别通过westernblot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

本发明还提供了单克隆抗体oti9f3在制备用于检测vwf蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体oti9f3，可检测组织细胞中vwf的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与vwf的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于结肠癌、前列腺癌及乳腺癌等相关肿瘤组织。

与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为cgmccno.15594)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体oti9f3。本发明还提供了单克隆抗体oti9f3在制备用于检测vwf蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体oti9f3的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体oti9f3在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与vwf蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了vwf蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内vwf蛋白表达水平，可应用于结肠癌、前列腺癌及乳腺癌等相关肿瘤组织中vwf的表达水平。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株oti9f3的分类命名为：vwf鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：cgmcc；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2018年4月26日；

保藏编号：cgmccno.15594。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1克隆位点设计如图，其中底纹部分为orf区；

图2示实施例2重组vwf蛋白westernblot检测结果图，以anti-ddk抗体检测重组vwf蛋白在sf9裂解液中的表达，泳道为转化pfastbac-ddk-rvwf质粒的sf9细胞裂解液为抗原的检测结果；

图3示实施例2重组vwf蛋白sds-page结果图，用抗ddk亲和层析柱纯化重组vwf蛋白，纯化后的蛋白通过sds-page胶电脉、考马斯亮蓝染色；

图4示实施例3以单克隆抗体oti9f3识别完整的vwf(fulllengthvwf,vwf-fl)蛋白的westernblot检测结果图。左侧泳道为转染pcmv6-entry的细胞裂解液；右侧泳道为转染pcmv6-vwf-fl的细胞裂解液；

图5示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人胰腺癌免疫组化结果图(一抗为vwf单克隆抗体oti9f3)；

图6示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人膀胱免疫组化结果图(一抗为vwf单克隆抗体oti9f3)；

图7示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人扁桃体免疫组化结果图(一抗为vwf单克隆抗体oti9f3)；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、vwf重组表达质粒的构建

以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒rc218497(含vwforf8442bp)为模板，设计引物并分别引入酶切位点sgfi和mlui，克隆入表达载体pfastbac-c-ddk，建立vwf重组表达质粒。克隆位点设计如图1所示。

实施例2、vwf重组蛋白的表达与纯化

1、转化dh10bac^tme.coli细胞：将100ul感受态细胞置于冰上融化后加入质粒dna轻混匀，冰浴30min后42℃热激90s，然后将其继续冰浴1-2min。在超净台内加入900ul新鲜无抗lb培养基，于37℃摇床孵育4小时后取适量菌液均匀涂布于含抗生素的lb平板上，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。保种，提取重组质粒。

2、转染sf9细胞：培养的sf9细胞计数后加适量的细胞至6孔板中；取100μlsf900tm-iiisfm(无血清及抗生素)至小离心管中，加入8μlpeimegatran1.0混匀；溶解5μl纯化的重组质粒于100μlsf900tm-iiisfm培养基；将稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20分钟；重组质粒与转染剂混合液加至细胞中，轻轻混匀。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生；离心，收集上清保存，细胞沉淀加裂解缓冲液裂解，采用wb鉴定重组vwf的表达，结果图2。

3、裂解细胞：将适量转染过程收集的上清加入sf9细胞，27℃孵育细胞48-96小时；收集细胞悬液，600rpm，离心5min，上清避光保存，细胞沉淀加适量裂解缓冲液(使用前加入蛋白酶抑制剂pi和pmsf)重悬；超声破碎，200hz，破碎3s，间歇3s，10个循环；4℃，15000rpm，离心30min，0.45μm滤器过滤去沉淀，得裂解液。

