新型的重组抗凝血蛋白的制作方法

专利名称：：新型的重组抗凝血蛋白的制作方法本专利申请优先于2002年六月六日申请的专利号为60/386932的临时美国专利申请。2002年六月六日申请的专利号为60/386932的临时美国专利申请中全部内容在此以参考资料被综合。
背景技术：
：本发明整体上涉及抗凝血蛋白，重点涉及新型的重组血液凝固抑制剂。组织因子(Tissuefactor，TF)被公认为是在正常止血和各种凝血异常及血栓性疾病中的血液凝固生理启动因子。组织因子在正常情况下在某些血管外细胞表面作为一种膜整合蛋白存在，但也可在受到刺激的血管内皮和单核细胞中诱导表达[见综述(1)]。根据在全血和人工膜系统中的研究(2-5)，组织因子启动的凝血关键过程可用图1来说明。当组织因子暴露于血液时，与血液循环中的凝血因子VII/VIIa形成复合物。所形成的外源性的因子X活化酶复合物(tenasecomplex，TF/VIIa)在表面具有组织因子的细胞/微粒上通过活化少量的因子IX和X启动凝血连锁反应。由TF/VIIa激活的活化的因子IX和X在随后的凝血反应中起着重要的作用。因子X在具有组织因子的膜表面上与因子Va/V形成复合物，产生少量的凝血酶，这少量的凝血酶再部分激活血小板，裂解纤维蛋白原形成早期凝块，并激活因子V，VIII和XI。在这早期凝血反应之后，是凝血酶产生的传播。在这传播期，活化的血小板为内源性因子X活化酶(VIIIa/IXa)和凝血酶原酶(Va/Xa)的形成提供了阴离子表面膜，二者十分有效地分别激活因子X和凝血酶原，导致爆发性地凝血酶生成和纤维蛋白-血小板凝块的加固。有三种血浆抗凝系统分别在不同的反应部位调节凝血系列反应。组织因子途径抑制物(Tissuefactorpathwayinhibitor，TFPI)与因子Xa形成抑制性复合物反馈性地抑制TF/VIIa，从而影响凝血的初始期。抗凝血酶III(AntithrombinIII，AT-III)主要通过在凝血传播期抑制凝血酶和Xa来发挥其作用。而活化的蛋白质C(ActivatedproteinC，APC)则通过蛋白水解灭活Va和VIIIa。膜表面上的阴离子磷脂，主要是磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl-L-serine，PS)对于促使凝血连锁反应的发生和传播的血液凝固酶复合物(外源性和内源性因子X激活酶，凝血酶原酶和XIa)在膜上的的形成及催化活性的表达都十分重要。正常情况下，哺乳动物细胞浆膜上的磷脂是非对称分布的，PS都局限于膜内侧面(6)。正因为PS局限于膜内侧面，完整的静止细胞是无促凝活性的。在细胞活化，细胞受到损伤或凋亡性刺激等情况下，磷脂在浆膜上的非对称分布不能维持，导致PS暴露于细胞膜外表面及膜“微颗粒”的脱落。PS暴露于细胞膜外表面有利与血液凝固酶与其辅因子在膜上形成复合物，并与其底物发生作用，从而增强凝血反应(7-9)。在完整细胞膜上形成的TF/VIIa复合物通常对其底物是隐蔽，无活性的。但在细胞被破损，受到某些因子激惹或凋亡发生时，PS可暴露于膜外表面，这时可观察到TF/VIIa复合物活性数倍地升高(去隐蔽，de-cryption)(10-14)。TF掺入在仅由PC组成的微粒时激活因子X的速率只是掺入在由PS组成的微粒时的5％。这些观察提示同时相的TF表达和PS暴露对于凝血的启动十分重要。在止血和血栓形成的过程中，已知血小板可提供形成内源性因子X活化酶(VIIIa/IXa)和凝血酶原酶(Va/Xa)的阴离子膜表面(7，16)。血小板一旦活化，PS迅速出现在血小板膜表面上。因子VIIIa与膜表面磷脂相互作用产生钙依赖性，具有高亲和力的因子IXa结合点，导致内源性因子X活化酶形成。同样，因子Va与阴离子磷脂结合带动钙依赖性因子Xa的结合，形成凝血酶原酶复合物。因子XIa有效地催化因子IX转变为因子IXa也依赖于PS暴露的膜表面。TFPI是一种调节人类血管内经组织因子途径启动的凝血的多价Kunitz型抑制物(17)。TFPI除直接抑制因子Xa外，也以一种依赖因子Xa的方式，反馈性地抑制TF/VIIa复合物，从而阻遏组织因子途径蛋白酶系列反应。虽然TFPI在生理上对组织因子途径的调节非常重要，但由于其有效阻断血管内血栓形成所需的剂量很大，目前在临床抗血栓治疗的应用开发中仍受到限制(18-20)。几种其它天然存在的可结合组织因子途径中因子VIIa，IXa，Xa和XIa的Kunitz型抑制物已被报告。这包括来自水蛭的Antistasin(ATS)(21)，壁蚤抗凝肽(TickAnticoagulantPeptide，TAP)(22)，两种特异性地抑制因子Xa的钩虫抗凝肽(AncylostomacaninumAnticoagulantPeptides，AcAP5和AcAP6)(23)和另一种抑制因子VIIa的钩虫抗凝肽(AcAPc2)(23)以及抑制因子VIIa，IXa，Xa和XIa的淀粉样β蛋白前体Kunitz抑制基团(Kunitz-inhibitorydomainofamyloidβ-proteinprecursor，KAPP)。通过点突变和噬菌体呈现技术，产生出了对两类对不同的凝血蛋白酶(TF/VIIa，Xa，XIa和激肽释放酶等)具有高亲和力(Ki低于纳摩尔级)的KAPP和抑肽酶的同源物(28-31)。然而这些突变体在体外抗凝测定(组织因子启动的凝血测定和活化部分凝血酶原时间)中活性很低。抑肽酶同源物在体内血管损伤模型中达到抗血栓效果所需要的溶度也很高(31)。本发明简介本发明提供几种新型的重组抗凝蛋白，生产这些重组抗凝蛋白的方法和所需的物质材料，以及其在临床治疗中的使用方法。本专利发明首选的一类新型的重组抗凝蛋白可用将一种能和PS相结合的蛋白annexinV(ANV)(序列编号10)与作用于酶复合物中丝氨酸蛋白酶的Kunitz型蛋白酶抑制物(KPI)相连接而成。所形成的融合蛋白的抗凝活性远高于其组成蛋白。其中几种重组蛋白的活性大大高于血液中存在的组织因子途径凝血天然抑制物TFPI。这些ANV-Kunitz型抑制物(ANV:KPI)融合体代表了一类新型的抗凝物。这类新型的抗凝物特异性地作用于PS被暴露，具有前凝血活性的膜表面上的血液凝固酶复合物，因而可成为一类能掩盖引发血栓形成的血管壁及其相连血栓的抗血栓治疗剂。因此，本专利的特征是提供了由annexinV(ANV)(序列编号10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)组成的融合蛋白为代表的一类重组抗凝蛋白。本专利的另一特征是提供的另一类重组抗凝蛋白包括诸如ANV和壁蚤抗凝肽(TickAnticoagulantPeptide，TAP)(序列编号1)，或抑肽酶变体(6L15)(序列编号2)，或淀粉样β蛋白前体的Kunitz抑制基团(KAPP)(序列编号3)，及KKTFPI22-160(序列编号4)形成的重组抗凝蛋白。本专利的又一特征是提供另一类抗血栓成分。该抗血栓成分由annexinV(ANV)(序列编号10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)形成的融合蛋白形成的另一类重组抗凝蛋白组成。本专利另一特征是提供的其它抗血栓成分包括诸如TAP-ANV(序列编号1)，ANV-6L15(序列编号2)，ANV-KAPP(序列编号3)，andANV-KKTFPI22-160(序列编号4)融合蛋白。本专利的又一特征是提供了一种对哺乳类生物个体通过给予有效剂量的重组抗凝蛋白来抑制该个体血液凝固的方法。该组抗凝蛋白由annexinV(ANV)(序列编号10)和一种Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合而成。本专利的又一特征是提供了一种将annexinV(ANV)(序列编号10)和一种Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)连接起来产生重组抗凝蛋白的方法。本专利的又一特征是提供了在需要时给具有过度血栓形成表现的个体进行治疗或预防的方法，如给于该个体有效剂量的由annexinV(ANV)(序列编号10)和一种Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合物组成的抗血栓成分。本专利的又一特征是提供了一种重组DNA分子，这种DNA分子由编码annexinV(ANV)的DNA序列(序列编号9)和编码Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)的第二段DNA序列组成。本专利另一特征是提供了包括来自由TAP-ANV(序列编号5)，ANV-6L15(序列编号6)，ANV-KAPP(序列编号7)和ANV-KKTFPI(序列编号8)，或保留替代变异等其它的重组DNA分子。本专利的又一特征是提供了制备表达由annexinV(ANV)(序列编号10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合体形成的重组抗凝蛋白的细胞株的过程。此过程包括将含有编码ANV或保留替代变异体和编码KPI的cDNA序列的重组表达载体稳定地转染到宿主细胞。本专利的又一特征是提供了一种由两条核苷酸序列组成的重组表达质粒。第一段核苷序列编码annexinV(ANV)(序列编号9)，胱氨酸315-丙氨酸突变ANV(序列编号14)或保留替代变异体等的核苷酸序列。第二段核苷序列是带有一附加序列的Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)核苷酸序列。所带的附加序列能指导由ANV和KPI融合体组成的重组抗凝蛋白在稳定传染的细胞株培养体系中合成。本专利的另一特征是还提供含有诸如TAP-ANV(序列编号5)，ANV-6L15(序列编号6)，ANV-KAPP(序列编号7)和ANV-KKTFPI(序列编号8)或保留替代变异体等核苷酸序列的重组表达质粒。