一种番茄斑驳花叶病毒实时荧光定量PCR检测方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种番茄斑驳花叶病毒实时荧光定量pcr检测方法。

背景技术

番茄斑驳花叶病毒(tomatomottlemosaicvirus，简称tommv)是烟草花叶病毒属(tobamovirus)的新成员之一，是2013年在墨西哥的番茄上首次发现的新病毒，茄子和辣椒也是tommv的自然寄主，该病毒传入和扩散风险较高。

目前检测tommv的方法常以常规pcr技术为主，而该方法操作费时，制胶过程中含有致癌物质eb，易危害科研人员健康和污染实验室环境，同时样品之间易形成交叉污染，导致检测结果的假阳性。此外，常规pcr检测技术可对病毒进行定性检测，无法实现定量检测。

目前，尚未有专门检测tommv的专利及文献相关报道，这对tommv来说，是一个重大损失，这将对茄科作物感染tommv的诊断及防控带来负面影响。而茄子上tommv的发生一般伴随着其他病毒(比如tocv、tomv、pvy、cmv、tswv等)混合感染，而且tommv侵染发生的某种症状与其他病毒病极为相似，因此，难以通过肉眼从症状上进行区分；同时，在实验室条件下，利用显微镜技术对病毒粒子进行形态观察并不能做到有效精准判断。因此，建立一种快速、准确的检测tommv的荧光定量pcr体系非常必要。相对于常规pcr而言，应用实时荧光定量pcr检测方法检测植物病毒的主要优点是实时性强，灵敏度高，特异性强，反应过程封闭，操作简单等。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种番茄斑驳花叶病毒的荧光定量pcr检测方法。

第一方面，本发明要求保护一种用于检测番茄斑驳花叶病毒的引物对。

本发明所提供的用于检测番茄斑驳花叶病毒的引物对，可为如下任一：

(a1)由seqidno.1所示的单链dna和seqidno.2所示的单链dna组成的引物对；

(a2)由将seqidno.1和seqidno.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链dna分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对。

其中，所述引物对中的两条单链dna既可以分别单独包装，也可以等摩尔混合包装。

第二方面，本发明要求保护一种用于检测番茄斑驳花叶病毒的试剂。

本发明所提供的用于检测番茄斑驳花叶病毒的试剂，可包括前文所述的引物对、sybrgreeni实时荧光定量pcr扩增缓冲液和水。

进一步地，所述sybrgreeni实时荧光定量pcr扩增缓冲液，可包括dntps、mg²⁺、sybrgreeni、dna聚合酶。

更进一步地，所述试剂中还可含有参比染料。

在本发明的具体实施例方式中，所述参比染料具体为rox参比染料(roxreferencedye)。

第三方面，本发明要求保护一种用于检测番茄斑驳花叶病毒的试剂盒。

本发明所提供的用于检测番茄斑驳花叶病毒的试剂盒，可含有下述(b1)和(b2)：

(b1)番茄斑驳花叶病毒阳性质粒；

(b2)前文所述引物对或前文所述的试剂。

进一步地，所述番茄斑驳花叶病毒阳性质粒可为含有seqidno.3所示dna片段的质粒。

在本发明的具体实施例方式中，所述番茄斑驳花叶病毒阳性质粒具体为将seqidno.3所示dna片段与pgm-t载体相连后得到的重组质粒。

第四方面，本发明要求保护一种检测待测样本中是否含有番茄斑驳花叶病毒的方法。

本发明所提供的检测待测样本中是否含有番茄斑驳花叶病毒的方法，可为如下(a1)或(a2)：

(a1)可包括如下步骤：从待测样本中提取总rna并反转录得到cdna，以所得cdna作为模板，以前文所述的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；然后按照如下确定所述待测样本中是否含有番茄斑驳花叶病毒：如果所述扩增产物中含有169bp的dna片段，则所述待测样本中含有或候选含有番茄斑驳花叶病毒；如果所述扩增产物中不含有169bp的dna片段，则所述待测样本中不含有或候选不含有番茄斑驳花叶病毒。

进一步地，所述169bp的dna片段为seqidno.3所示dna片段。

(a2)可包括如下步骤：从待测样本中提取总rna并反转录得到cdna，以所得cdna作为模板，以前文所述的引物对进行荧光定量pcr扩增；然后根据扩增曲线按照如下确定所述待测样本中是否含有番茄斑驳花叶病毒：如果所得扩增曲线为s型曲线，则所述待测样本中含有或候选含有番茄斑驳花叶病毒；如果所得扩增曲线为一条直线，则所述待测样本中不含有或候选不含有番茄斑驳花叶病毒。

