猪圆环病毒3型微滴数字PCR检测引物和探针及其应用的制作方法

本发明属于分子检测技术领域，更具体地，涉及猪圆环病毒3型微滴数字pcr检测引物和探针及其应用。

背景技术

猪圆环病毒(porcinecircovirus，pcv)为一种共价闭合、单股环状dna病毒，是迄今发现的最小的动物病毒。2016年之前，在全球范围内只发现pcv1和pcv2两个基因型。

2003年左右，全球范围内pcv2发生由pcv2a向pcv2b基因型转变，伴随着病毒致病力增强和对养猪业危害加重。2012年前后，pcv2在世界范围内再次发生基因型转变，由pcv2b向致病力更强的pcv2d转变，导致以pcv2a、pcv2b为免疫原的疫苗的免疫效果降低。2015年，新闻报道的猪皮炎肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysyndrome,pdns)疫情，患病母猪出现厌食症状，皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有相似的临床症状。2016年，堪萨斯州立大学的palinski等借助新一代测序(ngs)技术，从患病母猪及其流产胎儿体内首次鉴定出一种新的病毒。鉴于该病毒与圆环病毒科的病毒具有类似的基因组结构和遗传相似性，但与其他圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列同源性低于70％，根据国际病毒分类委员会(ictv)对圆环病毒的分类标准，将其归类为一种新型圆环病毒，并命名为猪圆环病毒3型(porcinecircovirus3，pcv3)。

截至目前为止，美国多个州的猪群被证实存在pcv3感染，如北卡罗来纳州和爱荷华州等，但目前尚不清楚其他州是否也存在pcv3感染与流行。另外，有研究报道从我国湖北、广东某些发生繁殖障碍的母猪以及急性死亡的仔猪体内检测出pcv3。截至目前，我国已有13个省/直辖市的猪场存在pcv3感染与流行，且主要分布于中东部地区，至于其他省市是否也存在pcv3感染目前还不得而知。近来，stadejek等对波兰境内的14个商品化猪场的母猪、仔猪和育成猪的血清进行pcv3检测，首次证实欧洲地区也存在pcv3感染。kwon等对采自韩国6个省73个猪场的猪口水样品进行pcv3核酸检测，首次发现韩国猪群也存在pcv3感染与流行。

猪为pcv3的主要易感动物，不同年龄、性别和品种的猪只均可感染，且以妊娠母猪和仔猪更易感。目前，尚不清楚野猪是否对pcv3易感，也未发现其他物种感染pcv3的报道。

鉴于pcv3是从患有pdns症状的母猪及其流产胎儿体内所能检出的唯一病原体，且pcv3感染猪的临床症状与病理变化与pcv2高度相似，因此，仅依靠临床诊断很难做出准确判断，必须结合实验室诊断才能确诊pcv3感染。目前已报道的实验室诊断方法主要包括病毒分离与鉴定、dna测序、免疫组化(ihc)、elisa、荧光定量pcr和rpa等。荧光定量pcr(qpcr)检测方法是在普通pcr的基础上，在扩增反应体系中加入一条特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光pcr检测仪来检测靶核苷酸序列的扩增技术。其操作简便、特异性强、灵敏度高，因此被广泛应用于各种病毒的检测。然而qpcr方法需要依赖内参基因或标准物质，只能进行相对定量，且对低浓度病毒的定量结果较不稳定，无法在病毒感染的早期实现精准检测。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供猪圆环病毒3型微滴数字pcr检测引物和探针及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种猪圆环病毒3型微滴数字pcr检测引物，包括：

