特异结合人质膜膜泡关联蛋白PV-1的单克隆抗体及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物技术-单克隆抗体领域。本发明涉及一种特异结合人质膜膜泡关联蛋白(plasmalemmavesicle-associatedprotein，即plvap，又简称pv-1)的单克隆抗体及其编码序列与制备方法和用途。

背景技术

在体内，内衬在各器官组织中血管最内层的内皮细胞(endothelialcells，ec)与围绕包裹的周皮细胞(pericyte)及基底等构成的血管系统，主要起着以下双重而又互补的作用：

1)将循环流淌在血管管壁内的血液与管壁外的组织隔离开，从而起着物理屏障防护(barrier)的作用；

2)介导与血管周围组织交换氧气、二氧化碳、水、电解质，激素/蛋白或其他营养物质及代谢产物的转运、炎症细胞/免疫细胞的迁移等，从而起着通透(permeability)的作用。

在血液-组织间物质交换与代谢非常旺盛的组织器官如内分泌腺体、肝血窦、肾小球、骨髓、脾脏、胃肠道上皮、脑及眼睛视网膜脉络丛(choroidplexus)等区域,其血管内皮并不都是完全相连(continuous)或是有周皮细胞(pericyte)围绕包裹的，而是呈现断断续续的(discontinuous)或窦状样(sinusoid)(见综述：crivellatoe,nicobandribattid,2007contributionofendothelialcellstoorganogenesis,amodernreappraisalofanoldaristotelianconcept.janat211:415-427)。这些区域的血管内皮表面或血管管壁上还往往带有具有众多的直径大小一般在60–80nm的微小圆孔(fenestraeorpores)或凹洞(caveolae，又称为质膜膜泡，plasmalemmalvesicle)样结构。这些微小圆孔常几十个或上百个有序及等距离的聚集排列在一起，在电子显微镜下呈现出如网筛(sieveplate)或蜂窝样形状。有些微小圆孔的内部还嵌有厚度仅为6-7nm左右的如树枝枝条样的隔模(fenestaldiphragem)结构(参见bearerelandorcil.1985jcellbiol.100:418–428；peterskr，carleyww，paladege.1985jcellbiol.101:2233-8；lomarditetal.,1986jcellbiol.102:1965–1970)。

血管-组织间的物质交换及细胞迁移一般有两种途径：1)通过血管内皮细胞之间的空隙穿越迁移(para-cellularmigration)；2)通过血管内皮上/血管管壁上的微孔(fenestrae)或凹洞(caveolae)从血管壁一侧穿越或翻转到血管壁另一侧(trans-endotheialmigration)。内皮血管有无周皮细胞(pericyte)围绕包裹、内皮血管之间连接的紧密程度与空隙大小、内皮血管管壁上有无微孔(fenestrae)，以及微孔内是否带有枝条隔膜(diphragem)等因素，都会影响血管的屏障结构与通透性，进而控制血管-组织间的物质交换及细胞迁移的效率与程度：其中伴有周皮细胞(pericyte)围绕包裹的、紧密相连的、且管壁上无微孔的内皮血管通透性最差，其物质交换效率及细胞迁移的程度相应也最低；不伴有周皮细胞(pericyte)围绕包裹、断断续续的、且管壁上有微孔的内皮血管(如肝血窦区域)通透性最高，物质交换效率及细胞迁移的程度相应也最高；而微孔内含枝条隔膜的有孔内皮血管，其通透性一般低于微孔内不含枝条隔膜的有孔内皮血管。

目前唯一已知的构成内皮血管微孔中的隔模(fenestaldiphragem)或质膜凹洞颈部的隔膜(stomataldiaphragm)的物质为质膜膜泡关联蛋白(plasmalemmavesicle-associatedprotein，plvap)。plvap又简称pv-1，是一种特异表达在内皮血管上的糖蛋白；其cdna及其编码蛋白氨基酸序列最早是由stanrv等从大鼠肺组织中克隆获得并报道(stanrv,ghitescul,jacobsonbs,paladege:1999jcellbiol.145:1189-9；stanrv,kubitzam,paladege.1999procnatlacadsci96:13203–13207)。其后，stanrv等又报道了人及小鼠的plvap/pv1基因及其cdna与编码氨基酸序列(stanrv,ardenkc,paladege2001genomics72:304–313；综述见：stanrv.2007endothelialstomatalandfenestraldiaphragmsinnormalvesselsandangiogenesis.jcellmolmed.621–643)。

pv-1为单次跨膜的ii型膜蛋白(type-iitransmembraneprotein)，蛋白分子量在55-60kd左右。大鼠及小鼠的pv-1蛋白全长有438个氨基酸(人的pv-1蛋白有442个氨基酸)，其胞内区较短(含27个氨基酸)，位于n-端；位于c-端的胞外区较长(含358个氨基酸)，暴露于血管管腔中。

在正常生理状态下，pv-1基因除在一些内分泌腺体如脑垂体(pituitarygland)、肾上腺、脑或视网膜脉络膜丛(choroidplexus)及肺组织中表达较高之外，在体内其他组织中表达水平都较低(一般仅维持本底表达)或无表达(hnaskoretal.,2002jendocrinol1.75:649-61)。但在发生如肿瘤、缺氧/外伤及炎症等伴有血管新生的病理变化时，这些组织中的pv-1基因的表达则有明显上调(maddensletal.,2004amjpathol.165:601–608；carson-walterebetal.,2005clincancerres.11:7643-50；liuyetal.,2010jneuroncol.99:13–24；mozerabetal.,2010currneurovascres.7:238-50)。

血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)(leungdwetal.,1989science246:1306-09)，又称为血管渗透因子(vascularpermeabilityfactor，vpf)(keckpjetal.,1989science246:1309-12)是目前已知最强烈及最重要的刺激血管新生与渗透的物质(carmelietpetal.,1996nature380:435-438；ferraranetal.,1996nature380:439-412)。vegf/vpf也是目前已知的诱导血管内皮质膜微孔结构形成及上调pv-1基因表达的最主要因子(robertswgandpaladege.1995jcellsci.108:2369–2379；robertswgandpaladege.1997cancerres.57:765-772；robertswgetal.1998amjpathol.153:1239-48；essersetal.,1998jcellbiol140:947–959；stricklandlaetal.,2005jpathol.206:466–475；ioannidousetal.2006procnatlacadsci103:16770-16775)。

其他一些因子如肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，il-6)、促肿瘤因子佛波酯乙酸酯(phorbolmyristateacetate，pma)等也可刺激内皮质膜微孔的形成与上调pv-1基因表达(lombarditet.al.1986jcb102:1965-1970；stanrvetal.2004molbiolcell15:3615–3630；stricklandlaetal.,2005jpathol.206:466–475)。

最早的一项关于pv-1生理功能研究报道是来自于keuschniggj等2009年在blood杂志上发表的文章(keuschniggjetal.,2009blood.114:478-84.theprototypeendothelialmarkerpal-eisaleukocytetraffickingmolecule)。pal-e实际上是一鼠源单克隆抗体的代号，其全名为pathologischeanatomieleiden-endothelium(schlingemannroetal.,1985labinvest.52:71-6)，其识别的抗原主要特异表现在血管上；niemelah等报道pal-e单抗识别的抗原是人质膜膜泡关联蛋白(pv-1)(niemelahetal.,2005blood.；106:3405-3409)。keuschniggj等发现tnf-α激活后的脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，huvec)中，pal-e/pv-1蛋白明显地向内皮细胞膜周边聚集，并围绕着正在穿越脐静脉内皮细胞的淋巴细胞周围；加入pal-e/pv-1抗体可抑制淋巴细胞的穿越迁移；在小鼠体内急性腹膜炎和气囊炎模型中，经尾静脉注射代号为meca-32的抗体后，小鼠腹腔中单核或淋巴细胞的数量下降达85％(keuschniggjetal.,2009blood.114:478-84)。

plvap/pv-1在内皮血管微孔中枝条隔膜的形成及其在调控血管屏障/渗透性上的重要性最近已在基因敲除的小鼠中得到了明确的证明：如stanrv等2012年在devcell.杂志报道：pv-1基因敲除的小鼠，在c57bl/6n背景下，胚胎无法成活；在混合遗传背景中，少数胚胎可以成活到出生。pv-1基因敲除的小鼠无法形成血管内皮质膜微孔隔膜或凹洞隔膜；隔膜的缺失使内皮细胞渗漏性增高，导致蛋白大量渗漏到血管外，组织出现水肿，出生动物在发育早期因发生严重的非炎性的蛋白丢失性肠炎而死亡(stanrvetal.,2012devcell.23:1203-18)。