第五方面，本发明要求保护一种检测待测样本中番茄斑驳花叶病毒基因组cdna含量的方法。

本发明所提供的检测待测样本中番茄斑驳花叶病毒基因组cdna含量的方法，具体可包括如下步骤：

(d1)将所述试剂盒中的番茄斑驳花叶病毒阳性质粒稀释为系列已知浓度，分别作为模板，以前文所述的引物对进行荧光定量pcr扩增，绘制荧光定量pcr标准曲线(以所述番茄斑驳花叶病毒阳性质粒的浓度的对数值为横坐标，以ct值为纵坐标)；

(d2)从待测样本中提取总rna并反转录得到cdna，以所得cdna作为模板，以前文所述的引物对进行荧光定量pcr扩增(与步骤(d1)同条件)；然后根据步骤(d1)所绘制的荧光定量pcr标准曲线得出所述待测样本中番茄斑驳花叶病毒基因组cdna的含量。

其中，步骤(d2)中，具体是按照如下方法得出所述待测样本中番茄斑驳花叶病毒基因组cdna的含量的：将所述待测样本的ct值代入步骤(d1)所绘制的荧光定量pcr标准曲线，从而获得所述待测样本中所述番茄斑驳花叶病毒基因组cdna的含量。

在本发明的具体实施方式中，所述荧光定量pcr具体为sybrgreeni实时荧光定量pcr。

在第四方面和第五方面中，所述pcr扩增和所述荧光定量pcr扩增的退火温度均具体可为60℃。

在第四方面和第五方面中，所述待测样本可为含有或者不含有番茄斑驳花叶病毒的植物样本，如番茄或茄子或辣椒等样本。

第六方面，本发明要求保护如下任一应用：

(c1)前文所述的引物对在制备前文所述试剂或所述试剂盒中的应用。

(c2)前文所述的引物对或所述试剂或所述试剂盒在检测番茄斑驳花叶病毒中的应用，或者在制备用于检测番茄斑驳花叶病毒的产品中的应用。

(c3)前文所述的引物对或所述试剂或所述试剂盒或所述方法在对番茄斑驳花叶病毒所引起的疾病进行早期预测预报中的应用。

其中，所述检测番茄斑驳花叶病毒可为定性检测，也可为定量检测。所述番茄斑驳花叶病毒所引起的疾病具体可为茄子斑驳紫花病。

本发明所提供的番茄斑驳花叶病毒实时荧光定量pcr检测方法与现有技术相比，本发明提供的这种检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、无污染、耗时短的优点。该检测体系的建立可为进一步研究tommv的侵染、增殖、分布等提供可靠的技术手段，并为研发茄子病毒的多重定量检测体系奠定基础。

具体而言，与现有技术相比本发明的有益效果为：

(1)通过标准曲线实现对供试材料中番茄斑驳花叶病毒的定量检测，而常规的pcr技术只能实现番茄斑驳花叶病毒的定性检测。

(2)检测结果可由电脑软件直接读出，不需要进行反应后处理，所以避免了检测结果假阳性的产生及环境的污染。

(3)该实时荧光定量pcr检测过程只需要1h左右，与常规pcr技术相比，大大缩短了检测时间。

(4)通过与常规pcr相比，其灵敏度是常规pcr技术的1000倍。

附图说明

图1为番茄斑驳花叶病毒特异性检测pcr扩增结果。其中，1-2：番茄斑驳花叶病毒(tommv)基因组cdna；3-4：烟草轻型绿花叶病毒(tmgmv)基因组cdna；5-6：番茄褪绿病毒(tocv)基因组cdna；7-8：番茄斑萎病毒(tswv)基因组cdna；9-10：番茄黄化曲叶病毒(tylcv)基因组cdna；11-12：黄瓜花叶病毒(cmv)基因组cdna；13-14：番茄花叶病毒(tomv)基因组cdna；15-16：辣椒轻斑驳病毒(pmmov)基因组cdna；17：烟草花叶病毒(tmv)基因组cdna；18：马铃薯y病毒(pvy)基因组cdna；n：阴性对照；m：bm5000dnamarker。