图示简要说明图一组织因子启动的血液凝固概图因子VII结合于TF暴露的细胞/微粒上的TF，活化为VIIa。TF/VIIa复合物激活因子IX和X。因子Xa在局部激活产生少量的凝血酶(IIa)。这少量的凝血酶再活化血小板，激活因子V，从vonWillebrand因子释放出因子VIII，并激活因子VIII和XI。TF/VIIa激活的因子IXa可结合于活化的血小板上的因子VIIIa，形成内源性因子X活化酶。所形成内源性因子X活化酶可高效地激活因子X。血小板上激活的因子Xa结合因子Va形成凝血酶原酶(Va/Xa)，所形成的凝血酶原酶再促使大量的凝血酶原转变为凝血酶。有三类血浆抗凝系统调节凝血反应TFPI直接抑制Xa，并以Xa依赖方式反馈性地抑制TF/VIIa；抗凝血酶III主要抑制Xa和凝血酶；APC水解灭活Va和VIIIa。按Roberts等(5)和MannK(3)等改编。图二AnnexinV及其与各种Kunitz型抑制物的融合产物概图。ANV，(annexinV，序列编号10)；丙氨酸-壁蚤抗凝肽(Ala-TickAnticoagulantPeptide)，一种经甘氨酸-丝氨酸二肽连接于annexinV的TAP-ANV(序列编号1)；ANV-6L15(序列编号2)，一种连接于6L15(一种与TF/VIIa有高亲和力的Kunitz型抑制物)的annexinV；ANV-KAPP(序列编号3)，一种连接于KAPP(淀粉样β蛋白前体的Kunitz型抑制基团)的annexinV；ANV-KKTFPI(序列编号4)，一种连接于KKTFPI(含Kunitz-1和Kunitz-2基团的TFPI22-161)的annexinV。图三纯化的ANV及其与各种Kunitz型蛋白酶抑制物形成的融合体的SDS-PAGE分析。样品在非还原(A)与还原(B)条件下经12％SDS-PAGE凝胶电泳后用考马斯亮蓝染色。所有样品在无(A)或有(B)50mM二巯基丙醇存在的情况下煮沸3分钟。每电泳孔加样5μg蛋白质。泳道1分子量标准蛋白；泳道2ANV-KKTFPI(序列编号4)；泳道3ANV-6L15(序列编号2)；泳道4TAP-ANV(序列编号1)；泳道5ANV-KAPP(序列编号3)；泳道6ANV(序列编号10)。图四各种纯化的抑制物对猪胰蛋白酶和牛因子Xa的抑制。对胰蛋白酶和牛因子Xa的抑制按在以下“方法”一项中所述的酯水解测定(amidolyticassay)进行。活化的胰蛋白酶和牛因子Xa溶度用4-nitrophenylp’-guanidinobenzoate对其活化点的滴定来测定(41，42)。纯化的抑制物溶度用在280nm波长处的吸光度测定。测定ANV-6L15，6L15，TAP-ANV，TAP，ANV-KAPP和ANV-KKTFPI所用的克分子吸光系数分别为28170，7120，39550，18500，31300和30170。(A)ANV-6L15对胰蛋白酶的抑制；(B)6L15对胰蛋白酶的抑制；(C)TAP-ANV对因子Xa的抑制；(D)TAP对因子Xa的抑制；(E)ANV-KAPP对胰蛋白酶的抑制；(F)ANV-KKTFPI对因子Xa的抑制。图五各种抑制物对活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响。APTT用APTT-SP试剂(InstrumentLaboratories)在ACL200凝血计上测定。人混合血浆(180μl)与分别与20μl各种抑制物混合，使各抑制物在混合血浆达中到测定所需的终溶度。含对照缓冲液的血浆凝固时间为40.7秒。TFPI(m)为来自哺乳动物细胞株C127的FL-TFPI。专利发明的详细说明为了进一步对本专利发明和优先例证细节进行说明，特将专利发明与所附图示一并详细描述如下。血液凝固连锁反应主要以形成酶复合物来进行。每种复合物包括在阴离子膜表面上与和膜结合的辅因子/受体相连的丝氨酸蛋白酶类。这些复合物通常称之为外源性因子X活化酶(因子VIIa-组织因子)，内源性因子X活化酶(因子IXa-因子VIIIa)，凝血酶原酶(因子Xa-因子Va)和因子XIa复合物。如上所述，已产生一系列新的重组抗凝融合蛋白，如通过将磷脂酰丝氨酸(PS)结合蛋白annexinV(ANV)(序列编号10)连接作用于酶复合物中丝氨酸蛋白酶的Kunitz型蛋白酶抑制物(KPI)。所产生的融合蛋白表现出比其组份单独活性甚至活性相加强得多的抗凝活性。为方便起见，这些重组融合抗凝蛋白简称为ANV:KPI。这些融合蛋白利用了ANV对磷脂酰L-丝氨酸(PS)的高亲和力(32)和各种KPI对凝血反应中膜上凝血复合物中丝氨酸蛋白酶的抑制活性。在这些新的组合蛋白中，有些具有比TF启动的凝血的天然抑制物TFPI高得多的活性。AnnexinVKunitz型蛋白酶抑制物，即ANV:KPI融合蛋白代表了一类新的抗凝剂。这类抗凝剂特异性地作用于具有前凝血活性，PS暴露的膜表面上的血液凝固酶复合物，因而可作为一种具有掩盖可致血栓形成的血管壁及相连血栓能力的抗血栓治疗剂。这类新型的融合蛋白可用于治疗与具有严重血栓形成有关的疾病和状态。这包括动脉血栓性病变，如不稳定性心绞痛，心肌梗塞，心型猝死，缺血性中风，动脉瘤破裂，间隙性跛行和严重肢体缺血；静脉血栓形成如深部静脉血栓形成，肺血栓栓塞，血栓型静脉炎及慢性静脉功能不全；其它的临床情况如手术引起的血栓形成，人工心脏瓣膜，动脉样硬化，血管再狭窄，缺血再灌流损伤，败血症，广泛性血管内凝血，急性肺损伤，恶性肿瘤，慢性肾衰竭，肾病综合症，半月状肾小球肾炎(crescenticglomerulonephritis)，糖尿病，镰状红细胞性贫血，地中海贫血，抗磷脂综合症，体外循环，血液透析，腹膜透析和annexinopathies。为了进一步阐明本专利发明，现举证以下实验室特例。但需注意本发明不限于此处描述的特例或细节。举例材料和方法试剂尿素(测序级)和Brij35来自Pierce。混合型层析柱床树脂AG501-X8，SDS-PAGE试剂，及分子量标准物购自BioRad。DadeInnovin来自BaxterDiagnosticsInc.(Deerfield，IL)。APTT-SP来自InstrumentationLaboratory(Lexington，MA)。牛因子Xa由AmericanDiagnostica，Inc.(Greenwich，CT)供应。胰蛋白酶，p-nitrophenylp’-guanidinobenzoateHCl，牛脑提取物，胆固醇和二乙酰磷酸盐购自Sigma(St.Louis，MO)。合成底物S2444和S2765来自diaPharma(WestChester，OH)。新鲜冷冻人血浆购自台北血液中心。C127哺乳动物细胞株和E.coli重组TFPIs按以前所述制备(33，34)。重组X-K1(人因子X的C端多肽与TFPI第一个Kunitz基团融合物)(35)和TFPI1-160由GeorgeBroze，Jr.博士(WashingtonUniversity)赠送。酵母重组TAP由DanaAbendschein博士(WashingtonUniversity)赠送。AannexinVcDNA克隆终止密码缺如的ANVcDNA用聚合酶链式反应(PCR)技术从人胎盘组织mRNA产生。所用的ANV反向引物(reverseprimer)为5’-ATCAAGCTTATGCATGTCATCTTCTCCACAGAG-3’(序列编号11)，正向引物(forwardprimer)为5’-GATCGGATCCAGTCTGGTCCTGCTTCACCTT-3’(序列编号12)。ATGCAT是限制性内切酶NsiI的内切点。该点用来连接6L15，KAPP，或KKTFPI22-161基因片段。Cys315-Ala突变ANVcDNA用PCR技术产生。所用寡聚核苷酸X为5’-CGTGACATGCATGTCATCTTCTCCAGCGAGCA-3’(序列编号13)。所用寡聚核苷酸X序列中的GC(用黑体表示)由CA变来，这是为了把原来的胱氨酸密码变为丙氨酸密码。重组ANV的表达没有Cys315突变。所有其它ANV:KPI融合体均含有Cys315-Ala突变ANVcDNA(序列编号14)。Cys/Ala在PCR扩增的缺少起始蛋氨酸密码的ANVcDNA中的位置编号为315。6L15，TAP和KAPP基因构建编码6L15的合成基因由三对重叠的寡聚核苷酸构建。三条正向寡聚核苷酸是BP-1(5’-TCCGGACTTCTGCCTGGAACCGCCGTACGACGGTCCGTGCCGTGCTCTGCACCTGCGTTACTTC-3’)(序列编号15)；BP-2(5’-TACAATGCAAAGGCAGGCCTGTGTCAGACCTTCTACTACGGCGGTTGCCTGGCTAAGCGT-3’)(序列编号16)；和BP-3(5’-AACAACTTCGAATCCGCGGAACACTGCATGCGTACTTGCGGTGGTGCTTA-3’)(序列编号17)。三条反向寡聚核苷酸是BP-1-3’(5’-ACGCAGGTGCAGAGCACGGCACGGACCGTCGTACGGCGGTTCCAGGCAGAAGTCCGGATGCAT-3’)(序列编号18)；BP-2-3’(5’-AGCCAGGCAACCGCCGTAGTAGAAGGTCTGACACAGGCCTGCCTTTGCATTGTAGAAGTA-3’)(序列编号19)和BP-3-3’(5’-AGCTTAAGCACCACCGCAAGTACGCATGCAGTCTTCCGCGGATTCGAAGTTGTTACGCTT-3’)(序列编号20)。中间的寡聚核苷酸用T4多核苷酸磷酸激酶磷酸化。三对互补寡聚核苷酸用加热到95°再慢慢冷却到室温分别配对杂交(anneale)。配对杂交后的寡聚核苷酸用T4DNA连接酶连接组成6L15基因。寡聚核苷酸序列BP-1-3’中的内切酶NsiI内切点ATGCAT由原来的精氨酸密码设计改变为组氨酸密码以便连接到ANV基因片段。为了6L15的表达，原来的精氨酸密码由丙氨酸密码替代。