类似的，herrnbergerl等2012年在histochemcellbiol杂志报道：plvap(pv-1)基因敲除的小鼠纯合子(plvap^-/-)胚胎，在c57bl/6n遗传背景中在出生前死亡，出现皮下水肿、出血以及皮下毛细血管血管壁缺陷等异常。此外，plvap^-/-胚胎的心脏表现出室间隔缺损和更薄的心室壁。在c57bl/6n/fvb-n混合遗传背景中，plvap^-/-胚胎虽可以发育到出生，但出生的小鼠最多只能存活4周(herrnbergerletal.,2012histochemcellbiol.138:709-24)。

在正常状态下，体内存在血管-组织屏障保护的区域如中枢神经系统中血管-脑组织屏障(blood-brainbarrier)，眼睛中血管-视网膜屏障(blood-retinalbarrier)，其内皮血管管壁上一般无质膜微孔，也不表达pv-1/pal-e抗原。但在一些病理状态下，如缺血性脑中风(ischemicstroke)、脊髓损伤、实验性变态反应性脑脊髓炎(experimentalallergiccephalomyelitis,eae)/多发性脑脊髓硬化症(multiplesclerosis，ms)、脑部原发性或转移性肿瘤、糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy)等情况下，这些区域的血管-组织屏障结构往往遭到破坏，其内皮血管管壁表现有微孔并伴有pv-1/pal-e抗原的上调表达(carson-walterebetal.，2005，clincancerres.11:7643-50；shueehetal.，2008bmcneurosci9:29；mozerabetal.，2010currneurovascres.7:238-508)。比如，shueeh等在小鼠脑动脉栓塞诱导的急性脑缺血(cerebralischemia)模型中发现，pv-1/pal-e抗原在急性脑缺血发生后48小时开始表达在栓塞区域少数脑血管上，到第7天左右栓塞区域脑血管pv-1/pal-e抗原的表达达峰值(shueehetal.2008bmcneurosci9:29)。

类似的，schlingemannro等发现在糖尿病视网膜病变患者及血管-视网膜屏障结构受到破坏的糖尿病小鼠akimba中，视网膜内皮血管管壁有pv-1/pal-e抗原上调表达，且其上调表达水平高低与血管-视网膜屏障结构的受破坏程度及渗透性正相关(schlingemannroetal.,1999，diabetologia.42:596-602；wisniewska-krukjetal.,2014，expeyeres.122:123-31)。通过慢病毒介导的沉默干扰rna(sirna)技术，抑制内皮细胞中pv-1基因的表达，可以防止或减少vegf诱导的内皮血管质膜微孔/凹洞的形成及对血管-视网膜屏障结构的破坏(wisniewska-krukjetal.2016amjpathol.186:1044-54)。

因此，plvap(pv-1)不但是构成内皮质膜微孔隔膜(fenestaldiphragem)及凹洞隔膜(stomataldiaphragm)的主要成分，支撑起内皮血管质膜微孔或凹洞结构，而且也直接参与调控血管新生与渗透。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题之一是提供一种可特异识别与结合人质膜膜泡关联蛋白plvap(或pv-1)抗原的单克隆抗体或其衍生体如抗体fab-片段、fv-片段、单链抗体、双特异抗体(bi-specific)、抗体-药物嫁接物(antibody-drug-conjugated，adc)、嵌合抗原t细胞受体(chimericantigenreceptort-cell,car-t)等。

该单克隆抗体或其衍生体可单独作为主要活性成分，制成合适药物制剂，用于干预plvap(pv-1)介导的血管新生/渗透，达到治疗或延缓相关疾病的发生发展的效果。其中适合用该抗体治疗的与血管新生/渗透关系比较密切的疾病包括各种恶性肿瘤、年龄相关性眼底黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，amd)、糖尿病视网膜病变如糖尿病性黄斑水肿(diabeticmacularedema，dme)等。

抗plvap(pv-1)抗体在治疗上述疾病时，还可以与目前已上市或在研的其他药物序贯或组合使用。

本发明要解决的技术问题之二是提供编码上述抗体的dna分子或基因。

本发明要解决的技术问题之三是提供含有上述抗体的药物或药物组合物。

本发明要解决的技术问题之四是提供含有上述抗体的药物或药物组合物在治疗与血管新生/渗透相关的疾病尤其是在如脉络膜新生血管眼底疾病的应用。

本发明要解决的技术问题之六是提供含有上述抗体的试剂或试剂盒，用于检测分析plvap(pv-1)蛋白或体内外跟踪标识plvap(pv-1)表达阳性的组织细胞。

本发明要解决的技术问题之七是提供制备上述抗体的方法。

鉴于plvap(pv-1)抗原一般只在炎症、肿瘤、糖尿病视网膜病变等病理状态下，才选择性地表达在病变区域内皮血管管壁的微孔中，因此，体内如给予特异识别plvap(pv-1)蛋白的抗体后，抗体与血管管壁微孔中的隔膜交联或结合在一起，可以形成物理堵塞或封闭血管管壁微孔，从而防止或降低血管的渗透/渗漏。这种特异识别与结合血管内皮管壁上plvap(pv-1)蛋白的抗体或其衍生体作为活性成分，可制成合适药物制剂用于治疗或干预与血管新生/渗透密切相关的疾病。这些单克隆抗体或其衍生体，因其特异集聚结合在新生血管或内皮血管管壁，故还可作为靶向载体与其他药物如抗肿瘤化学药物、放射线药物或毒素嫁接或包裹在一起，形成抗体-药物偶联物(antibody-drug-conjugated，adc)，一同运输聚集到肿瘤区域的新生血管管腔里，达到栓塞肿瘤区域血管与药物杀伤肿瘤细胞的双重作用效果。特异结合plvap(pv-1)抗原的抗体或其衍生体如抗体-药物偶联物(antibody-drug-conjugated，adc)还可与已上市或在研的其他药物序贯或组合使用来治疗与血管新生/渗透的相关疾病。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明第一方面，提供了一种特异结合人质膜膜泡关联蛋白pv-1蛋白胞膜外区域的、全新的单克隆抗体或其衍生体。该单克隆抗体或其衍生体包含第一可变区和第二可变区，其中所述第一可变区是抗体轻链可变区，其抗原互补决定区cdr1，cdr2和cdr3分别为seqidno：17，seqidno：18及seqidno：19所示的氨基酸序列；其中所述第二可变区是抗体重链可变区，其抗原互补决定区cdr1，cdr2和cdr3分别为seqidno：22，seqidno：23及seqidno：24所示的氨基酸序列。

所述抗体包括鼠源抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体等，所述衍生体包括抗体fab片段、fv片段、单链抗体(single-chainantibody)、双特异抗体(bi-specificantibody)、抗体-药物嫁接物(antibody-drug-conjugated，adc)、嵌合抗原t细胞受体(chimericantigenreceptort-cell,car-t)等。

作为本发明优选的技术方案，所述第一可变区是抗体轻链可变区，为seqidno：16所示的氨基酸序列；其所述第二可变区是抗体重链可变区，为seqidno：21所示的氨基酸序列。

作为本发明优选的技术方案，其包含所述抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区，及包含所述抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的铰链区，ch1区，ch2区和ch3区。

作为本发明优选的技术方案，所述人抗体轻链恒定区来自人抗体kappa链或人抗体lamda链，所述人抗体重链恒定区来自人igg1，igg2，igg3或igg4等亚型、iga或igm，其中优选的为igg1或igg4亚型。

在本发明第二方面，提供了一种编码上述抗体或其衍生体的dna分子或基因核苷酸序列，其抗体轻链可变区基因核苷酸序列为seqidno：15所示，抗体重链可变区可基因核苷酸序列为seqidno：20。

本发明的第三方面是提供了一种表达载体，它含有编码上述抗体或其衍生体的dna分子/基因核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