上游引物pcv3-cap-f：5’-yagtgctccccattgaacggt-3’，y指c或t；

下游引物pcv3-cap-r：5’-cggaaagttccactcgtaaagttat-3’。

为了配合上述引物在微滴数字pcr检测猪圆环病毒3型上的应用，本发明还提供了一种猪圆环病毒3型的微滴数字pcr检测探针，所述探针的核苷酸序列为：

5’-r-ctttgtcctgggtgagcgctggtagtt-q-3’；

其中，r为荧光报告基团，q为荧光淬灭基团。

优选地，其为taqman探针：

pcv3-cap-p：fam-ctttgtcctgggtgagcgctggtagtt-bhq1。

以上所述引物及探针是通过对genbank中公布的不同国家和地区pcv3分离株的183条cap基因序列，以及其他亲缘较近的相关病毒基因组序列进行比较与分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计数对引物和探针，引物长度一般为20-25个碱基左右，探针长度27-30个碱基左右，引物间和引物内无互补序列，经过对照实验得到最优引物和探针序列组合。

因此，含有本发明所述引物和探针的组合物也属于本发明的保护范围。

第二方面，本发明提供前述引物在制备猪圆环病毒3型检测试剂或检测试剂盒方面的应用。

进一步地，本发明提供前述引物和探针组合在制备猪圆环病毒3型检测试剂或检测试剂盒方面的应用。

需要说明的是，含有前述引物和/或探针的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。

第三方面，本发明还提供了一种以非疾病诊断为目的的猪圆环病毒3型的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的dna，获得pcr反应模板；

(2)利用本发明所提供的引物与探针进行微滴数字pcr扩增；

(3)扩增结束后，使用微滴分析仪(dropletreader)进行读数，计算每管反应体系中发出荧光的微滴数量，并根据泊松分布原理精确计算样品中pcv3的拷贝数。

微滴分析仪读数为1，即检测到微滴化反应体系中的扩增信号，认为此反应孔为阳性扩增孔。当阳性质控品的反应孔产生阳性结果，且阴性质控品的反应孔产生阴性结果时，认为该实验为有效实验，否则实验无效，需更换反应试剂或更改反应条件重新进行。阳性样品的判定标准为：在同一样品的3个重复反应组中，至少出现一个阳性扩增孔，则说明待检样品中含有猪圆环病毒3型核酸。阴性样品的判定标准为：在同一样品的3个重复反应组中均为阴性结果，则说明待检样品中不含猪圆环病毒3型核酸。

其中，步骤(2)中的pcr扩增体系中，上游引物和下游引物与探针的浓度比为2:2:1。

作为优选，步骤(2)中的pcr扩增体系为：2×ddpcrsupermix10μl；20μm上下游引物各0.8μl、20μm探针0.4μl；dna模板1μl；ddh2o补足至20μl；

作为优选，所述pcr扩增的反应条件为：95℃10min；95℃30sec、55℃1min，共40循环；98℃10min；4℃恒温。

上述反应体系及条件适用于从病猪组织、血清，或细胞培养液中提取到的dna样品，可实现对猪圆环病毒3型的精准检测。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明对所有已知的183条pcv3的cap基因序列进行分析比对，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。本发明提供的引物和探针对不含pcv3的检测样本均无扩增信号出现，表明其具有良好的特异性。本发明提供的引物和探针可实现对pcv3的精准检测，灵敏度可达到1.6个拷贝。

本发明将微滴数字pcr技术应用于pcv3核酸的检测，可以实现对pcv3感染猪的精准、快速检测，有利于pcv3感染的防控。

附图说明

图1为本发明提供的引物pcv3-cap-f/r和taqman探针pcv3-cap1-p的特异性实验结果示意图。

图2、图3为本发明提供的引物pcv3-cap-f/r和taqman探针pcv3-cap-p的灵敏度实验结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述的猪圆环病毒3型微滴数字pcr检测引物和探针。

通过对genbank中公布的不同国家和地区pcv3分离株的183条cap基因序列，以及其他亲缘较近的相关病毒基因组序列进行比较与分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计数对引物和探针，引物长度20-25个碱基左右，探针长度27-30个碱基左右，引物间和引物内无互补序列，最优引物和探针序列组合如下：