6L15的合成基因由下列序列组成GCTCCGGACTTCTGCCTGGAACCGCCGTACGACGGTCCGTGCCGTGCTCTGCACCTGCGTTACTTCTACAATGCAAAGGCAGGCCTGTGTCAGACCTTCTACTACGGCGGTTGCCTGGCTAAGCGTAACAACTTCGAATCCGCGGAAGACTGCATGCGTACTTGCGGTGGTGCTTAA(序列编号21)。合成丙氨酸-TAP基因按Neeper等(36)所述用合成寡聚核苷酸合成。所合成的丙氨酸-TAP基因由如下序列组成GCTTACAACCGTCTGTGCATCAAACCGCGTGACTGGATCGATGAATGCGACTCCAACGAAGGTGGTGAACGTGCTTACTTCCGTAACGGTAAAGGTGGTTGCGACTCCTTCTGGATCTGCCCGGAAGACCACACCGGTGCTGACTACTACTCCTCCTACAACGACTGCTTCAACGCTTGCATCTAA(序列编号22)；两端具有序列的KAPP合成基因由两对重叠的合成寡聚核苷酸构建。两条正向寡聚核苷酸是KAPP-1(5’-GGCCCTACCCCACAGATACGGAGTTGCCACCACTGAAACTTGAGGTTGTTAGAGAGGTTTGTTCTGAGCAAGCTGAGACTGGTCCATGTAGAGCTATGATTTCTAGATGGTACTTCGACGTT-3’)(序列编号23)和KAPP-2(5’-ACTGAGGGTAAGTGTGCTCCATTCTTCTACGGTGGTTGTGGTGGTAACAGAAACAACTTCGACACTGAGGAGTACTGTATGGCTGTTTGTGGTTCTGCTATTTAAATGCATTGATGA-3’)(序列编号24)。两条反向寡聚核苷酸是KAPP-1-3’(5’-CTCAGTAACGTCGAAGTACCATCTAGAAATCATAGCTCTACATGGACCAGTCTCAGCTTGCTCAGAACAAACCTCTCTAACAACCTCAAGTTTCAGTGGTGGCAACTCCGTATCTGTGGGGTAG-3’)(序列编号25)和KAPP-2-3’(5’-AGCTTCATCAATGCATTTAAATAGCAGAACCACAAACAGCCATACAGTACTCCTCAGTGTCGAAGTTGTTTCTGTTACCACCACAACCACCGTAGAAGAATGGAGCACACTTACC-3’)(序列编号26)。划线部分是编码KAPP基团的互补序列。两对核苷酸用T4多核苷酸磷酸激酶磷酸化，加热到95°再慢慢冷却到室温配对杂交。配对杂交后的寡聚核苷酸用T4-DNA连接酶连接。KAPP基团的合成基因由下列序列组成GAGGTTTGTTCTGAGCAAGCTGAGACTGGTCCATGTAGAGCTATGATTTCTAGATGGTACTTCGACGTTACTGAGGGTAAGTGTGCTCCATTCTTCTACGGTGGTTGTGGTGGTAACAGAAACAACTTCGACACTGAGGAGTACTGTATGGCTGTTTGTGGTTCTGCTATTTAA(序列编号27)E.coli表达质粒构建为了构建表达ANV-6L15和NV-KKTFPI的质粒，下列引物被用于PCR扩增和亚克隆于pET20b表达载体ANV-nde(5’-GGAATTCCATATGGCACAGGTTCTCAGAGG-3’)(序列编号28)，ANV-nsi(5’-CCAATGCATGTCATCTTCTCCAGC-3’))(序列编号29)，6L15-nsi(5’-CCAATGCATCCGGACTTCTGCCTG-3’))(序列编号30)，KKTFPI-nsi(5’-CCAATGCATTCATTTTGTGCATTC-3’))(序列编号31)，6L15-sal(5’-ACGCTTAAGCACCACCGCAAG-3’)(序列编号32)，andKKTFPI-sal(5’-ACGCTTAGGTTCCATAATTATCC-3’)(序列编号33)。序列中划线部分是内切酶NdeI内切点，方框部分是内切酶SalI内切点。划线部分ATGCAT是用来做基因融合的内切酶Nsi内切点。大体字ATG是蛋氨酸启动密码，大体字TTA是终止密码TAA的互补序列。KKTFPI22-161基因片段是用引物KKTFPI-nsi(序列编号31)和KKTFPI-sal(序列编号33)从全长TFPIcDNA克隆(34)经PCR放大得来。PCR放大ANV基因片段经内切酶NdeI和内切酶NsiI消化再连接到经内切酶NdeI和内切酶NsiI消化的6L15(orKKTFPI)PCR片段。所得融合基因连接入经内切酶NdeIand内切酶SalI切开的pET20b(+)表达载体。为了构建表达TAP-ANV的质粒，下列引物被用于PCR将融合基因亚克隆于pET20b表达载体TAP-nde(5’-GGAATTCCATATGGCTTACAACCGTCTGTG-3’)(序列编号34)；TAP-bam(5’-CGGGATCCGATGCAAGCGTTGAAGCAG-3’)(序列编号35)；ANV-bam(5’-CGGGATCCGCACAGGTTCTCAGAGGC-3’)(序列编号36)；ANV-sal(5’-ACGCTTAGTCATCTTCTCCAGCG-3’)(序列编号37)。PCR扩增的TAP基因片段经内切酶NdeI和内切酶BamHI消化后再连接到经内切酶NdeI和BamHI消化的ANV基因片段。所得融合基因连接入经内切酶NdeI和SalI切开的pET20b(+)表达载体。所需的重组质粒经PCR和DNA测序筛选。表达质粒命名为pET20b-AB8，pET20b-AKK11和pET20b-TAP-A。它们在E.coli细胞内由启动子T7控制分别表达重组蛋白ANV-6L15，ANV-KKTFPI和TAP-ANV。为了表达用于比较的ANV和6L15，PCR产生的ANV和6L15基因片段用同一过程分别嵌入到质粒经E.coli表达。E.coli表达重组蛋白的表达生物体采用E.coliBL21(DE3)pLysS[(F-ompThsdSB(rB-，mB-)galdcm(DE3)pLysS(Cam)R)](Novagene，Madison，WI)。E.coliDH5α[(F-(φ80dlacZΔM15)Δ(lacZYA-argF)U169endA1recA1hsdR17(rK-mK+)deoRthi-1supE44gyrA96relA1λ-)]用于表达质粒的构建。表达质粒在E.coliDH5α增殖并从其分离，再转染入冰冻保存的感受态(competent)E.coliBL21。单个克隆置入25-mlLB液体培养基(broth)(含100mg/Lampicillin和34mg/Lchloroamphenicol)培养，在37°和剧烈摇动的条件下过夜繁殖。10ml过夜繁殖培养液再接种到装在容量为2.8L烧瓶(Nalgene)中的1升同样的培养基，在37°生长直到OD600值达到0.5。该培养液加入终溶度为1mMIPTG(Promega)，在37°和剧烈摇动的条件下诱导生长4小时。coli细胞通过7000rpm离心12分钟收集。离心沉淀的细胞置入-80°冰箱备用。酵母表达质粒构建Pichia表达载体pPIC9使用可诱导高效PAOX1启动子和α因子信号肽促使目的蛋白的表达和分泌。含目的基因的DNA片段克隆到两端连有XhoI和NotI内切点的分泌信号肽框架。从XhoI内切点到编码KEX2酶内切点的目的基因启动密码之间的序列对融合蛋白的有效裂解是必须的。用于产生克隆入载体pPIC9的PCR目的片段的设计引物是ANV-xho(5’-CCGCTCGAGAAAAGAGCACAGGTTCTCAGAG-3’)(序列编号38)，KAPP-not(5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAAATAGCAGAACCAC-3’)(序列编号39)，ANV-ecov(5’-CGCGATATCATCTTCTCCAGCGAG-3’)(序列编号40)和5’-KAPP(5’-GAGGTTTGTTCTGAGCAAGC-3’)(序列编号41)。序列CTCGAG和GCGGCCGC分别是XhoIandNotI限制性内切点，分别用于编辑基因片段及连接入pPIC9载体。序列CTCGAGAAAAGA编码典型的KEX2蛋白酶裂解点Leu-Glu-Lys-Arg，因此引物后的密码被设计为分泌的目的蛋白的第一个密码(用大体字表示)。为了制造ANV-KAPP融合基因，我们设计了ANV-ecov引物。该引物可产生位于ANV基因片段3’端的EcoRV内切点而不需改变最后被编码的氨基酸(Asp)。5’-KAPP引物是KAPP基因中从起始Glu密码(GAG)开始的正向序列。由引物5’-KAPP和KAPP-not扩增的KAPP基因片段用其钝型末端与ANV基因连接而产生ANV-KAPP融合基因。ANV基因用引物ANV-xho和ANV-ecov经PCR扩增并经内切酶EcoRV裂解。所形成的融合基因经内切酶XhoI和NotI裂解，再连接到用同样的内切酶切开的pPIC9。连接反应混合物被转染入E.coliDH5α。所需的克隆经PCR筛选并经DNA序列分析证实，以鉴定框架内的氨基酸序列及α因子信号肽。所制备的质粒为pPIC9ANV-KAPP。Pichia表达酵母表达质粒经E.coliDH5α增殖并从其分离。该质粒转染前经内切酶SacI切开。含His4选择标记的α因子融合基因框架在AOX1位点经电导转染嵌入P.pastorisGS115(his4)的基因组DNA(37)。该重组菌株通过His4补偿在MD(minimaldextrosemedium，不含氨基酸的1.34％yeastnitrogenbase，4×10-5％biotin，2％dextrose，1.5％bacto-agar)培养皿进行生长选择。