本发明的第四方面提供了一种重组宿主细胞，它由上述表达载体转化而成。该重组宿主细胞或其子代细胞表达上述抗体或其衍生体。该抗体包括鼠源抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体等；衍生体包括抗体fab-片段、fv-片段、单链抗体、双特异抗体(bi-specificantibody)、抗体-药物偶联物(antibody-drug-conjugated，adc)、嵌合抗原t细胞受体(chimericantigenreceptort-cell,car-t)等。

本发明的第五方面是提供一种药物或药物组合物，它含有药学上有效量的上述抗体或其衍生体，以及药学上可接受的载体或辅料。

本发明的第六方面是提供上述抗体的药物或药物组合物在制备治疗与血管新生或渗透相关疾病。其中与血管新生/渗透关系密切的疾病包括各种恶性肿瘤及脉络膜新生血管眼底疾病如年龄相关性眼底黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，amd)、糖尿病视网膜病变如糖尿病性黄斑水肿(diabeticmacularedema，dme)、视网膜静脉阻塞(retinalveinocclusion)等。

作为本发明优选的技术方案，所述的药物组合物还含有药学上有效量的拮抗阻断血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)或其受体(vegf-r)活性成分，以及药学上可接受的载体。本发明中的plvap(pv-1)抗体作为药物制剂成分，用于治疗与血管新生/渗透关系密切的疾病如恶性肿瘤或眼底脉络膜新生血管疾病时，还可以与靶向vegf/或vegf受体(vegf-r)的药物序贯或合并使用。其中优选的靶向vegf/或vegf受体的药物包括大分子生物药物如抗-vegf单抗药物贝伐单抗(bevacizumab，商品名avastin)、抗vegf单抗fab片段雷珠单抗(ranibizumab，商品名lucentis)；抗-vegfr2单抗雷莫卢单抗(ramucirumab，商品名gyramza)及代号为hpv19的抗-人vegf单抗(思坦维公司目前在研药物，见中国专利文献：授权专利号：201210540692x，专利名称：拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途；及授权专利号为us9580498b2的美国专利文献)；或vegf受体-fc融合蛋白药物如阿普西普(albercept，商品名:eylea)、康帕西普(conbercept)等。优选的靶向vegf/或vegf受体的小分子化学药物包括舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、阿帕替尼(apatinib)、帕唑帕尼(pazopanib)等。

作为本发明优选的一技术方案，本发明中的plvap(pv-1)抗体在局部给药治疗眼底疾病时，因主要是依赖于该抗体与血管管壁上微孔隔膜的特异结合后，形成的对血管管壁上洞口物理堵赛或封闭，而达到防止或减低血管渗透，故作为药物成分，该抗体在制备上可以更多考虑采用野生型或基因改造过的人igg4、igg2亚型抗体的恒定区，或制成不带抗体恒定区的抗体fab-片段、fv-片段、单链抗体等，以降低或消除抗体介导的依赖细胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity，adcc)或补体介导毒性(complemnt-dependentcytotoxicity，cdc)，减少对治疗区域的血管或组织细胞的直接杀伤。野生型或基因改造过的人igg4、igg2亚型抗体的恒定区，及不带抗体恒定区的抗体fab-片段、fv-片段、单链抗体等可分别采用本领域人员已知的基因工程技术克隆获得或体外合成制备。

作为本发明优选的另一技术方案，本发明中的plvap(pv-1)抗体在治疗肿瘤时，可以更多考虑采用野生型或基因改造过的人igg1、igm亚型抗体的恒定区，以保持或提高抗体的adcc或cdc，达到更强的杀伤肿瘤组织与细胞的效果。野生型或基因改造过的人igg1、igm亚型抗体的恒定区可以采用本领域人员已知的基因工程技术克隆获得，或体外合成制备。

本发明中的plvap(pv-1)抗体或其衍生体，因其具有的与肿瘤区域新生血管内皮或血管管壁特异结合的特征，故还可作为靶向载体与其他抗肿瘤药物或毒素嫁接或包裹在一起，形成抗体-药物偶联物(antibody-drug-conjugated，adc)，一同运输聚集到肿瘤区域的新生血管管腔中，达到更好的杀伤肿瘤的效果。抗体与药物或毒素的嫁接或包裹方法可以采用本领域人员已知的通用技术。该类抗体-药物偶联物尤其适合用于治疗一般药物不易抵达部位如脑部的肿瘤，包括原发性脑肿瘤如神经胶质母细胞瘤或转移性脑肿瘤。在治疗脑部的肿瘤如神经胶质母细胞瘤，本发明中的plvap(pv-1)抗体或抗体-药物偶联物可以与口服小分子药物如替莫唑胺(temozolomide)合并使用。本发明中的plvap(pv-1)抗体或抗体-药物偶联物还尤其适合用于治疗plvap/pv1基因表达相对较高一些恶性肿瘤如原发性肝癌或转移癌性肝癌等，该类抗体药物还可以通过肝脏内血管局部注射给药，达到更精准的靶向治疗，并降低药物对身体其他部位产生副作用。

作为本发明优选的另一技术方案，本发明中的plvap(pv-1)抗体还可与靶向免疫抑制检查点(inhibitoryimmunecheckpointmolecules)的单抗药物序贯或合并使用，用于治疗原发性(如神经胶质母细胞瘤)或转移性脑部肿瘤、肺癌、胃/食道癌、肝癌、肾癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤。其中与plvap(pv-1)抗体序贯或合并使用的靶向免疫抑制检查点单抗优选药物包括抗-ctla4(cytotoxict-lymphocyteantigen-4)单抗伊匹单抗(ipilimumab，商品名yervoy)；抗pd-1(programmeddeathprotein1)单抗nivolumab(商品名opdivo)、pembrolizumab(商品名keytruda)及代号为hab21的单抗(思坦维公司在研的抗pd-1单抗，见pct专利申请文件：pct/cn2017/089282，拮抗抑制人pd-1抗原与其配体结合的单克隆抗体及其制备方法与应用)；抗pd-l1单抗药物包括atezolizumab(商品名tecentriq)、avelumab(商品名bavencio)、durvalumab(商品名imfinzi)等。

作为本发明优选的另一技术方案，本发明中的plvap(pv-1)抗体还可先在制备成嵌合抗原t细胞受体(chimericantigenreceptort-cell,car-t)，体外导入到从肿瘤患者外周血液中分离获得的免疫细胞如t-淋巴细胞中，再经体外培养扩增后，这些具识别plvap(pv-1)抗原的淋巴细胞再回注入体内，再在体内发挥靶向肿瘤区域的血管内皮细胞及新生血管，从而达到治疗肿瘤的效果。与直接靶向肿瘤抗原如cd19,cd20的普通的car-t相比，本发明的car-t通过特异靶向肿瘤区域血管内皮细胞及新生血管，其作用不依赖于肿瘤抗原的表达，可用于治疗多种类型的实体瘤。将本发明中的plvap(pv-1)抗体制备成嵌合抗原t细胞受体(car-t)可以采用本领域技术人员已知的常规技术。

在本发明具体实施实例中，描述了人-鼠嵌合plvap(pv-1)抗体作为单独成分或与抗-vegf抗体组合使用，在食蟹猴体内治疗脉络膜新生血管眼底疾病的应用。

本发明的第七方面提供一种与人及猴质膜膜泡关联蛋白pv-1都能结合的的单克隆抗体或其衍生体，所述抗体与具氨基酸序列如seqidno：8或seqidno：25所示的抗原结合，并与上述的抗体或其衍生体竞争结合pv-1。

本发明第八方面是提供一种拮抗阻断质膜膜泡关联蛋白pv-1介导的体内血管新生或渗透的方法，给予适当剂量的所述的抗体或其衍生体。

本发明的第九方面提供含有上述抗体或其衍生体的检测试剂或检测试剂盒，用于检测分析组织或细胞样品中质膜膜泡关联蛋白plvap(pv-1)或体内外跟踪标识plvap(pv-1)表达阳性的组织细胞。