4、ddk亲和层析柱纯化：以0.45μm，33mmpvdf膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15ml管，加入混合好的beads1ml，封口后放入360度混匀器中，于4℃结合2小时；取出15ml管，将裂解液倒入bio-rad层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样wb检测；以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用tbst冲洗beads3次，滴尽后用0.1mglycineph3.5洗脱，第一次200μl，滴尽不收集，第二、三次各500μl，第四次250μl，收集至一个1.5ml离心管中，并迅速加入nah2po4(ph＝11.0)中和至ph7.0左右，每管加入甘油至终浓度为10％，tween-80至终浓度为0.1％。纯化后的重组vwf蛋白用sds-page鉴定，见图3。

由图2结果可见，转染pfastbac-ddk-rvwf质粒的sf9细胞裂解液中wb检测后在60kd处有明显的条带，分子量与预期分子量大小一致。表明细胞中重组vwf蛋白表达。

由图3结果可见，纯化的蛋白在sds-page胶66kd处有明显的特异条带，分子量与预期分子量大小一致。表明已获得了纯度较好的vwf重组蛋白。

实施例3、vwf单克隆抗体的制备与筛选

根据标准方法用重组产生的纯化的vwf蛋白片段对balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫。具体方法如下：

1、动物免疫：经过纯化的vwf抗原以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下注射方法免疫6-8周龄balb/c小鼠，免疫剂量为30μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为20μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；骨髓瘤细胞与小鼠脾淋巴细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培养基终止液及其余终止液，离心弃上清后加入hat培养基悬浮混匀，mc定容到50ml，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用vwf纯化重组蛋白进行elisa测试。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定elisa值，挑取od280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至elisa测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆定株。其对应融合板细胞株为oti9f3。

4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经pbs洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，细胞株oti9f3产生的单抗为igg2b，采用proteing进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、wb检测、分装、冻存在-20℃。其中wb检测结果见图4。

由图4结果可见，oti9f3能够很好的识别293t细胞过表达的vwf全长蛋白，分子量与预期分子量大小一致，表明单克隆抗体oti9f3能特异地westernblot检测完整的vwf蛋白。

实施例4、单克隆抗体oti9f3为一抗的免疫组化检测

(1)、实验方法：

1、取福尔马林固定的人胰腺癌、人膀胱、人扁桃体组织进行石蜡包埋，使用finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6μm。

2、脱蜡与水化：分析纯二甲苯3×10min，无水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去离子水浸泡3min×3次

3、加入抗原修复液(0.01m，ph6.0枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复3min，待高压锅温度降至约90℃时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3min×3次。

4、使用3％过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶，室温静置10min。去离子水浸泡5min×3次。

5、加上封闭液(pbs+5％脱脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封闭液，勿冲洗，加入vwf单抗(oti9f3)，稀释比：1:150，使用封闭液进行稀释。置于湿盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗涤2次，每次洗涤5min。pbst(0.02％tween-20)洗涤1次，每次洗涤5min。

7、滴加polink-试剂盒2(catlogno.d37-15)试剂1，37℃孵育10-20分钟。使用pbs洗涤3次，每次5min。滴加polink-2试剂盒(catlogno.d37-15)试剂2，37℃孵育10-20分钟，使用pbs洗涤3次，每次5min。

8、应用dab溶液(中杉金桥zli-9019)显色，显色3～10min。蒸馏水洗涤。

9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1％盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置1min。

10、脱水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性树胶封片。

11、镜检，见图5-7。

(2)、实验结果：

由图5-7结果可见，人胰腺癌、人膀胱、人扁桃体组织中可见到特异性胞外染色。结果与vwf在细胞内的定位及组织表达特异性一致，表明单克隆抗体oti9f3可用于免疫组织化学检测vwf蛋白的水平。