将在MD培养皿生长的单一P.pastorisGS115重组菌株克隆接种到在容量为10ml长Pyrex管中的2mlBMGY培养基(bufferedglycerolcomplexmedium，1％yeastextract，2％peptone，100mMpotassiumphosphate，pH6.0，不含氨基酸的1.34％yeastnitrogenbase，4×10-5％biotin，1％glycerol)，在37°和200rpm剧烈摇动的条件下过夜增殖生长，直到培养基OD600值达到2-6。取1ml培养基离心后将沉淀悬浮在容量为15ml长Pyrex管中的3mlBMMY培养基(bufferedmethanolcomplexmedium，1％yeastextract，2％peptone，100mMpotassiumphosphate，pH6.0，不含氨基酸的1.34％yeastnitrogen，4×10-5％biotin，0.5％methanol)。该培养基保持在30°和200rpm剧烈摇动的条件下24小时表达分泌蛋白。细胞经12,000rpm离心10分钟，其上清液用来测定胰蛋白酶抑制活性。10μl上清液用来做12％SDS-PAGE电泳及表达的ANV-KappWesternblot检测。在经Pichia大规模ANV-KAPP表达中，将新鲜MD培养皿生长的单一P.pastorisGS115重组菌株克隆接种到在容量为300ml烧瓶中的25mlBMGY培养基，在37°和200rpm摇动的条件下繁殖生长2天。再将这种处于对数生长期的培养细胞接种到在容量为1L烧瓶中的400ml新鲜BMGY培养基中，使其OD600值为0.1。该培养液保持在30°，直到OD600值达到2。细胞用无菌离心管通过12,000rpm离心10分钟收集，悬浮在1LBMMY培养基中，再转移到2.8L烧瓶中。该培养液保持在30°并摇动，开始表达蛋白。经24小时诱导后，细胞经离心移去，上清液置于-80°冷冻。E.coli包聚体(inclusionbodies)分离悬浮冷冻的E.coli细胞团(cellpaste)于冷Milli-Q水中，使其蛋白质溶度为75mg/ml。细胞用匀浆器在冰中打散30分钟。再用超声波将细胞机械粉碎。细胞溶碎体(Lysate)在16,000g离心20分钟，去掉上清液。收集沉淀包聚体。再将包聚体悬浮于等体积的冷Milli-Q水中，按上述再次匀浆化，超声波粉碎和离心沉淀。收集包聚体置于-80°冷冻。包聚体磺化(Sulfonation)和阴离子交换层析用于磺化，阴离子交换层析和蛋白质折叠的缓冲液含有高溶度尿素。所用尿素在与缓冲液混合前用BioRad混合型床树脂AG501-X8在室温下处理至少20分钟并经0.2μm滤膜过滤。一克包聚体(湿重)经匀浆和振动分散于40ml含50mMTris/HCl，pH8.0和7.5M尿素溶液中。在包聚体大部分溶解后，加入800mg硫酸钠，再在室温下摇动30分钟。其后再加入400mg四氰酸钠(sodiumtetracyanate)，混合液在4°下过夜振摇。此溶液再用400ml含20mMTris/HCl，pH8，和4M尿素的溶液透析。透析后的溶液用48,000g离心1小时，经0.2mm滤膜过滤后在-80°储藏。在阴离子交换层析时，40ml磺化和透析过的样品在室温下加样到HiLoadQ-Sepaharose16/10层析柱。层析柱用含0.15M氯化钠的Q缓冲液(20mMTris/HCl，pH8，6Murea，0.01％Brij35)平衡。层析柱用240ml平衡缓冲液冲洗，再用396mlQ缓冲液以每分钟3ml流速进行氯化钠梯度洗脱(0.15-0.4M氯化钠)。收集管每管收集洗脱液9ml。含所需蛋白质的高峰部分经SDS-PAGE分析后合并，用于蛋白质折叠。含二硫键蛋白质折叠以前描述的E.coliTFPI折叠的标准条件(34)也用于Kunitz抑制物和ANV:KPI融合蛋白质的折叠。简要地说，经过磺化和阴离子交换层析的蛋白质合并后用含0.3M氯化钠的Q缓冲液稀释到在280nm处光密度处为0.07。加入固体L-胱氨酸到终溶度为2mM。该溶液在室温下放置24小时后用水以1∶1稀释并加入1mML-胱氨酸。溶液在室温下再放置24到48小时。对单一基团的Kunitz蛋白质，折叠时蛋白质溶度可高一些而效果基本相同。6L15和ANV-KKTFPI的纯化将6L15折叠反应混合物(18ml)用1M的柠檬酸酸化到pH3.0，再用水以1∶1稀释，通过经pH为3.0的20mM柠檬酸酸钠缓冲液平衡的1×8cmQ-Sepharose(快流速)柱。层析柱再用同样的缓冲液进行0.1到1M氯化钠的梯度洗脱。6L15在0.5M氯化钠时以一对称峰洗脱出。ANV-KKTFPI折叠反应混合物(600ml)用水以1∶1稀释，通过经pH为8.0，含5mMTris和75mM氯化钠缓冲液平衡的1×8cmQ-Sepharose(快流速)柱。层析柱再用50ml平衡缓冲液冲洗。ANV-KKTFPI用pH为8.0，含5mMTris和0.25mM氯化钠缓冲液洗脱。TAP-ANV，ANV-6L15，ANV和ANV-KAPP的纯化TAP-ANV折叠反应混合物(160ml)通过经pH为7.4，含20mMTris缓冲液平衡的1×8cmQ-Sepharose(快流速)柱。层析柱再用50ml含0.15M氯化钠的平衡缓冲液冲洗，再用同样的缓冲液进行0.15到0.35M氯化钠的梯度洗脱。TAP-ANV在0.33M氯化钠时以一对称峰洗脱出。ANV-6L15折叠反应混合物上柱到经pH为9.5，含6.7mMTris，2M尿素，0.003％Brij35和0.1M氯化钠的缓冲液平衡的1×8cmQ-Sepharose(快流速)柱。层析柱先后用40ml平衡缓冲液和30mlpH为7.4，含20mMTris的缓冲液冲洗，再用180mlpH为7.4，含20mMTris的缓冲液进行0.1到1M氯化钠的梯度洗脱。ANV-6L15约在0.28M氯化钠时洗脱出。经Q-Sepharose纯化的TAP-ANV和ANV-6L15再按ThiagarajanandBenedict(38)所述的方法经含PS的脂质体吸附进一步纯化。多层脂质体按Kinsky(39)所述的方法制备。含50％PS，150mg胆固醇和10mg二乙酰磷酸盐的牛脑提取物溶于氯仿中，再在容量为40ml的玻璃管中用氮气吹干。加入TBS(10ml)于管中并用振摇器剧烈振摇5分钟。脂质体经10,000g离心10分钟收集。经Q-Sepharose纯化的TAP-ANV或ANV-6L15加入到脂质体中，再加入终溶度为5mM的氯化钙。混合液在室温下放置40分钟，在10,000g离心10分钟。所得沉淀按上述悬浮，离心程序用TBS-5mMC氯化钙反复洗涤4次。TAP-ANV或ANV-6L15用pH为9.5，含10mMTris和5mMEDTA的溶液从脂质体上洗脱。重组ANV用改进的已描述方法(38)通过ANV结合于脂质体直接从E.coli溶浆(lysate)分离。简要地说，将表达ANV的E.coli沉淀物悬浮在pH为7.4，含50mMTris和10mMEDTA的溶液中，在冰上经超声振荡取得细胞溶浆(lysate)。细胞溶浆储存在-80°。将分装的细胞溶浆溶化，用TBS透析，经15,000g离心30分钟澄清。澄清的细胞溶浆与含5mM氯化钙的脂质体温育40分钟，其后按上述进行洗涤，离心和EDTA洗脱。重组ANV-KAPP表达后分泌到pichia培养液中。将该培养液浓缩10倍后用pH为7.4，含10mMTris和0.15M氯化钠的缓冲液交换，再经40,000g离心1小时澄清。澄清的培养液浓缩物与含5mM氯化钙的脂质体温育，再按上述进行洗涤，离心和EDTA洗脱。所有用EDTA溶液从脂质体洗脱的蛋白质均在20,000g离心1小时以将蛋白质与大部分脂质体分离。蛋白质溶液再经CentriPlusYM-100(Amicon)过滤以清除残留微粒。蛋白质测定蛋白质溶度用其在280nm处的吸光度测定。蛋白质克分子吸光系数的理论值按GillandvonHippel(40)所述从氨基酸序列求得。所用的蛋白质克分子消光系数如下ANV(21,050)；TAP-ANV(39,550)；ANV-6L15(28,170)；ANV-KAPP(31,300)；ANV-KKTFPI(30,170)；TAP(18,500)；6L15(7,120)；C127和E.coliFL-TFPI(20,650)；C127truncatedTFPI(19,370)；TFPI1-160(7,840)；X-K1(14,490)。胰蛋白酶和因子X抑制物活性的脂水解测定抑制物-蛋白酶相互作用的立体测量(stoichiometries)牛因子Xa(AmericanDiagnostica)和猪胰蛋白酶(Sigma)分别按Smith(41)和Chase及Shaw(42)所述用p-nitrophenylp’-guandininobenzoate滴定，以测定二者的溶度。TAP，TAP-ANV和ANV-KKTFPI对因子Xa的抑制活性用S2765做酯水解测定。10μl50nM牛因子Xa溶于DB缓冲液(10mMTris，pH7.5，0.15M氯化钠，1mg/mlBSA，0.002％Tween，20-0.02％NaN3)中，与10μl稀释在同样缓冲液中的抑制物混合。在室温下温育30分钟后，取10μl反应液于96孔板中，加入85μl含5mMCaCl2的TBS缓冲液(50mMTris，pH7.5-0.15M氯化钠，0.02％NaN3)混合。室温下用SPECTRAmaxPLUS384(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)微板光度计在405nm处测定吸光度在60秒内的变化。将猪胰蛋白酶溶于含1mMHCl和20mMCaCl2的50％甘油溶液中制备储藏液置于-20°。6L15，ANV-6-L15和ANV-KAPP对胰蛋白酶的抑制活性以S2444为底物用酯水解法测定。稀释于含0.1mg/mlBSA和20mMCaCl2的TBS缓冲液的胰蛋白酶溶液(23nM)由储藏液新鲜配置。10μl胰蛋白酶溶液与10μl稀释在同样缓冲液中的抑制物在微板孔中混合。