本发明第十方面是提供制备上述抗体或其衍生体的方法，该方法包括如下步骤：

a)提供一表达载体，该表达载体含有编码所述抗体或其衍生体的上述dna序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞如cho细胞；

c)在适合所述抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和

d)采用亲合层析从该宿主细胞培养液中分离纯化获得所述抗体。

本文所采用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本文所采用的术语“人源化单克隆抗体”系将鼠源单克隆抗体的氨基酸序列除保留互补决定区(complementarity-determiningregions，cdr)外，其它序列(包括可变区中的框架区序列)全部或大部分替换成人免疫球蛋白的氨基酸序列，以达到通过基因工程手段最大限度地降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性。

本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(lightchain)和两个相同的重链(heavychain)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(vl)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中成为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(frameworkregions，fr)。抗体重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等，nihpubl.no.91-3242，卷1，647-669页(1991))。抗体恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体介导的依赖细胞毒性(adcc)或补体介导毒性(cdc)。

本发明的抗体通常可以通过以下方法来制备：

首先，将含有编码本发明的抗体的基因插入到含有合适的表达调控序列的表达载体中。

本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制基因表达的序列。表达调控序列包括与目标基因操作性相连的启动子和终止信号。编码本发明抗体的基因(dna)序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的蛋白质序列人工合成或用pcr法扩增得到。其后可用本领域熟知的各种方法将合成或pcr扩增得到的dna片段插入到合适的表达载体中。本发明中所用的表达载体可以是本领域技术人员已知的市售表达载体，如invitrogen公司的pcdna3.1表达载体。

用于接纳表达载体转化的合适宿主细胞一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。在本发明中，较佳的宿主细胞是哺乳动物细胞，尤其是中华仓鼠卵巢(cho)细胞。

表达载体转化的宿主细胞在合适的条件下(如以无血清培养基在细胞培养瓶或生物反应器中贴壁或悬浮培养)培养后，收获培养上清液，然后用包括protein-a亲和层析、离子交换层析、过滤除菌等本领域技术人员熟知的常规分离步骤或手段纯化得到本发明的抗体。

纯化得到的本发明抗体可以溶于适当的溶剂如无菌生理盐水液体中，溶度可以制备成0.01至100mg/ml之间，理想的最终溶度可以制备成1mg/ml至40mg/ml之间。

为获得一种特异结合plvap(pv-1)蛋白的鼠源单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系，本发明选取哺乳动物细胞(cho细胞)表达的重组人pv-1蛋白胞膜外区域为免疫抗原，通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，获得分泌抗人pv-1蛋白的多克隆抗体；再从中挑取含高效价抗体的小鼠，取其脾脏细胞，通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合、再经药物筛选及亚克隆等步骤而建立了多株稳定分泌抗人pv-1蛋白的抗体的杂交瘤单克隆细胞。其中一代号为stw-139-15的小鼠杂交瘤细胞株，经elisa、免疫组化、流式细胞仪等多种检测方法鉴定，证实其所分泌的单克隆抗体不但能够特异与人正常组织细胞及肿瘤组织中的pv-1蛋白结合，而且也可与猴组织中pv-1蛋白结合。

本发明通过基因工程等手段从小鼠杂交瘤细胞株stw-139-15中克隆获得了编码该鼠源抗体重链可变区蛋白的基因序列及轻链可变区蛋白的基因序列；在此基础上对该抗体进行了人源化改造，获得人-鼠嵌合抗体stw-139-15-c及其表达载体。该表达载体经转染进入中华仓鼠卵巢(cho)细胞，获得稳定高效分泌表达该人-鼠嵌合抗体的重组工程细胞。该重组工程细胞经规模化培养后，收获培养液上清。上清液经离心及0.45μm滤膜过滤后，上样至含protein-a的亲和层析柱分离纯化，获得纯化的人-鼠嵌合抗体stw-139-15-c蛋白。

分离纯化的stw-139-15-c抗体蛋白经过滤除菌后，可再溶于合适的溶剂中，制备成药物制剂，用于体内外测试其生物或药理活性。

其中一种体内测试该人-鼠嵌合抗体药理活性的方法是采用激光照射诱导的食蟹猴眼底脉络膜新生血管疾病模型，通过眼睛玻璃体内局部注射给药，考察stw-139-15-c抗体单独给药或与抗-vegf抗体药物合并给药对脉络膜新生血管生长和渗漏的抑制作用，并与抗-vegf抗体药物单独给药的抑制作用效果作比较。测试结果表明特异结合plvap/pv-1的stw-139-15c单抗单独给药或与抗vegf-单抗合并使用，对食蟹猴体内激光诱导的脉络膜新生血管渗透均具有明显的抑制作用，可用于治疗与血管新生/渗透的相关疾病。

附图说明

图1为本发明实施例1中人pv-1蛋白与小鼠pv-1蛋白的氨基酸序列比对分析示意图。

图2为本发明实施例1中重组人pv-1-his蛋白的sds-page分析电泳图谱；其中泳带1为dtt-还原样品；marker代表蛋白质分子量标准品(kd)。

图3为本发明实施例1中免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)方法检测免疫小鼠血清及杂交瘤细胞上清液样品与瞬时转染人pv-1基因的cho细胞(cho/pv-1)特异结合的代表性结果示意图。其中，图3a为未融合的sp2/0骨髓瘤细胞培养上清液样品(为阴性对照)；图3b为人pv-1蛋白免疫后小鼠血清样品(1:200稀释)；图3c为小鼠杂交瘤细胞stw-139-15培养上清液样品。

图4为本发明实施例2中elisa法检测小鼠杂交瘤细胞stw-139-15培养上清液样品与包被在96-孔板上的重组人pv-1胞膜外蛋白结合的结果示意图。其中mab113为一株非相关小鼠单抗(anti-sost单抗)样品，阴性对照样品为未融合的sp2/0骨髓瘤细胞培养上清液样品。

图5为本发明实施例3中elisa法检测对比分析鼠源单抗stw-139-15样品与重组人pv-1-fc融合蛋白及其他多个非相关基因的重组蛋白或fc融合蛋白结合的结果示意图。

图6为本发明实施例4中流式细胞仪检测分析鼠源单抗stw-139-15样品与稳定转染了人pv-1基因的cho细胞(cho/pv-1)结合的代表性结果示意图。其中图6a为未融合的sp2/0骨髓瘤细胞培养上清液样品(为阴性对照)，图6b为非相关小鼠单抗mab21(anti-pd-1单抗)样品；图6c为人pv-1蛋白免疫后小鼠血清样品(1:200稀释，为阳性对照)；图6d为小鼠杂交瘤细胞stw-139-15培养上清液样品。

图7为本发明实施例4中流式细胞仪检测系列梯度稀释的鼠源单抗stw-139-15样品与稳定转染了人pv-1基因的cho细胞(cho/pv-1)结合的抗体溶度-平均荧光值(meanfluorescence)量效-反应曲线(dose-respone)图。

图8为本发明实施例4中流式细胞仪检测分析鼠源单抗stw-139-15样品与cho及cho/pv-1细胞的混合样品(9：1混合)结合的代表性结果示意图。中图8a为未融合的sp2/0骨髓瘤细胞培养上清液样品(为阴性对照)；图8b为非相关小鼠单抗mab21(anti-pd-1)样品；图8c为鼠源单抗stw-139-15样品。

图9为本发明实施例5中流式细胞仪检测分析鼠源单抗stw-139-15样品与人huvec细胞结合的代表性结果示意图；其中，a01nc为未融合的sp2/0骨髓瘤细胞培养上清液样品(为阴性对照)。

图10为本发明实施例6中免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)方法检测鼠源单抗stw-139-15样品与人正常组织组织切片结合的代表性结果示意图。其中，图10a代表组织切片为肺lung，图10b代表组织切片为肝liver，图10c代表组织切片为脑brian，图10d代表组织切片为胰腺pancreatictissue，图10e代表组织切片为心heart，图10f代表组织切片为脾spleen。

图11为本发明实施例7中免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)方法检测鼠源单抗stw-139-15样品与人肿瘤组织组织切片结合的代表性结果示意图。其中，图11a代表人肿瘤组织组织切片为肺癌lungcancer，图11b代表人肿瘤组织组织切片为肝癌livercancer，图11c代表人肿瘤组织组织切片为脑瘤braintumor，图11d代表人肿瘤组织组织切片为胰腺癌pancreaticcancer，图11e代表人肿瘤组织组织切片为卵巢癌ovariancancer，图11f代表人肿瘤组织组织切片为淋巴瘤lymphoma。