图2为番茄斑驳花叶病毒荧光定量pcr引物特异性扩增溶解曲线。纵轴为相对荧光值；横轴为温度。其中，1-2：番茄斑驳花叶病毒(tommv)基因组cdna；3-4：烟草轻型绿花叶病毒(tmgmv)基因组cdna；5-6：番茄褪绿病毒(tocv)基因组cdna；7-8：番茄斑萎病毒(tswv)基因组cdna；9-10：番茄黄化曲叶病毒(tylcv)基因组cdna，11-12：黄瓜花叶病毒(cmv)基因组cdna；13-14：番茄花叶病毒(tomv)基因组cdna；15-16：辣椒轻斑驳病毒(pmmov)基因组cdna；17：烟草花叶病毒(tmv)基因组cdna；18：马铃薯y病毒(pvy)基因组cdna，n：阴性对照。

图3为常规pcr灵敏度扩增结果。其中，1-10的模板为阳性标准品，反应体系中cdna含量分别为2.52×10⁷fg/μl，2.52×10⁶fg/μl，2.52×10⁵fg/μl，2.52×10⁴fg/μl，2.52×10³fg/μl，2.52×10²fg/μl，25.2fg/μl，2.52fg/μl，2.52×10^-1fg/μl，2.52×10^-2fg/μl，n为阴性对照；m为bm5000dnamarker。

图4为荧光定量pcr检测tommv的灵敏度检测图(扩增曲线)。其中，1-10的模板为阳性标准品，反应体系中cdna含量分别为2.52×10⁷fg/μl，2.52×10⁶fg/μl，2.52×10⁵fg/μl，2.52×10⁴fg/μl，2.52×10³fg/μl，2.52×10²fg/μl，25.2fg/μl，2.52fg/μl，2.52×10^-1fg/μl，2.52×10^-2fg/μl，n为阴性对照；m为bm5000dnamarker。

图5为番茄斑驳花叶病毒荧光定量pcr扩增的标准曲线。纵轴为ct值，横轴为logdna。

图6为中田间病株样本分离的番茄斑驳花叶病毒和阳性对照的常规pcr扩增结果。其中，1-17分别对应表2中不同供试病毒cdna模板，p为阳性对照，n为阴性对照，m为bm5000dnamarker。

图7为田间植株分离的番茄斑驳花叶病毒和阳性对照荧光定量pcr扩增的溶解曲线。纵轴为相对荧光值；横轴为温度，模板分别对应表2中不同茄子病毒病供试毒株的基因组cdna，p为阳性对照，n为阴性对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、引物的设计与合成

根据tommv的病毒外壳蛋白(coatprotein，cp)基因设计得到用于特异性扩增tommv的引物，具体如下：

正向引物z13：5’-cagtcaggcttgctaaa-3’(seqidno.1)；

反向引物z14：5’-gtctcggtatcatcttca-3’(seqidno.2)。

理论扩增片段长度为169bp，如seqidno.3所示。

实施例2、番茄斑驳花叶病毒的引物特异性检测

采用番茄斑驳花叶病毒及茄科作物上其他常见的毒源为材料(表1)，利用引物z13/z14对番茄斑驳花叶病毒进行特异性检测。相关毒源在田间采样后采用trizol法提取rna，放于-80℃保存备用。

以番茄斑驳花叶病毒及其他在茄科作物上常见的病毒病cdna为模板(表1)，利用特异性引物z13/z14进行常规pcr扩增，同时利用荧光定量pcr体系对上述毒源进行扩增，以检测该引物的特异性。

普通pcr反应体系如下：总反应体系20μl，2×taqpcrmastermix10μl，z13/z14引物各0.4μl，cdna模板1μl，ddh2o补足至20μl。pcr反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，共34个循环；72℃补充延伸10min。pcr扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测。

荧光定量pcr体系如下：2×superrealpremixplus(内含dntpmixture，mg²⁺，sybrgreenⅰ和dna聚合酶)10μl，上下游引物各0.3μl，模板dna1μl，50×roxreferenedye0.4μl，双蒸水补足20μl。所述实时荧光定量pcr的过程中，扩增程序为：95℃预变性15min；95℃变性10s；60℃退火32s；共40个循环。pcr完成后按0.1℃s^-1升温速率从72℃上升至95℃进行溶解曲线的分析验证。采用abi7500型实时荧光定量pcr仪进行。循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果。

特异性引物z13/z14对其他在茄科作物上常见的病毒病pcr扩增结束后，结果表明该引物具有良好的特异性。普通pcr，54℃退火条件下，只有番茄斑驳花叶病毒扩增出169bp的产物(seqidno.3)，其他病毒和阴性对照均无相应扩增产物(图1)。根据荧光定量pcr扩增结果制作标准曲线和溶解曲线，只有番茄斑驳花叶病毒在80℃有单一峰值，其他对照病毒和阴性对照无明显峰值(图2)。以上结果说明该引物对z13/z14特异性良好。

表1引物特异性检测

注：以上病毒均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜病害综合防治课题组采集。

实施例3、番茄斑驳花叶病毒的荧光定量pcr标准曲线的构建及灵敏度检测

以番茄斑驳花叶病毒的cdna为模板，使用引物z13/z14进行pcr扩增，所获扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳进行切胶回收，连接pgm-t载体并转化至感受态细胞dh5α中，经amp抗性和菌落pcr筛选，得到阳性重组质粒标准品(将seqidno.3所示dna片段与peasy-t1载体相连)。

阳性重组质粒标准品dna经紫外分光光度计定量，经10倍梯度稀释为2.52×10⁷fg/μl-2.52×10^-2fg/μl。

以阳性标准品和rnase-freeddh2o为模板，一方面，进行荧光定量pcr扩增，反应结束后，根据每个浓度梯度的循环阈值(ct)，绘制荧光定量pcr标准曲线(横坐标为番茄斑驳花叶病毒阳性质粒的浓度的对数值，纵坐标为ct值)；另一方面，进行普通pcr扩增。实时荧光定量pcr和普通pcr的反应体系及扩增程序均参考实施例2。

各浓度阳性重组质粒标准品的普通pcr检测结果如图3所示，由图可见，其能够检测到的阳性重组质粒标准品的最低浓度为2.52×10⁴fg/μl。各浓度阳性重组质粒标准品的荧光定量pcr检测结果如图4所示，由图4所示扩增曲线可见，阳性重组质粒标准品的浓度为25.2fg/μl及以上时为s型扩增曲线，而当阳性重组质粒标准品的浓度低于25.2fg/μl时，扩增曲线为一条直线，可见荧光定量pcr能够检测到的阳性重组质粒标准品的最低浓度为25.2fg/μl。以上结果表明，本发明中的荧光定量pcr检测方法通过与常规pcr相比，其灵敏度是常规pcr技术的1000倍。

引物对z13/z14对阳性标准的荧光定量pcr扩增结果制作标准曲线，如图5所示。图中所示的标准曲线线性关系良好y＝-3.2738x+29.812，标准误r²＝0.9965。

如果采用荧光定量pcr的方法检测待测样本中是否含有番茄斑驳花叶病毒cdna，可根据扩增曲线进行判断：如果扩增曲线为s型曲线，则认为待测样本中含有番茄斑驳花叶病毒cdna；如果扩增曲线为一条直线，则认为待测样本中不含有番茄斑驳花叶病毒cdna。

实施例4、田间发病茄子叶片内番茄斑驳花叶病毒的检测

2016年3月在山东寿光和辽宁瓦房店等地对17份田间茄子斑驳紫花病发病叶片进行了检测，提取发病组织样本总rna并反转录为cdna，以cdna作为模板，按照实施例2中荧光定量pcr的反应体系及程序，使用引物z13/z14，进行病组织中tommv的荧光定量pcr检测，反应结束后，将待测样本的循环阈值(ct)与实施例3所得标准曲线对照，得到待测样本中tommvcdna的含量，进而得到原来样本中tommv的浓度。阳性对照为tommv的cdna，阴性对照为健康茄子叶片的cdna。

结果如表2所示，供试样品tommv的检出率为100％，ct值为17.52-25.50，健康茄子叶片为阴性，阳性对照的ct值为21.17，表明该方法可用于实际样品中tommv的检测。

表2本发明荧光定量pcr检测方法对17份田间茄子发病叶片检测结果

注：在表2中，“+”为阳性，“-”为阴性。

另外，还采用引物z13/z14以常规pcr的方法检测了表2中所示的田间病株样本分离的番茄斑驳花叶病毒和阳性对照。结果，所有供试番茄斑驳花叶病毒扩增出169bp的产物(seqidno.3)，健康对照均无相应扩增产物(图6)。荧光定量pcr检测结果与常规pcr扩增结果一致，所有供试番茄斑驳花叶病毒均在80℃有单一峰值(图7)，表明该检测技术可以用于田间植株含有番茄斑驳花叶病毒的检测。

<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>一种番茄斑驳花叶病毒实时荧光定量pcr检测方法

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