<110>无锡傲锐东源生物科技有限公司

<120>抗vwf蛋白单克隆抗体及其用途

<210>1

<211>8442

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgattcctgccagatttgccggggtgctgcttgctctggccctcattttgccagggaccctttgtgcagaaggaactcgcggcaggtcatccacggcccgatgcagccttttcggaagtgacttcgtcaacacctttgatgggagcatgtacagctttgcgggatactgcagttacctcctggcagggggctgccagaaacgctccttctcgattattggggacttccagaatggcaagagagtgagcctctccgtgtatcttggggaattttttgacatccatttgtttgtcaatggtaccgtgacacagggggaccaaagagtctccatgccctatgcctccaaagggctgtatctagaaactgaggctgggtactacaagctgtccggtgaggcctatggctttgtggccaggatcgatggcagcggcaactttcaagtcctgctgtcagacagatacttcaacaagacctgcgggctgtgtggcaactttaacatctttgctgaagatgactttatgacccaagaagggaccttgacctcggacccttatgactttgccaactcatgggctctgagcagtggagaacagtggtgtgaacgggcatctcctcccagcagctcatgcaacatctcctctggggaaatgcagaagggcctgtgggagcagtgccagcttctgaagagcacctcggtgtttgcccgctgccaccctctggtggaccccgagccttttgtggccctgtgtgagaagactttgtgtgagtgtgctggggggctggagtgcgcctgccctgccctcctggagtacgcccggacctgtgcccaggagggaatggtgctgtacggctggaccgaccacagcgcgtgcagcccagtgtgccctgctggtatggagtataggcagtgtgtgtccccttgcgccaggacctgccagagcctgcacatcaatgaaatgtgtcaggagcgatgcgtggatggctgcagctgccctgagggacagctcctggatgaaggcctctgcgtggagagcaccgagtgtccctgcgtgcattccggaaagcgctaccctcccggcacctccctctctcgagactgcaacacctgcatttgccgaaacagccagtggatctgcagcaatgaagaatgtccaggggagtgccttgtcacaggtcaatcacacttcaagagctttgacaacagatacttcaccttcagtgggatctgccagtacctgctggcccgggattgccaggaccactccttctccattgtcattgagactgtccagtgtgctgatgaccgcgacgctgtgtgcacccgctccgtcaccgtccggctgcctggcctgcacaacagccttgtgaaactgaagcatggggcaggagttgccatggatggccaggacgtccagctccccctcctgaaaggtgacctccgcatccagcatacagtgacggcctccgtgcgcctcagctacggggaggacctgcagatggactgggatggccgcgggaggctgctggtgaagctgtcccccgtctatgccgggaagacctgcggcctgtgtgggaattacaatggcaaccagggcgacgacttccttaccccctctgggctggcggagccccgggtggaggacttcgggaacgcctggaagctgcacggggactgccaggacctgcagaagcagcacagcgatccctgcgccctcaacccgcgcatgaccaggttctccgaggaggcgtgcgcggtcctgacgtcccccacattcgaggcctgccatcgtgccgtcagcccgctgccctacctgcggaactgccgctacgacgtgtgctcctgctcggacggccgcgagtgcctgtgcggcgccctggccagctatgccgcggcctgcgcggggagaggcgtgcgcgtcgcgtggcgcgagccaggccgctgtgagctgaactgcccgaaaggccaggtgtacctgcagtgcgggaccccctgcaacctgacctgccgctctctctcttacccggatgaggaatgcaatgaggcctgcctggagggctgcttctgccccccagggctctacatggatgagaggggggactgcgtgcccaaggcccagtgcccctgttactatgacggtgagatcttccagccagaagacatcttctcagaccatcacaccatgtgctactgtgaggatggcttcatgcactgtaccatgagtggagtccccggaagcttgctgcctgacgctgtcctcagcagtcccctgtctcatcgcagcaaaaggagcctatcctgtcggccccccatggtcaagctggtgtgtcccgctgacaacctgcgggctgaagggctcgagtgtaccaaaacgtgccagaactatgacctggagtgcatgagcatgggctgtgtctctggctgcctctgccccccgggcatggtccggcatgagaacagatgtgtggccctggaaaggtgtccctgcttccatcagggcaaggagtatgcccctggagaaacagtgaagattggctgcaacacttgtgtctgtcgggaccggaagtggaactgcacagaccatgtgtgtgatgccacgtgctccacgatcggcatggcccactacctcaccttcgacgggctcaaatacctgttccccggggagtgccagtacgttctggtgcaggattactgcggcagtaaccctgggacctttcggatcctagtggggaataagggatgcagccacccctcagtgaaatgcaagaaacgggtcaccatcctggtggagggaggagagattgagctgtttgacggggaggtgaatgtgaagaggcccatgaaggatgagactcactttgaggtggtggagtctggccggtacatcattctgctgctgggcaaagccctctccgtggtctgggaccgccacctgagcatctccgtggtcctgaagcagacataccaggagaaagtgtgtggcctgtgtgggaattttgatggcatccagaacaatgacctcaccagcagcaacctccaagtggaggaagaccctgtggactttgggaactcctggaaagtgagctcgcagtgtgctgacaccagaaaagtgcctctggactcatcccctgccacctgccataacaacatcatgaagcagacgatggtggattcctcctgtagaatccttaccagtgacgtcttccaggactgcaacaagctggtggaccccgagccatatctggatgtctgcatttacgacacctgctcctgtgagtccattggggactgcgcctgcttctgcgacaccattgctgcctatgcccacgtgtgtgcccagcatggcaaggtggtgacctggaggacggccacattgtgcccccagagctgcgaggagaggaatctccgggagaacgggtatgagtgtgagtggcgctataacagctgtgcacctgcctgtcaagtcacgtgtcagcaccctgagccactggcctgccctgtgcagtgtgtggagggctgccatgcccactgccctccagggaaaatcctggatgagcttttgcagacctgcgttgaccctgaagactgtccagtgtgtgaggtggctggccggcgttttgcctcaggaaagaaagtcaccttgaatcccagtgaccctgagcactgccagatttgccactgtgatgttgtcaacctcacctgtgaagcctgccaggagccgggaggcctggtggtgcctcccacagatgccccggtgagccccaccactctgtatgtggaggacatctcggaaccgccgttgcacgatttctactgcagcaggctactggacctggtcttcctgctggatggctcctccaggctgtccgaggctgagtttgaagtgctgaaggcctttgtggtggacatgatggagcggctgcgcatctcccagaagtgggtccgcgtggccgtggtggagtaccacgacggctcccacgcctacatcgggctcaaggaccggaagcgaccgtcagagctgcggcgcattgccagccaggtgaagtatgcgggcagccaggtggcctccaccagcgaggtcttgaaatacacactgttccaaatcttcagcaagatcgaccgccctgaagcctcccgcatcaccctgctcctgatggccagccaggagccccaacggatgtcccggaactttgtccgctacgtccagggcctgaagaagaagaaggtcattgtgatcccggtgggcattgggccccatgccaacctcaagcagatccgcctcatcgagaagcaggcccctgagaacaaggccttcgtgctgagcagtgtggatgagctggagcagcaaagggacgagatcgttagctacctctgtgaccttgcccctgaagcccctcctcctactctgccccccgacatggcacaagtcactgtgggcccggggctcttgggggtttcgaccctggggcccaagaggaactccatggttctggatgtggcgttcgtcctggaaggatcggacaaaattggtgaagccgacttcaacaggagcaaggagttcatggaggaggtgattcagcggatggatgtgggccaggacagcatccacgtcacggtgctgcagtactcctacatggtgactgtggagtaccccttcagcgaggcacagtccaaaggggacatcctgcagcgggtgcgagagatccgctaccagggcggcaacaggaccaacactgggctggccctgcggtacctctctgaccacagcttcttggtcagccagggtgaccgggagcaggcgcccaacctggtctacatggtcaccggaaatcctgcctctgatgagatcaagaggctgcctggagacatccaggtggtgcccattggagtgggccctaatgccaacgtgcaggagctggagaggattggctggcccaatgcccctatcctcatccaggactttgagacgctcccccgagaggctcctgacctggtgctgca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