图12为本发明实施例8中人pv-1蛋白与猴pv-1蛋白的氨基酸序列比对分析示意图。

图13为本发明实施例8中以流式细胞仪检测分析检测鼠源单抗stw-139-15样品与转染了猴pv-1基因的cho细胞(cho/monkypv-1)结合的代表性结果示意图。其中图13a为未融合的sp2/0骨髓瘤细胞培养上清液样品(为阴性对照)；图13b为非相关小鼠单抗mab7(anti-pd-1)样品；图13c为鼠源单抗stw-139-15样品。

图14为本发明实施例10中elisa法检人-鼠嵌合抗体stw-139-15-c样品与包被在96-孔板上的重组人pv-1胞膜外蛋白结合的结果示意图。

图15a至图15d分别为本发明实施例11中食蟹猴激光光凝后3周，动物经玻璃体注射给药一针后在观察期间各时间点的眼底荧光造影图片。其中图15a为阴性对照(0.9％nacl注射液)治疗组造影图片，图15b为stw-139-15c单抗测试样品给药组造影图片，图15c为阳性对照药物hpv19单抗(抗-vegf单抗)给药组造影图片，图15d为测试样品tw-139-15c单抗与阳性对照药物hpv19单抗合并给药组造影图片。

具体实施方式

下面将结合实施实例来进一步描述本发明，这些实施例只是为了起说明作用，而不是用来限制本发明。

实施例1:分泌抗人pv-1抗体的小鼠杂交瘤细胞系的建立与筛选鉴定

1.1人pv-1蛋白的氨基酸序列与小鼠pd-1蛋白的氨基酸序列比对分析

人pv-1蛋白的氨基酸序列(ncbireferencesequence:np_112600.1)(seqidno:1)与小鼠pv-1蛋白的氨基酸序列(ncbireferencesequence:np_115774.2)(seqidno:2)的比对分析如图1：其中n-端的20多个氨基酸位于细胞膜内(序列以斜体标注)，以方框粗体标注的氨基酸序列为pv-1蛋白的跨膜区(transmembraneregion)，其后的c-端氨基酸序列(人：aa53-442；小鼠：aa53-438)均位于细胞膜外，其中包括4个n-糖基化位点(方框标注)及9个半胱氨酸cysteine(下划线标注)。在氨基酸序列上，人pv-1蛋白与小鼠pv-1蛋白整体同源性仅有62％；其中在胞膜外区域，人pv-1蛋白和小鼠pv-1蛋白的氨基酸差异位点数超过100多个。因此推测，如采用传统的抗原蛋白免疫小鼠及杂交瘤制备技术，应可以制备出针对人pv-1胞膜外抗原区域的小鼠抗体。

1.2重组人pv-1蛋白(免疫抗原)的表达与制备

在本发明实施例中，首先从人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，huvec)获取总rna，经逆转录pcr(reversetranscription-polymerasechainreaction，rt-pcr)获得cdna。再以该cdna为模板,利用pcr技术克隆获得编码人pv-1蛋白的基因片段。经dna序列测定鉴定正确，用限制性dna内切酶处理后，将其克隆到可以在cho细胞中高效表达外源基因的dna质粒中，获得相应的重组表达质粒。

1.2.1编码人pv-1全长蛋白的基因克隆获得及其表达质粒的构建

该表达质粒的构建过程如下：

首先以上述cdna为模板，通过利用如下一对引物，经pcr成功扩增获得了编码人pv-1全长蛋白的目的基因片段(长度为1345bp左右)：

正向引物hpv-1-his-f-hindiii：aactaagcttgccaccatgggtctggccatggagcacgga(seqidno:3)；

反向引物hpv-1-his-r-xhoi：accactcgagtcagtgatggtgatggtgatggccactggatggggctacagggat(seqidno:4)

pcr扩增获得的dna经回收及限制性dna内切酶处理后，克隆到pcdna3.1表达质粒(inivtrogen)；获得重组质粒。重组质粒经内切酶酶切及dna测序鉴定，确认成功获得可在cho细胞膜上表达外源人pv-1基因的重组质粒(质粒名称：pqy-pv-1)。

1.2.2c-端带his-6标签的人pv-1胞膜外重组蛋白表达质粒的构建-

以上节(1.2.1)中的pcr回收产物为模板，利用如下一对引物，经pcr成功扩增获得了c-端带编码6个组氨酸(histidine)序列标签的人pv-1胞膜外蛋白基因片段(pv-1-his)：

正向引物hpv-1-fc-f-bglii：gtggagatctcacgtgagcacagagtccaacctg(seqidno:5)；

反向引物hpv-1-his-r-xhoi：accactcgaggtgatggtgatggtgatggccactggatggggctacagggat(seqidno:4)

pcr扩增获得的dna经回收及限制性dna内切酶处理后，转入带有信号肽的表达载体pcdna3.1-dhfr中，获得重组质粒。重组质粒经内切酶酶切及dna测序鉴定，确认成功获得可在cho细胞中分泌表达hpv-1-his重组基因的表达质粒(质粒名称：pqy-dhfr-pv1-his)。

1.2.3重组人pv-1-fc融合蛋白表达质粒的构建-

该表达质粒的构建过程如下：

先以上节(1.2.1)中的pcr回收产物为模板，利用如下一对引物，经pcr成功扩增获得了hpv-1胞外区基因片段(长度1176bp左右)：

正向引物hpv-1-fc-f-bglii:gtggagatctcacgtgagcacagagtccaacctg(seqidno:5)

反向引物hpv-1-fc-r-bamhi:gtgggcatgtgtgagtggatccgccactggatggggctacag(seqidno.:6)

其后，再以该pcr回收产物为模板，利用如下一对引物，再经pcr成功扩增获得hpv-1胞外区基因与编码人igg1-fc段基因相融合的重组基因(长度为1859bp左右)：

正向引物hpv-1-fc-f-bglii:gtggagatctcacgtgagcacagagtccaacctg(seqidno:5)

反向引物pv1-dhfr-xbai-r:taactctagatcatttacccggggacaggg(seqidno:7)

该pcr扩增获得的重组基因dna经回收及内切酶酶切处理后，克隆到表达载体pcdna3.1-dhfr中，获得重组质粒。重组质粒经内切酶酶切及dna测序鉴定，确认成功获得可在cho细胞中分泌表达人pv-1-fc融合蛋白的表达质粒(质粒名称：pqy-dhfr-pv1-fc)。

1.3人pv-1-his重组蛋白及pv-1-fc融合蛋白(免疫抗原)的表达与制备

将上述表达质粒dna(pqy-dhfr-pv1-his，pqy-dhfr-pv1-fc)分别与fugen-6脂质体(roche)混合后转染入dhfr基因缺陷型cho细胞(cho-dhfr^-)。转染后经药物(氨甲喋呤，mtx)筛选，分别获得了可高效分泌表达人pv-1-his重组蛋白及人pv-1-fc融合蛋白的细胞株。筛选获得的表达细胞株用无血清培养基扩增培养，分别以ni-亲合层析柱或protein-a亲合层析柱从细胞上清中分离纯化，获得纯度达90％以上的人pv-1-his重组蛋白及人pv-1-fc融合蛋白。

图2为分离纯化获得的人pv-1-his重组蛋白(dtt-还原)的sds-page电泳分析图谱，结果显示dtt-还原的人pv-1-his蛋白样品中，其主要条带在55kd左右，这与其理论预期的蛋白分子量大小相符。

1.4重组人pv-1蛋白免疫动物

先以人pv-1-his重组蛋白与弗氏完全佐剂(美国sigma公司产品)混合后，于皮下多点注射balb/c小鼠(100μl/只，每次10μgpv-1-his蛋白)。首次免疫2-3周后，小鼠再给予皮下多点注射含人pv-1-fc融合蛋白与弗氏不完全佐剂(美国sigma公司产品)的混合物，加强免疫3-4次后，取少量小鼠血清，用包被人pv-1-fc融合蛋白的96-板以酶联免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)方法检测小鼠血清中抗pv-1抗体的效价，取效价高者小鼠的脾细胞用于下一步的细胞融合。