在室温下温育10分钟后，加入75μl含20mMCaCl2的TBS缓冲液和5μl的10mMS2444，室温下用微板光度计在405nm处测定吸光度在2分钟内的变化。在这两种测定中，抑制物存在时的部分活性用在没有抑制物存在时活性的百分率计算。血浆凝固时间测定人血浆凝血测定采用ACL200凝血仪(InstrumentationLaboratory，LexingtonMA)。所用血浆为4个正常供血者的混合血浆。在组织因子启动的血浆凝血测定中，每一测定样本为100μl混合血浆与同容积溶于DB缓冲液(10mMTris，pH7.4，0.15M氯化钠，1mg/mlBSA，0.02％NaN3)的不同溶度抑制物的混合。抑制物溶度按在单独血浆中，而不是血浆和抑制物的最终混合物的纳摩尔溶度计算。用于测定的Innovin(与合成磷脂组建的重组人组织因子)以1∶100稀释于PT缓冲液(75mM氯化钠，12.5mMCaCl2，0.5mg/mlBSA，0.02％NaN3)中。在活化部分凝血活酶时间(APTT)测定中，每一测定样本为180μl混合血浆与20μl溶于DB缓冲液中不同溶度抑制物的混合物。抑制物溶度按在血浆与抑制物的混合物中的终溶度计算。测定时使用未加稀释的APTT-SP试剂(InstrumentationLaboratory)。结果重组ANV和ANV:KPI融合体构建和表达所构建的质粒载体用于表达重组ANV和ANV与各种Kunitz型蛋白酶抑制物的融合体。这些Kunitz型蛋白酶抑制物对因子VIIa，IX，X和XI等四种在凝血连锁反应中起关键作用的血液凝固酶类具有特异的抑制活性。图二概括地说明了这些蛋白质的分子结构。E.coli.所表达的ANV是一种全长，未突变的分子。在其它ANV-KPI融合体中，ANV的Cys315突变为Ala以避免在蛋白质折叠时与Kunitz基团内的胱胺酸形成二硫键。TAP-ANV融合蛋白共有382个氨基酸残基。第一个是丙氨酸残基，接着是TAP中的从Tyr1到Ile60的60个氨基酸残基，一个Gly-Ser二肽和319个氨基酸残基的ANV(Cys315到Ala)。ANV-6L15融合蛋白共有378个氨基酸残基。开始是ANV(Cys315到Ala)中的从Ala到Asp的319个氨基酸残基，接着是6L15中从Met1到Ala60的60个氨基酸残基。为了产生NsiI内切点以便基因编辑和连接，融合蛋白中6L15的第二个氨基酸由Ala变为His。ANV-KAPP融合蛋白是总长为376氨基酸残基的多肽。其N端是全长ANV(Cys315到Ala)，C端是KAPP多肽中从Asp1到Ile57的57个氨基酸。ANV-KKTFPI融合蛋白是长度为459氨基酸残基的多肽。该融合蛋白的N端是全长ANV(Cys315到Ala)。ANV(Cys315到Ala)与TFPI蛋白中从Met22到Thr161的长度为140氨基酸，包括TFPI蛋白中Kunitz基团1和2的多肽融合。ANV和ANV:KPI融合蛋白质的纯化重组ANV，TAP-ANV，ANV-6L15和ANV-KKTFPI经E.coli.胞内表达。SDS-PAGE分析证明，E.coil.细胞溶浆内的ANV分子在Ca++存在的情况下基本上都能与含PS的脂质体结合。这提示所表达的蛋白可自发地折叠形成活性形式。其它经E.coli.表达的ANV:KPI融合蛋白大部分存在于包聚体，需要折叠形成活性分子。采用以前用于TFPI的磺化折叠方法(34)，我们成功地对ANV:KPI融合蛋白进行了折叠。这可由在折叠过程中其对胰蛋白酶或因子Xa抑制活性的增加证明。反应混合物中的折叠蛋白经Q-Sepharose层析一步便被高度纯化，这可由在SDS-PAGE电泳中仅见一条与预期表观分子量相符的色带证明。融合蛋白在Ca++存在的情况下与含PS的脂质体结合，再用EDTA洗脱进一步纯化。经P.pastoris表达，分泌到培养液的重组ANV-KAPP以活性形式存在。有活性的ANV-KAPP可由在Ca++存在的情况下与含PS的脂质体结合，再用EDTA洗脱来从浓缩的培养液纯化。图三显示了最后纯化蛋白质的SDS-PAGE分析。在非还原条件下(图三A)，每种制备样品都可见一主带。ANV-KKTFPI(泳道2)和ANV(泳道6)都可见微量二聚体。在还原条件下(图三B)，二聚体消失，融合蛋白带泳动稍慢。这可能是因为二硫键破裂和Kunitz基团展开。纯化抑制物与胰蛋白酶或因子Xa相互作用的化学计算图四显示了用纯化抑制物对胰蛋白酶或因子Xa的活性滴定。除ANV-KKTFPI外，其它纯化融合蛋白(ANV-6L15，TAP-ANV和ANV-KAPP)及Kunitz型抑制物(6L15和TAP)都表现出对胰蛋白酶或因子Xa化学表观上1∶1抑制。这些结果表明所有这些含有单一Kunitz基团的经纯化的融合蛋白纯度很高，并具有充分的活性。在接近抑制物与酶为等克分子溶度时，观察到某些对1∶1化学计算的偏离。这反映了分子间亲和力的不同。ANV-6L15，6L15和ANV-KAPP对胰蛋白酶的亲和力(图四A，B和E)似乎强一点，而TAP-ANV和TAP与因子Xa的结合(Fig.4C，andD)似乎弱一点。TAP-ANV和TAP与因子Xa较弱的亲和力也可从活性测定中加入底物和缓冲液后其脂解活性的时间依赖型缓慢增加看出。用ANV-KKTFPI对Xa的滴定表现出对1∶1化学计算的偏离(图四F)。这可能是由于TFPI-K2对Xa较弱的结合亲和力(Ki＝90nM)(43)。因此，在这种实验条件下不能决定相互作用的化学计算关系。另一种可能是纯化的ANV-KKTFPI含有无活性的错误折叠的分子。组织因子启动的凝血时间延长现已清楚TF是血液凝固的生理性启动因子。因此，各种抑制物的抗凝作用都用TF启动的血浆凝固测定。纯化的抑制物被加入混合血浆，达到不同的溶度。再加入稀释的凝血活酶试剂(1∶100稀释的DadeInnovin)启动血浆凝固。Innovin是一种用最佳组合的磷脂构建的重组人TFa商业试剂。该测定试剂含有TF和阴离子磷脂以启动和促进血液凝固连锁反应，是一种模拟在具有TF的活化细胞/微粒和血小板存在的情况下血浆凝固的简化系统。加有对照缓冲液的混合血浆的凝固时间是40.7秒。当加入的抑制物溶度逐渐增高时，凝血时间也逐渐延长。延长凝血时间1.5倍(即从40.7到61.1秒)时抑制物的溶度可从溶度-凝血时间曲线求出。表一列出了各种抑制物延长凝血时间1.5倍所需要的溶度及相对的活性等级。由于TFPI是血液中组织因子启动的血液凝固最重要的生理性调节因子，而来源于哺乳动物细胞的TFPI与前者极相似，我们选择了重组C127FL-TFPI作为用于比较的参考标准。TAP-ANV被推测应作用于凝血酶原酶，其活性较C127FL-TFPI高86倍。设计来抑制TF/VIIa的ANV-6L15的活性较C127FL-TFPI高12倍。ANV-KAPP(应作用于TF/VIIa，XIa，VIIIa/IXa和Va/Xa)，ANV-KKTFPI(应作用于TF/VIIa和Va/Xa)，来源于E.coli的非糖化TFPI(应作用于TF/VIIa/Xa)和X-K1TFPIhybrid(应作用于TF/VIIa)等的活性较C127FL-TFPI高6-7倍。单一ANV的活性是C127FL-TFPI的2.4倍。TAP活性与C127FL-TFPI相同。用以代表单一Kunitz抑制物的TFPI1-160和6L15的活性分别比C127FL-TFPI低40和59倍。各种抑制物对APTT的影响各种抑制物的抗凝作用也用活化部分凝血活酶时间(APTT)检查。APTT用于测量内源性凝血途径活性。图五显示各种抑制物延长APTT的作用。为便于比较，用ANV作为参考标准。TAP-ANV是作用最强的分子，活性高于ANV一个数量级。其作用可能是通过抑制凝血酶原酶发挥。ANV-KAPP(应作用于XIa，VIIIa/IXa，andVa/Xa)，ANV-KKTFPI(应作用于Va/Xa)和X-K1TFPI融合体(应作用于TF/VIIa)活性较C127FL-TFPI高6-7倍。来源于E.coli的非糖化TFPI和ANV活性较C127FL-TFPI高2-3倍。TAP活性与C127FL-TFPI相同。代表单一Kunitz抑制物的C127CT-TFPI，TFPI1-160和6L15的活性较C127FL-TFPI分别低19，40和59倍。表一各种抑制物对组织因子启动的人血浆凝固时间的影响抑制物a[抑制物]1.5×CT，(nM)b相对活性TAP-ANV0.8086ANV-6L156.012ANV-KAPP9.47.3X-K1TFPI106.9ANV-KKTFPI-160116.3E.coliala-TFPI193.6ANV292.4TAP681C127FL-TFPIc691C127CT-TFPIc13000.053E.coliTFPI1-16027500.0256L1559000.012a[抑制物]1.5CT是凝血时间延长到对照的1.5倍(从40.7到61.1秒)时抑制物的溶度。该溶度可从溶度-凝血时间曲线求出。b相对活性以哺乳动物C127FL-TFPI作为参考标准，根据抑制物]1.5CT求出(以C127FL-TFPI活性为1)。cC127FL-TFPI为全长分子；CT-TFPI为前述的在C端截断的分子(33)。虽然本专利发明者并不束缚于理论，但以上结果认为可以按以下解释分析外源性因子X活化酶(TF/VIIa)，内源性因子X活化酶(VIIIa/IXa)，凝血酶原酶(Va/Xa)和XIa酶复合物在阴离子膜表面的形成是组织因子途径血液凝固的启动和发展的关键步骤。TFPI是血液凝固启动的主要生理调节物。TFPI本身并不直接抑制TF/VIIa复合物，而是在形成无活性的TFPI/Xa/TF/VIIa四聚体前必须首先有因子Xa的生成(17)。因子Xa的生成导致凝血酶原酶(Va/Xa)的形成，而凝血酶原酶一旦形成，就受保护免于被生理溶度的TFPI失活(44，45)。在此过程中，不被TFPI抑制的一定量内源性因子X活化酶(VIIIa/IXa)也被产生。因此TFPI是以一种“有遗漏(leaky)”的方式来调节组织因子途径血液凝固。