1.5细胞融合

在末次免疫后3-4天，无菌制备小鼠脾细胞悬液，与小鼠sp2/0骨髓瘤细胞(购自中国科学院上海生命科学院细胞保藏中心)，以5：1或10：1的比例在50％peg-1000(美国sigma公司产品)作用下融合。融合按常规法(kohlergandmilsteinc:nature1975；256:495-497),peg用量1ml，60秒内缓慢加完。反应90秒后，以无血清的rpmi-1640培养基终止反应，1000rpm离心10min,去除上清液，再将离心沉淀下的细胞以含10％hat(h为次黄嘌呤、a氨基碟呤、t胸腺嘧啶核苷，为美国sigma公司产品)的rpmi1640-10％fcs培养基将细胞浓度调节至1х10⁶/ml，加入96孔平底细胞培养板(每孔200μl)，于37℃，5％co2培养箱中(美国thermo公司产品)培养2-3周。

1.6免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)筛选pv-1抗体分泌阳性的小鼠杂交瘤细胞

在本发明实施例中，采用免疫组化方法从小鼠杂交瘤中筛选出pv-1抗体分泌阳性的细胞株

该方法简介如下：

1)、将转染人pv-1基因的cho细胞(cho/pv1)与未转染的cho细胞按1：6的比例混合铺于96孔细胞培养板上，于37℃，5％co2培养箱中过夜；

2)、取出细胞培养板，吸去培养液后，以含2％paraformaldehyde的phosphatebufferedsaline(pbs)(2％多聚甲醛pbs溶液)液固定，90％甲醇打孔；

3)、经pbs液洗涤后，加入一抗：小鼠杂交瘤上清或pv-1免疫小鼠血清(1：200稀释)为阳性对照样品，37℃孵育1小时；

4)、经pbs液洗涤后，加入二抗：hrp-goatantimouseigg(1:400)，37℃孵育1小时；

5)、经pbs液洗涤后，加入底物(dab，0.1％h2o2)显色。

图3为该免疫组织化学(ihc)筛选的代表性结果：

如图3所示：其中一代号为stw-139-15小鼠杂交瘤细胞培养上清(图3c)可明显与cho/pv-1与cho混合培养细胞特异结合，且其显色强度与显色阳性细胞的比例与阳性对照样品(pv-1抗原免疫后小鼠血清样品，图3b)相同；sp2/0骨髓瘤细胞上清液样品显色结果为阴性(图3a)，这也与预期的结果一致。

实施例2elisa法检测小鼠杂交瘤细胞stw-139-15上清液样品与重组人pv-1-fc融合蛋白的结合

上述初筛得到的阳性杂交瘤细胞以rpmi-1640-10％fcs培养基稀释至每孔1-10个细胞，铺于96-孔细胞培养板，于37℃，5％co2培养箱中培养2-3周。待克隆长成，取上清液以elisa再次检测鉴定抗pv-1抗体。

该elisa检测方法如下：

1)以重组人pv-1-fc融合蛋白(2μg/ml，ph9.6，0.1mnahco3液)包被96-孔板，37℃包被2小时后，再加入2％牛血清白蛋白(bsa)4℃封闭过夜。

2)次日，包被板经pbs-0.1％tween20液洗涤后，加入待检杂交瘤细胞培养上清液(以未融合的sp2/0骨髓瘤细培养上清为阴性对照)37℃孵育2小时；

3)经pbs-0.1％tween20液洗涤后，加入辣根过氧化物酶hrp-标记的羊抗小鼠igg(美国sigma公司产品)，37℃孵育1小时；

4)再经pbs-0.1％tween20液洗涤后，加入底物液(邻苯二胺opd，0.1％h2o2)显色10-15min；

5)加入0.1mhcl终止反应，其后在multiskan-fc酶标仪(美国thermoscientific公司产品)中读取492nm处od值。

图4为该elisa的代表性结果示意图。

如图4所示：小鼠杂交瘤细胞stw-139-15上清液样品中含有高滴度的可特异结合人pv-1-fc融合蛋白的抗体，而非相关单抗mab113样品(anti-sost单抗，sost为sclerostin的缩写，中文名：硬化蛋白)及sp2/0骨髓瘤细胞上清液样品均为阴性。

实施例3elisa检测分析鼠源stw-139-15单抗与人pv-1-fc融合蛋白及其他非相关蛋白的结合

在本实施例中，采用elsia检测分析了鼠源stw-139-15单抗与人pv-1-fc融合蛋白及其他非相关蛋白的结合。

为此，将人pv-1-fc融合蛋白及其他非相关蛋白(cd3、tigit-his、sirpa-his)或fc-融合蛋白(pd1-fc、pdl1-fc、pdl2-fc、mpdl1-fc、ctla4-fc、cd28-fc、b7-fc及btla-fc)以1ug/ml的浓度包被96-孔elisa板，鼠源单抗stw-139-15样品作为一抗，辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗小鼠igg(jackson公司产品)为二抗，再经底物液(邻苯二胺opd，0.1％h2o2)显色，以1mhcl终止反应；在multiskanmc-酶标仪(thermoscientific公司产品)中读取492nm处od值。

图5为该elisa检测结果。结果显示：鼠源单抗stw-139-15样品仅与人pv-1-fc融合蛋白特异结合(od值>1.0)，与cd3及其他非相关重组蛋白(带his-标签，或igg-fc融合蛋白)均无明显结合(od值均在0.1以下)。此结果表明stw-139-15单抗在抗原的识别与结合上具有高度的特异性，仅与pv-1蛋白结合。

实施例4流式细胞仪检测分析鼠源stw-139-15单抗与转染表达人pv-1基因的cho细胞(cho/pv-1)结合

在本实施例中，以鼠源单抗stw-139-15样品为一抗，以fitc荧光标记的兔抗小鼠igg为二抗，采用流式细胞仪检测分析stw-139-15单抗样品与表达人pv-1基因的cho细胞(cho/pv-1)结合。

为此,将稳定转染表达人全长pv-1重组蛋白基因的cho/pv-1细胞分别与小鼠杂交瘤stw-139-15上清样品、非相关小鼠杂交瘤mab21样品(anti-pd-1单抗)、pv-1抗原免疫后小鼠血清(阳性对照样品，1：200稀释)及小鼠sp2/0细胞上清(阴性对照样品)在4℃孵育1小时，经pbs-0.1％fcs液漂洗后，加入fitc-标记的兔抗小鼠igg(1：200稀释；southernbiotech公司产品)；4℃孵育1小时及再经pbs-0.1％fcs液漂洗后，上样至bdaccuric6plusflowcytometer流式细胞仪(美国bdbiosciences公司产品)检测。

图6为该流式细胞仪检测的代表性结果示意图。如图6所示：与阳性对照样品一样(图6c，pv-1蛋白免疫后小鼠血清)，小鼠杂交瘤stw-139-15上清样品可明显与cho/pv-1细胞特异结合(图6d)，而非相关杂交瘤样品(图6b)及阴性对照样品小鼠sp2/0细胞上清(图6a)与cho/pv-1细胞均无特异结合。

图7为流式细胞仪检测系列梯度稀释的鼠源单抗stw-139-15样品与稳定转染了人pv-1基因的cho细胞(cho/pv-1)结合的抗体溶度-平均荧光值(meanfluorescence)曲线，结果表明溶度在0.1-10ug/ml范围内stw-139-15单抗样品与cho/pv-1细胞的结合呈明显的剂量-效应反应曲线(dose-respone)。

图8则为流式细胞仪检测分析鼠源单抗stw-139-15样品与cho及cho/pv-1细胞的混合样品(9：1混合)结合的代表性结果示意图。如图8所示：与小鼠sp2/0细胞上清阴性对照样品(图8a)及非相关杂交瘤上清样品(图8b)相比，小鼠杂交瘤stw-139-15上清样品可明显与混合样品中的部份细胞特异结合(图8c)，结合的阳性细胞比例为9.67％，这与加入到混合样品中的cho/pv-1细胞比例(10％)相符。此结果进一步证明了stw-139-15只特异识别与结合pv-1抗原，与cho中的其他蛋白或抗原物质无结合。

实施例5流式细胞仪检测分析鼠源stw-139-15单抗与人huvec细胞结合

在本实施例中，以鼠源单抗stw-139-15样品为一抗，以fitc荧光标记的羊抗小鼠igg为二抗，采用流式细胞仪进一步检测分析了stw-139-15单抗与人huvec细胞的结合。

为此,，先将huvec细胞以0.1％tritonx-100固定打孔(permembilzation)；加入小鼠杂交瘤stw-139-15上清样品或小鼠sp2/0细胞上清为阴性对照样品；4℃孵育1小时及经pbs-0.1％fcs液漂洗后，再加入fitc-标记的羊抗小鼠igg(fitc-goatantimouseigg(h+l)，sigma公司产品)；4℃孵育1小时及再经pbs-0.1％fcs液漂洗后，上样至bdaccuric6plusflowcytometer流式细胞仪(美国bdbiosciences公司产品)检测。

图9为该流式细胞仪检测的代表性结果示意图。如图9所示：与小鼠sp2/0细胞上清阴性对照样品(a01nc)相比，小鼠杂交瘤stw-139-15上清样品可明显与人huvec细胞结合。

实施例6免疫组化(ihc)方法检测鼠源stw-139-15单抗与人正常组织组织切片结合

在本实施例中，采用免疫组化(ihc)方法检测分析了鼠源单抗stw-139-15样品与来源于人的部分正常组织切片的结合，其检测步骤如下：

人正常组织石蜡切片复水及抗原恢复处理后，加入鼠源单抗stw-139-15样品作为一抗，常温下孵育1小时及经洗涤后，再加入稀释的hrp标记的羊抗小鼠igg(二抗)，常温下孵育1小时及经洗涤后，加入底物dab显色，苏木素复染，封片，照相。

图10为该免疫组化的一代表性结果。如图10所示，在肺、肝、脑、心胰腺、脾等正常组织免疫组化染色切片中，stw-139-15单抗样品仅与肺组织特异结合，与其他组织切片显色结果不明显。stw-139-15单抗在肺组织免疫组化检测阳性这一结果也与文献报道pv-1基因在肺组织表达的结果相吻合，编码pv-1抗原的cdna当初就是从大鼠的肺组织中分离与克隆到的(stanrvetal.,1999jcellbiol.145:1189-98)。

实施例7免疫组化(ihc)方法检测鼠源stw-139-15单抗与人肿瘤组织组织切片结合

在本实施例中，采用免疫组化(ihc)方法检测分析了鼠源stw-139-15单抗样品与来源于人的部分肿瘤组织切片的结合，其检测步骤如下：

人肿瘤组织复水及抗原恢复处理后，加入鼠源stw-139-15单抗样品作为一抗，常温下孵育1小时及经洗涤后，再加入稀释的hrp标记的羊抗小鼠igg(二抗)，常温下孵育1小时及经洗涤后，加入底物dab显色，苏木素复染，封片，照相。

图11为该免疫组化的一代表性结果。如图11所示，stw-139-15单抗样品可与多种肿瘤组织(包括肺癌、肝癌、脑瘤、胰腺癌、卵巢癌等)区域的血管样结构特异结合；但与淋巴瘤组织的切片显色结果不明显。

鉴于stw-139-15单抗与多种恶性肿瘤组织结合，而与大多数正常组织不结合(见实施例6结果)，该单抗应是制备特异靶向肿瘤区域血管的药物或制剂的理想物质或载体。

实施例8流式细胞仪方法检测鼠源stw-139-15单抗与食蟹猴pv-1蛋白的结合

1)人及猴pv-1蛋白的胞膜外区域氨基酸序列比对分析

人pv-1蛋白的胞膜外氨基酸序列(seqidno:8)与食蟹猴(macacafascicularis)pv-1蛋白(ncbi:genbank:akg92647.1)的胞膜外区氨基酸序列(seqidno:25)的比对分析结果见图12。如图12所示：在蛋白序列上，猴pv-1蛋白与人pv-1蛋白的膜外区域同源性为95％，有17个氨基酸位点序列不相同。

2)表达猴pv-1基因的cho细胞株的构建

按照genbank公布的食蟹猴pv-1全长蛋白的氨基酸序列(ncbi:genbank:akg92647.1)，委托苏州金唯智生物科技有限公司人工合成相应的猴pv-1cdna片段，经限制性dna内切酶处理后，克隆到pcdna3.1-dhfr表达质粒，获得重组质粒。重组质粒经内切酶酶切及dna测序鉴定，确认成功获得可在cho-dhfr-细胞膜上表达食蟹猴pv-1全长蛋白的重组质粒(质粒名称：pcdna3.1-dhfr-mkpv1)。

将上述表达质粒dna与fugen-6脂质体(roche)混合后转染入dhfr基因缺陷型cho细胞(cho-dhfr-)。转染后经含8％fbs的普通imdm培养基筛选，获得表达食蟹猴pv-1全长蛋白的细胞株。

3)流式细胞仪分析鼠源单抗stw-139-15与cho-/猴pv-1细胞结合

采用如实施例4中描述的流式细胞仪方法检测分析了鼠源单抗stw-139-15样品与上述的表达食蟹猴pv-1全长蛋白的cho细胞(cho/monkypv-1)的结合。该流式细胞仪的代表性检测结果如图13所示：与阴性对照样品(sp2/0骨髓瘤细胞培养上清液,图13a)及非相关小鼠单抗样品mab7(anti-pd-1单抗,图13b)相比，鼠源单抗stw-139-15可与cho/monkypv-1细胞明显结合(图13c)。此结果初步表明食蟹猴pv-1蛋白其胞膜外氨基酸序列与人pv-1蛋白氨基酸序列上的差异位点并不影响stw-139-15单抗与其结合。stw-139-15单抗可特异与食蟹猴pv-1蛋白结合这一结果也提示食蟹猴是开展stw-139-15单抗体内研究的理想及相关动物。

实施例9.编码鼠源stw-139-15单抗可变区基因的克隆扩增与分析

在本实施例中，先从小鼠杂交瘤细胞stw-139-15中提取出总rna中，再以该rna为模板，采用简并引物(degenerateprimers)，以reversetranscription-polymerasechainreaction(rt-pcr)法(wangy等：degeneratedprimerdesigntoamplifytheheavychainvariableregionfromimmunoglobulincdna。bmcbioinformatics.2006；7suppl(4):s9)分别克隆扩增获得stw-139-15抗体重链可变区及轻链可变区的cdna基因片段。其中cdna基因克隆步骤如下：

步骤1、采用rna提取试剂(rnaisoplus，takara公司产品)从小鼠杂交瘤细胞stw-139-15中提取出总rna；

步骤2、采用逆转录pcr(rt-pcr)方法在eppendorf管获得cdna模板。

其中用于stw-139-15抗体轻链可变区逆转录pcr引物(stw-139-15-l)序列为：tgtcgttcactgccatcaat(seqidno:9)；

用于stw-139-15抗体重链可变区逆转录pcr引物(stw-139-15-h)序列为：gcaaggcttacaaccacaatc(seqidno:10)；

于42℃温度下反应1小时，随后温度升至75℃，15分钟灭活后将获得的cdna置于-20℃，保存备用。

步骤3、stw-139-15抗体轻链可变区及重链可变区基因的pcr克隆扩增

用于简并引物(degenerateprimers)pcr法克隆扩增stw-139-15抗体轻链可变区基因的为如下一对引物：

正向引物：gacattgtgatgwcmca(seqidno:11)

反向引物：ctgaggcacctccagatgtt(seqidno:12)

其中w＝a或t，m＝a或c。

用于简并引物(degenerateprimers)pcr法克隆扩增stw-139-15抗体重链可变区基因的为如下一对引物：

正向引物：carctgcarcaryctg(seqidno:13)

其中r＝a或g，y＝c或t。

反向引物：gtgctggaggggacagtcact(seqidno:14)

pcr扩增得到的dna产物在1％agarose胶中电泳分析。电泳结束后，将分离的dna条带切下并分别进行测序获得抗体轻链及重链可变区dna的核苷酸序列。其中测得的该抗体轻链可变区dna的核苷酸序列见seqidno:15，由该dna核苷酸序列推测得到的抗体轻链可变区氨基酸序列见seqidno:16。该轻链抗原互补决定区(complementarity-determiningregions，cdr)的cdr1、cdr2及cdr3的氨基酸序列分别见seqidno.:17、seqidno:18和seqidno:19。