在用1∶100稀释的商业组织凝血活酶试剂的体外凝血测定中，延长凝血时间1.5倍所需要的来源于哺乳动物细胞的全长TFPI溶度是69nM(表一)。而在体内血栓模型中，仅当循环血液中或局部的TFPI溶度很高时(100-200nM)才能看到作用(18，19，46)。TFPI这种治疗剂量约是正常血浆中TFPI溶度的100-200倍。TFPI这样明显的低效能和达到所需血液水平必须的大剂量输入使TFPI在临床应用中并不理想。因此，目前急需一种能更有效调节组织因子途径血液凝固的生物分子。本专利提供的ANV:KPI融合蛋白质作为一种治疗抗凝剂具有比TFPI强得多的抑制组织因子启动的血液凝固活性及其它优点。血液凝固链式反应发生于PS暴露的膜表面上。PS暴露的膜表面有利于血液凝固复合物的组成，提高催化效能。在本研究中，一种假设是被赋予作用于PS暴露膜表面能力的酶抑制物具有抗血栓部位特异性，且抗血液凝固复合物的具有更强的活性。为了检验此假设，用重组DNA技术制备了四种融合蛋白。这四种融合蛋白都具有ANV基团，而ANV基团连接于不同的KPI基团(TAP，6L15，KAPP和KKTFPI)。融合蛋白中的ANV部分对PS暴露的膜表面具有高度亲和力(Kd＜0.1nM)(32)。而所选择的四种KPI基团对不同的凝血丝氨酸蛋白酶有如下抑制常数TAP(对Xa0.18nM)(22)；6L15(对TF/VIIa0.2nM，对血浆激肽释放酶0.02nM，对XIa13nM)(30，31)；KAPP(对TF219/VIIa68nM，对Xa13nM，对IXa190nM，对XIa0.01nM)(24-27)；K1K2TFPI(对Xa90nM，对TF/VIIa240nM)(43)。基于所用KPI基团的特异性，推测这些融合蛋白按下述优先抑制不同的膜表面血液凝固酶复合物TAP-ANV抑制Va/Xa；6L15-ANV抑制TF/VIIa，kallikrein和XIa；KAPP抑制XIa，Va/Xa，TF/VIIa和VIIIa/IXa；ANV-KKTFPI抑制Va/Xa和TF/VIIa。在体外凝血测定中，所有KPI在血浆中均需相当高的溶度才能延长凝血时间(30，47，表一和Figure五)。相反，所有四种ANV:KPI融合蛋白都能在较ANV和KPI低得多的溶度下延长血浆凝血时间(表一和图五)。在TF启动的血浆凝固和APTT测定中，活性最强的融合蛋白都是TAP-ANV。由于该分子对因子Xa有高度的特异性，故可以抑制凝血酶原酶。这样所得的结果与因子Xa和凝血酶原酶是凝血连锁反应中的限速步骤的发现是一致的(3)。值得注意的是尽管6L15具有对TF/VIIa的高亲和力(Ki0.2nM)(30)，6L15对TF启动的血浆凝固抑制活性很低(表一)。可见单独对TF/VIIa的高亲和力并不能导致对TF启动的血液凝固连锁反应的高抑制活性。相反，ANV-6L15融合抑制蛋白在抑制TF启动的血液凝固上活性较6L15高三个数量级。这表明对PS的结合大大加强了6L15对TF/VIIa的抑制。本专利提供的四种ANV:KPI融合分子在TF启动的血浆凝固和APTT测定中都表现出较ANV，KPIs，和TFPI高得多的抗凝活性。因此，这些分子较那些自然抗凝蛋白有更优越的抗凝功能。动物体内实验表明，ANV能特异性地集聚在含血小板的血栓(48)。此外，ANV优先积聚在血管损伤部位，并以剂量依赖方式抑制动，静脉血栓模型中的血栓形成(38，49，50)。本专利提供的ANV:KPI融合蛋白的一个重要特征是含ANV部分。该ANV部分赋于ANV:KPI融合蛋白特异性地，高亲和力地结合PS的性质。由于给血液凝固酶复合物的形成提供环境的PS在血栓形成部位暴露，因此这些分子具有特异性地集中于血栓形成部位的固有特点。由于ANV:KPI融合蛋白作用于血栓产生部位的能力，这些蛋白质在系统循环中水平不高的情况下也可产生抗血栓作用，从而降低了产生系统性出血的付作用的危险。在本专利中，术语“药学上可接受”(pharmaceuticallyacceptable)指常用于为治疗疾病和病态组成药物组方的载体，赋型剂或其它添加剂的一种特性。在本专利中，术语“个体”(subject)是指具有或怀疑有血栓形成倾向的人或动物。在本专利中，术语“有效”(effective)和“治疗上有效”(therapeuticallyeffective)是指一定量的治疗化合物或组分，当给予一个体时，能达到预防，抑制，减轻或排除存在于该个体的疾病和病态的一个或数个目的的特性。在本专利申请中，根据所提供的方法和材料所能治疗的疾病和病态包括与过度血栓形成有关的任何疾病和病态。这些疾病和病态包括，作为例子如不稳定性心绞痛，心肌梗塞，心脏猝死，缺血性脑中风，动脉瘤破裂，间隙性跛行和严重肢体缺血；深部静脉血栓形成，肺血栓栓塞，血栓型静脉炎，慢性静脉功能不全；与手术有关的静脉血栓形成，人工心脏瓣膜，动脉样硬化，血管再狭窄，缺血再灌流损伤，败血症，广泛性血管内凝血，急性肺损伤，恶性肿瘤，慢性肾衰竭，肾病综合症，半月状肾小球肾炎(crescenticglomerulonephritis)，糖尿病，镰状红细胞性贫血，地中海贫血，抗磷脂综合症，体外循环，血液透析，腹膜透析和annexinopathies。在本专利中，术语“剂量”(dosing)和“治疗”(treatment)是指对一为了改善其状况而需要医疗帮助的个体，特别是人类个体，所进行的直接或间接的任何过程，活动，应用，治疗或其它相似的事务。在本专利中，术语“治疗性化合物”(therapeuticcompound)是指在预防或治疗与血栓形成有关的疾病或状态中有用的化合物。如已在本专利中阐述的那样，一系列重组蛋白质可在E.col和酵母菌中产生。在E.coli系统，这些蛋白质能高水平地表达于包聚体，而且活性分子能通过简单的折叠和纯化过程来获得。在酵母菌系统，这些蛋白质以活性形式能被分泌到培养液里，并可通过同样简单的过程来纯化。从实际生产的观点来看，简便和低成本具有巨大的优越性。但是，根据那些熟知的一般分子生物学过程，如Sambrook等在分子克隆-实验室手册(第二版，ColdSpringHarborLaboratory，1989)中所描述的，使用其它原核和真核细胞株来表达重组蛋白质也受到关注。根据本工作所得到的结果，相信应可以产生其它用类似的概念设计的融合分子。比如由多个ANV和KPI基团组成的融合蛋白；由ANV和Antistasin，ecotin(51)，Acylostomacaninum抗凝肽等其他凝血因子天然抑制物组成的融合蛋白；由ANV和KPI的同源体和变异体组成的融合蛋白及由ANV和因子VIIa，IXa，Xa和XIa的小分子抑制物组成的融合体。在另一类融合蛋白变异体中，其它的PS结合蛋白，如annexin家族中的其它成员，lacadherin(52)及因子V，因子VIII和磷酯酶A2分子的磷脂酶结合部分均可用来代替ANV产生融合分子。更多的例子包括用disintegrin基团与ANV或ANV-KPIs连接来创造在血栓形成部位既能抑制凝血反应，又能抑制血小板集聚的融合分子。对于那些有这方面技巧的人来说，在阅读了本专利公开的内容之后，所有以上列举的例子都是显而易见的，因此所有以上列举的例子也都包括在本发明专利范围之内。综合来说，本专利开新开发的融合蛋白代表了一类具有血栓部位特异性的新型抗凝剂。这类抗凝剂具有以下特点(a)这类抗凝剂被设计来特异性地作用于与PS暴露的致血栓膜相连的TF/VIIa，内源性因子X活化酶(VIIIa/IXa)，凝血酶原酶(Va/Xa)和XIa；(b)在TF启动的血液凝固中，这类抗凝剂比天然血液凝固起始反应抑制物TFPI的抗凝活性高6-86倍；(c)由于具有充分活性的分子能通过微生物系统生产，通过简单的钙依赖性结合于含PS的脂质体再用钙螯合溶液(Ca++-chelatingsolution)洗脱来纯化，这类抗凝剂生产简便，成倍低廉；(d)由于PS暴露的生物膜和与之相连的血液凝固复合物是导致血栓形成和血管损伤的关键因素，ANV:KPIs可以作为一类能掩盖致血栓血管壁和相连的血栓的有效的抗血栓药物。参考文献1.MorrisseyJH.TissuefactorAnenzymecofactorandatruereceptor.ThrombHaemost2001；8666-74.2.RandMD，LockJB，van’tVeerC，GaffneyDP，MannKG.Bloodclottinginminimallyalteredwholeblood.Blood1996；883432-45.3.MannKG.Biochemistryandphysiologyofbloodcoagulation.ThrombHaemost1999；82165-74.4.HoffmanM，MonroeDM，OliverJA，RobertsHR.FactorsIXaandXaplaydistinctrolesintissuefactor-dependentinitiationofcoagulation.Blood1995；861794-801.5.MonroeDM，HoffmanM，AllenGA，RobertsHR.ThefactorVII-plateletinterplayeffectivenessofrecombinantfactorVIIainthetreatmentofbleedinginseverethrombocytopathia.SemThrombHaemost2000；26373-7.6.SimsPJ，WiedmerT.Unravelingthemysteriesofphospholipidscrambling.ThrombHaemost2001；86266-75.7.ZwaalRFA，ComfuriusP，BeversEM.Lipid-proteininteractionsinbloodcoagulation.BiochimBiophysActa1998；1376433-53.8.ZwaalRFA，SchroitAJ.Pathophysiologicalimplicat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