测得的该抗体重链可变区dna的核苷酸序列见seqidno:20，由该dna的核苷酸序列推测得到的抗体重链可变区氨基酸序列见seqidno:21。该重链抗原互补决定区的cdr1、cdr2及cdr3的氨基酸序列分别见seqidno.:22、seqidno:23和seqidno:24。

实施例10人-鼠嵌合抗体stw-139-15-c的构建

将实施例9中克隆扩增获得的鼠源stw-139-15抗体轻链可变区基因和重链可变区基因分别与人-kappa轻链恒定区(c-domain)和人igg1-重链恒定区基因片段融合，获得人-鼠嵌合轻链基因(stw-139-15-l)及人-鼠嵌合重链基因(stw-139-15-h)。将轻链嵌合基因与重链嵌合基因分别克隆至pcdna3.1表达质粒(invitrogen)，转入大肠杆菌扩增，分离获得含人-鼠嵌合抗体轻链基因及人-鼠嵌合抗体重链基因的表达质粒。

其后，将含人-鼠嵌合抗体轻链基因的表达质粒部分样品(重组质粒代号l17、l18、l19)及人-鼠嵌合抗体重链基因的表达质粒部分样品(重组质粒代号：h12、h13、h15)分别两两组合，与fugen-6脂质体(roche公司产品)混合后共转染入cho细胞。细胞转染后2-3天，取培养上清液，用包被人pv-1-fc蛋白的96-孔板，用hrp酶标记的goat-anti-human-igg(fabspecific)为二抗(购自上海西塘生物公司)，为检测二抗，在酶标仪上492nm读数，检测上清中的嵌合抗体与人pv-1蛋白结合。

该elisa代表性检测结果(492nm读数值)如下表1及图14：

表1.elisa分析瞬时转染细胞培养上清液与人pv1-fc蛋白的结合活性

(注:l17,l19为测序完全正确的轻链，h15为测序完全正确的重链；h12，h13及l18测序结果不正确)

如表1及图14结果所示：同时转染有正确表达人-鼠嵌合抗体stw-139-15重链基因质粒及正确表达轻链基因质粒的cho细胞培养上清(h15+l19)样品可与人pv-1-fc蛋白特异结合。

上述转染细胞上清经离心及0.45μm滤膜过滤后，上样至proteina亲合层析柱(proteina-sepharosefastflow，美国通用电气ge公司产品)分离纯化获得纯度在95％以上的人-鼠嵌合抗体(stw-139-15-c)蛋白。

纯化的stw-139-15-c抗体蛋白经过滤除菌后，再溶于无菌pbs液体中，制备成蛋白终溶度在10mg/ml左右的液体制剂，该制剂可在2-8℃低温下避光长期保存。

实施例11食蟹猴体内测试人-鼠嵌合抗体stw-139-15-c的生物疗效或活性

stw-139-15不识别小鼠pv-1，故无法在小鼠体内测试其生物疗效或活性。为此，在本实施例中，选用食蟹猴作为测试动物，开展了体内测试人-鼠嵌合抗体stw-139-15-c对激光致食蟹猴脉络膜新生血管抑制试验研究。该研究委托由成都华西海圻医药科技有限公司(westchina-frontierpharmatechco.，wcfp)暨国家成都新药安全性评价中心(nationalchengducenterforsafetyevaluationofdrugs，nccsed)完成。

试验目的

研究人-鼠嵌合抗体(stw-139-15c，样品代号stw007)经玻璃体注射给药对食蟹猴激光致脉络膜新生血管渗漏和生长的影响，为该药进一步的研究提供动物试验依据。

该动物试验研究分两阶段，其中第一阶段的试验模型、给药分组及试验结果描述如下：

动物试验模型及给药分组

11.1造模

11.1.1麻醉

食蟹猴经戊巴比妥钠麻醉(25mg/kg，静脉注射)，麻醉期间不定期滴加少量潇莱威以保持角膜润湿。

11.1.2散瞳

双眼滴美多丽(复方托吡卡胺滴眼液)散瞳。

11.1.3激光光凝

将食蟹猴头部固定于眼科激光光凝仪前，经全视网膜镜光凝黄斑区。光凝围绕黄斑中心凹但避免损伤中心凹，每眼照射8～9个点。激光参数：光斑直径50μm，能量0.6～0.7w，曝光时间0.05s。光凝成功的判定：可见到有气泡产生提示bruch’s膜被击破。

激光光凝后2～3周做1次荧光素血管造影术，作为造模成功与否判断依据。

猴每个眼球至少有1个4级光斑，判断造模成功。

11.2剂量设计

各组动物于激光光凝后3周给药。剂量设计如表2：

表2剂量设计表

其中阳性药物hpv19单抗为一特异识别与结合人及猴vegf抗原的人源化抗体(见中国专利文献：授权专利号：201210540692x，专利名称：拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途；及美国专利文献：授权专利号：us9580498b2)。

11.3给药

给药途径：双眼玻璃体注射；

给药途径选择理由：和临床用药途径一致；

给药频率：单次给药；

给药方法：各组食蟹猴经戊巴比妥钠麻醉(约25mg/kg，静脉注射，可根据猴麻醉状况调整适当调整麻醉剂量)后，用聚维酮碘溶液消毒待注射眼，表2所示双眼玻璃体注射给予相应浓度的stw007、阳性药及stw007+阳性药，模型对照组给予等体积的0.9％nacl注射液。必要时，于待注射眼滴1～2滴盐酸奥布卡因滴眼液进行表面麻醉后再进行注射操作。

玻璃体注射后，滴加1～2滴氧氟沙星眼膏抗感染及润湿角膜。

给药当天定义为试验第1天。

第二阶段：动物试验结果：

表3为光凝后3周，眼玻璃体注射stw-139-15c单抗(stw007)及阳性对照药物hpv19(抗-vegf单抗)对食蟹猴荧光素渗漏面积减少量及改善率的影响(数据统计至给药后第49天)；

图15a至图15d则分别为各组动物玻璃体注射给药后第7、14及21天时的眼底荧光造影图片。

表3眼玻璃体注射stw007对食蟹猴荧光素渗漏面积减少量及改善率的影响

注：给药后7天～给药后36天测定时间点，样品1+2组4m001右眼荧光素渗漏面积无数据，故样本量为1。

如表3及图15a图片所示：与治疗前相比，模型对照组(0.9％nacl注射液)给药后，眼底荧光素渗漏不但未见改善，而且有加重(观察期间荧光素渗漏面积改善率均数为-11.12％～-54.73％；第7-21天眼底荧光造影系列照片见图15a)。而stw-139-15c单抗样品(0.5mg/眼)给药后第7天起，眼底荧光素渗漏有明显善改善(观察期间荧光素渗漏面积改善率为33.27％～64.10％；第7-21天眼底荧光造影系列照片见图15b)；其荧光渗漏减少程度与同剂量(0.5mg/眼)阳性对照药物hpv19(抗vegf单抗)组的结果相近似(观察期间荧光素渗漏面积改善率范围为45.75％～71.12％，第7-21天眼底荧光造影系列照片见图15c)。

stw-139-15c单抗样品(0.25mg/眼)与阳性对照药物hpv19单抗(0.25mg/眼)合并给药后，观察期间眼底荧光素渗漏面积改善率维持在80.28％～95.20％之间(第7-21天眼底荧光造影系列照片见图15d)，在单个药物注射剂量各减半条件下，其疗效好于两倍注射剂量的阳性对照药物hpv19单抗(0.5mg/眼)。此结果表明特异结合plvap/pv-1的stw-139-15c单抗对食蟹猴体内激光诱导的脉络膜新生血管渗透具有明显的抑制作用；stw-139-15c单抗与vegf单抗药物合并使用，疗效优于各单药治疗。

序列表

<110>苏州思坦维生物技术股份有限公司

<120>特异结合人质膜膜泡关联蛋白pv-1的单克隆抗体及其制备方法与应用

<130>wh-np-18-100001

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<213>智人(homosapiens)

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<213>食蟹猴（macacafascicularis）

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