10AlaGlnValLeuArgGlyThrValThrAspPheProGlyPheAspGlu151015ArgAlaAspAlaGluThrLeuArgLysAlaMetLysGlyLeuGlyThr202530AspGluGluSerIleLeuThrLeuLeuThrSerArgSerAsnAlaGln354045ArgGlnGluIleSerAlaAlaPheLysThrLeuPheGlyArgAspLeu505560LeuAspAspLeuLysSerGluLeuThrGlyLysPheGluLysLeuIle65707580ValAlaLeuMetLysProSerArgLeuTyrAspAlaTyrGluLeuLys859095HisAlaLeuLysGlyAlaGlyThrAsnGluLysValLeuThrGluIle100105110IleAlaSerArgThrProGluGluLeuArgAlaIleLysGlnValTyr115120125GluGluGluTyrGlySerSerLeuGluAspAspValValGlyAspThr130135140SerGlyTyrTyrGlnArgMetLeuValValLeuLeuGlnAlaAsnArg145150155160AspProAspAlaGlyIleAspGluAlaGlnValGluGlnAspAlaGln165170175AlaLeuPheGlnAlaGlyGluLeuLysTrpGlyThrAspGluGluLys180185190PheIleThrIlePheGlyThrArgSerValSerHisLeuArgLysVal195200205PheAspLysTyrMetThrIleSerGlyPheGlnIleGluGluThrIle210215220AspArgGluThrSerGlyAsnLeuGluGlnLeuLeuLeuAlaValVal225230235240LysSerIleArgSerIleProAlaTyrLeuAlaGluThrLeuTyrTyr245250255AlaMetLysGlyAlaGlyThrAspAspHisThrLeuIleArgValMet260265270ValSerArgSerGluIleAspLeuPheAsnIleArgLysGluPheArg275280285LysAsnPheAlaThrSerLeuTyrSerMetIleLysGlyAspThrSer290295300GlyAspTyrLysLysAlaLeuLeuLeuLeuCysGlyGluAspAsp305310315<210>11<211>33<212>DNA<213>人工的<220><223>ANV反向引物<400>11atcaagcttatgcatgtcatcttctccacagag33<210>12<211>31<212>DNA<213>人工的<220><223>ANV正向引物<400>12gatcggatccagtctggtcctgcttcacctt31<210>13<211>32<212>DNA<213>人工的<220><223>用于生成ANVcDNA突变体(315位的Cys变成Ala)的寡核苷酸<400>13cgtgacatgcatgtcatcttctccagcgagca32<210>14<211>960<212>DNA<213>人工的<220><223>编码人类ANV(在315位带有Cys到Ala的突变)的序列<400>14gcacaggttctcagaggcactgtgactgacttccctggatttgatgagcgggctgatgca60gaaactcttcggaaggctatgaaaggcttgggcacagatgaggagagcatcctgactctg120ttgacatcccgaagtaatgctcagcgccaggaaatctctgcagcttttaagactctgttt180ggcagggatcttctggatgacctgaaatcagaactaactggaaaatttgaaaaattaatt240gtggctctgatgaaaccctctcggctttatgatgcttatgaactgaaacatgccttgaag300ggagctggaacaaatgaaaaagtactgacagaaattattgcttcaaggacacctgaagaa360ctgagagccatcaaacaagtttatgaagaagaatatggctcaagcctggaagatgacgtg420gtgggggacacttcagggtactaccagcggatgttggtggttctccttcaggctaacaga480gaccctgatgctggaattgatgaagctcaagttgaacaagatgctcaggctttatttcag540gctggagaacttaaatgggggacagatgaagaaaagtttatcaccatctttggaacacga600agtgtgtctcatttgagaaaggtgtttgacaagtacatgactatatcaggatttcaaatt660gaggaaaccattgaccgcgagacttctggcaatttagagcaactactccttgctgttgtg720aaatctattcgaagtatacctgcctaccttgcagagaccctctattatgctatgaaggga780gctgggacagatgatcataccctcatcagagtcatggtttccaggagtgagattgatctg840tttaacatcaggaaggagtttaggaagaattttgccacctctctttattccatgattaag900ggagatacatctggggactataagaaagctcttctgctgctcgctggagaagatgactaa960<210>15<211>64<212>DNA<213>人工的<220><223>合成寡核苷酸，即用于生成重组6L15基因的三个正向引物中的第一个<400>15tccggacttctgcctggaaccgccgtacgacggtccgtgccgtgctctgcacctgcgtta60cttc64<210>16<211>60<212>DNA<213>人工的<220><223>合成寡核苷酸，即用于生成重组6L15的三个正向引物中的第二个<400>16tacaatgcaaaggcaggcctgtgtcagaccttctactacggcggttgcctggctaagcgt60<210>17<211>50<212>DNA<213>人工的<220><223>合成寡核苷酸，即用于生成重组6L15基因的三个正向引物中的第三个<400>17aacaacttcgaatccgcggaacactgcatgcgtacttgcggtggtgctta50<210>18<211>63<212>DNA<213>人工的<220><223>合成寡核苷酸，即用于生成重组6L15基因的三个反向引物中的第一个<400>18acgcaggtgcagagcacggcacggaccgtcgtacggcggttccaggcagaagtccggatg60cat63<210>19<211>60<212>DNA<213>人工的<220><223>合成寡核苷酸，即用于生成重组6L15基因的三个反向引物中的第二个<400>19agccaggcaaccgccgtagtagaaggtctgacacaggcctgcctttgcattgtagaagta60<210>20<211>60<212>DNA<213>人工的<220><223>合成寡核苷酸，即用于生成重组6L15基因的三个反向引物中的第三个<400>20agcttaagcaccaccgcaagtacgcatgcagtcttccgcggattcgaagttgttacgctt60<210>21<211>177<212>DNA<213>人工的<220><223>合成的6L15基因<400>21gctccggacttctgcctggaaccgccgtacgacggtccgtgccgtgctctgcacctgcgt60tacttctacaatgcaaaggcaggcctgtgtcagaccttctactacggcggttgcctggct120aagcgtaacaacttcgaatccgcggaagactgcatgcgtacttgcggtggtgcttaa177<210>22<211>186<212>DNA<213>人工的<220><223>合成的，来自Ornithidorosmoubata基因<400>22gcttacaaccgtctgtgcatcaaaccgcgtgactggatcgacgaatgcgactccaacgaa60ggtggtgaacgtgcttacttccgtaacggtaaaggtggttgcgactccttctggatctgc120ccggaagaccacaccggtgctgactactactcctcctaccgtgactgcttcaacgcttgc180atctaa186<210>23<211>122<212>DNA<213>人工的<220><223>用于生成带侧翼序列的合成K-APP基因的正向合成寡核苷酸<400>23ggccctaccccacagatacggagttgccaccactgaaacttgaggttgttagagaggttt60gttctgagcaagctgagactggtccatgtagagctatgatttctagatggtacttcgacg120tt122<210>24<211>117<212>DNA<213>人工的<220><223>用于生成带侧翼序列的合成K-APP基因的正向合成寡核苷酸<400>24actgagggtaagtgtgctccattcttctacggtggttgtggtggtaacagaaacaacttc60gacactgaggagtactgtatggctgtttgtggttctgctatttaaatgcattgatga117<210>25<211>124<212>DNA<213>人工的<220><223>用于生成带侧翼序列的合成K-APP基因的反向合成寡核苷酸<400>25ctcagtaacgtcgaagtaccatctagaaatcatagctctacatggaccagtctcagcttg60ctcagaacaaacctctctaacaacctcaagtttcagtggtggcaactccgtatctgtggg120gtag124<210>26<211>115<212>DNA<213>人工的<220><223>用于生成带侧翼序列的合成K-APP基因的反向合成寡核苷酸<400>26agcttcatcaatgcatttaaatagcagaaccacaaacagccatacagtactcctcagtgt60cgaagttgtttctgttaccaccacaaccaccgtagaagaatggagcacacttacc115<210>27<211>174<212>DNA<213>人工的<220><223>源自人类序列的合成K-APP基因<400>27gaggtttgttctgagcaagctgagactggtccatgtagagctatgatttctagatggtac60ttcgacgttactgagggtaagtgtgctccattcttctacggtggttgtggtggtaacaga120aacaacttcgacactgaggagtactgtatggctgtttgtggttctgctatttaa174<210>28<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>28ggaattccatatggcacaggttctcagagg30<210>29<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>29ccaatgcatgtcatcttctccagc24<210>30<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>30ccaatgcatccggacttctgcctg24<210>31<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>31ccaatgcattcattttgtgcattc24<210>32<211>27<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>32acgcgtcgacttaagcaccaccgcaag27<210>33<211>29<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>33acgcgtcgacttaggttccataattatcc29<210>34<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>34ggaattccatatggcttacaaccgtctgtg30<210>35<211>27<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>35cgggatccgatgcaagcgttgaagcag27<210>36<211>26<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>36cgggatccgcacaggttctcagaggc26<210>37<211>29<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>37acgcgtcgacttagtcatcttctccagcg29<210>38<211>31<212>DNA<213>人工的<220><223>为了生成目的PCR片段以克隆进载体pPIC9而设计的引物<400>38ccgctcgagaaaagagcacaggttctcagag31<210>39<211>33<212>DNA<213>人工的<220><223>为了生成目的PCR片段以克隆进酵母表达载体pPIC9而设计的引物<400>39ataagaatgcggccgcttaaatagcagaaccac33<210>40<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>为了生成目的PCR片段以克隆进酵母表达载体pPIC9而设计的引物<400>40cgcgatatcatcttctccagcgag24<210>41<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>为了生成目的PCR片段以克隆进酵母表达载体pPIC9而设计的引物<400>41gaggtttgttctgagcaagc20权利要求1.由annexinV(ANV)(序列编号10)和Kunitz蛋白酶抑制物(Kunitzproteaseinhibitor，KPI)融合体组成的重组抗凝蛋白质。2.专利要求1中的重组抗凝蛋白质的蛋白质序列包括TAP-ANV(序列编号1)，ANV-6L15(序列编号2)，ANV-KAPP(序列编号3)，和ANV-KKTFPI(序列编号4)或有关的保守替代变异等。3.一种由annexinV(ANV)(序列编号10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合体形成的重组抗凝蛋白质组成抗血栓成分。4.专利要求3中的抗血栓成分与药学上可接受的赋型剂组成的抗血栓成分。5.专利要求3中的抗血栓成分包括来自TAP-ANV(序列编号1)，ANV-6L15(序列编号2)，ANV-KAPP(序列编号3)和ANV-KKTFPI(序列编号4)或有关的保守替代变异等蛋白质序列。6.一种抑制哺乳动物个体血液凝固的方法。该方法包括对有关个体给予有效剂量的由annexinV(ANV)(序列编号10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合体形成的重组抗凝蛋白质。7.一种生产由annexinV(ANV)(序列编号10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合体形成的重组抗凝蛋白质的方法。8.一种产生专利要求7中所需要的重组DNA分子的方法。该重组DNA分子的第一段序列(序列编号9)编码annexinV(ANV)，第二段序列编码Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)。9.专利要求8中的重组DNA分子的序列选自TAP-ANV(序列编号5)，ANV-6L15(序列编号6)，ANV-KAPP(序列编号7)和ANV-KKTFPI(序列编号8)或有关的保守替代变异。10.一种对过度血栓表现需进行治疗或预防的个体进行此类治疗或预防的方法。该方法包括对有关个体给予有效剂量的由annexinV(ANV)(序列编号10)和Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)融合体形成的抗血栓成分。11.一种重组DNA分子。该重组DNA分子的第一段序列(序列编号9)编码annexinV(ANV)，第二段序列编码Kunitz型蛋白酶抑制物(KPI)。12.专利要求11中所述的重组DNA分子的第一段DNA序列包括序列编号9(编码ANV)，序列编号14(编码ANV的Cys315-Ala突变体)或有关的保守替代变异。13.专利要求11中所述的重组DNA分子包括TAP-ANV(序列编号5)，ANV-6L15(序列编号6)，ANV-KAPP(序列编号7)和ANV-KKTFPI(序列编号8)或有关的保守替代变异等DNA序列。14.用于专利要求11中的含有重组DNA分子的宿主细胞。15.用于专利要求1中的被稳定转染的，表达重组抗凝蛋白的细胞株。16.用于专利要求15中的原核细胞株。17.用于专利要求15中的真核细胞株。18.制备表达重组抗凝蛋白细胞株的过程。该细胞株表达的重组抗凝蛋白为annexinV(ANV)(序列编号10)和一种Kunitz型蛋白酶抑制物(KPI)的融合体。制备细胞株的过程包括用含编码ANV或有关保守替代变异和KPI的DNA序列的重组表达载体稳定地转染宿主细胞。19.一种重组表达质粒。该表达质粒的第一段核苷酸序列编码annexinV(ANV)(序列编号9)，Cys315-Ala突变ANV(序列编号14)，或有关的保守替代变异。第二段序列编码Kunitz蛋白酶抑制物(KPI)。20.专利要求19中的存在于稳定转染原核细胞培养系统中的重组表达质粒。21.专利要求19中的存在于稳定转染真核细胞培养系统中的重组表达质粒。22.专利要求19中重组表达质粒由序列编号9(编码ANV)，序列编号14(编码Cys315-Ala突变ANV)或有关的保守替代变异组成的第一段核苷酸序列。23.专利要求19中重组表达质粒核苷酸序列包括TAP-ANV(序列编号5)，ANV-6L15(序列编号6)，ANV-KAPP(序列编号7)和ANV-KKTFPI(序列编号8)或有关的保守替代变异序列。全文摘要本发明阐述了一类新型的重组抗凝蛋白质，以及它们的应用和生产。对由annexinV(ANV)和蛋白酶抑制物(KPI)形成的具有高度抗凝活性的重组融合蛋白进行了特别的描述。该重组融合蛋白，简称ANV:KPI，采用对L－磷脂酰丝氨酸有着高亲和力的ANV与各种Kunitz蛋白酶抑制物的结合，特异性地抑制凝血连锁反应中与生物膜相连的血液凝固复合物中的丝氨酸蛋白酶。ANV:KPIs作为可对具有致血栓形成活性的血管壁及相连的血栓进行局部掩盖抑制的药物有着良好的前景。文档编号C12N1/21GK1659180SQ03812999公开日2005年8月24日申请日期2003年6月4日优先权日2002年6月6日发明者温子坚申请人:温子坚