上游引物pcv3-cap-f：5’-yagtgctccccattgaacggt-3’，y指c或t；

下游引物pcv3-cap-r：5’-cggaaagttccactcgtaaagttat-3’，

taqman探针pcv3-cap-p：fam-ctttgtcctgggtgagcgctggtagtt-bhq1。

实施例2

本实施例用于说明使用本发明提供的猪圆环病毒3型微滴数字pcr检测引物和探针对pcv3的检测。

具体检测方法如下：

1、猪血清和组织中总dna的提取：使用qiagen公司blood&tissuekit试剂盒(catno.:69506)提取待测样品的总dna。

2、微滴数字pcr扩增

使用pcr扩增仪(bio-rad公司)和qx200^tmdropletdigital^tmpcrsystems(bio-rad公司)。

1)使用bio-rad公司ddpcr^tmsupermixforprobes(nodutp)试剂盒(catno.:1863024)配置微滴数字pcr扩增反应体系：2×ddpcrsupermix10μl；20μm上下游引物各0.8μl、20μm探针0.4μl；dna模板1μl；ddh2o补足至20μl；

2)在微滴数字pcr的微滴生成卡(dg8cartridge)中间排的8个孔内，加入步骤1)中的20μl反应体系，之后在dg8cartridge最下面一排的8个孔内加入70μl微滴生成油(dgoil)，盖上胶垫，放入微滴生成仪进行微滴生成。将微滴化的油包水反应体系转移至96孔板中，使用封膜仪封膜。

3)将封膜后的96孔板转入pcr扩增仪中进行扩增，扩增条件为：95℃10min；95℃30sec、60℃1min，共40循环；98℃10min；4℃恒温。

pcr扩增结束后，将封膜的96孔板转入微滴荧光检测仪进行读数，计算每管反应体系中发出荧光的微滴数量，并根据泊松分布原理精确计算样品中pcv3的拷贝数。

3、结果判定

微滴分析仪读数为1，即检测到微滴化反应体系中的扩增信号，认为此反应孔为阳性扩增孔。当阳性质控品的反应孔产生阳性结果，且阴性质控品的反应孔产生阴性结果时，认为该实验为有效实验，否则实验无效，需更换反应试剂或更改反应条件重新进行。阳性样品的判定标准为：在同一样品的3个重复反应组中，至少出现一个阳性扩增孔，则说明待检样品中含有猪圆环病毒3型核酸。阴性样品的判定标准为：在同一样品的3个重复反应组中均为阴性结果，则说明待检样品中不含猪圆环病毒3型核酸。

实施例3

本实施例用于说明对猪圆环病毒3型微滴数字pcr引物和探针进行特异性实验。

本实验采用人工合成的猪圆环病毒3型基因组dna，与其他病毒，如猪圆环病毒3型；b02：猪圆环病毒2型；b03：猪伪狂犬病毒；b04：猪繁殖与呼吸综合征病毒；b05：猪瘟病毒；b07：口蹄疫病毒；b08：猪流行性腹泻病毒，提取核酸后，使用微滴数字pcr验证了引物和探针对猪圆环病毒3型的特异性。结果表明，所有其他病毒核酸样本及阴性对照经微滴数字pcr扩增，均未出现特异性扩增信号，猪圆环病毒3型基因组dna出现了典型扩增，说明设计的引物和探针对猪圆环病毒3型具有良好的特异性。

以图1为例，图1为本发明提供的引物pcv3-cap-f/r和taqman探针pcv3-cap-p针对猪圆环病毒3型基因组dna和其他病毒算样本进行微滴数字pcr扩增的实验结果示意图，其中，b01：猪圆环病毒3型核酸；b02：猪圆环病毒2型核酸；b03：猪伪狂犬病毒核酸；b04：猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸；b05：猪瘟病毒核酸；b07：口蹄疫病毒核酸；b08：猪流行性腹泻病毒核酸；b09：阴性对照。

由图可知，本发明提供的引物pcv3-cap-f/r和taqman探针pcv3-cap-p针对猪圆环病毒3型基因组dna出现了典型扩增，说明所述引物和探针对猪圆环病毒3型具有良好的特异性。

实施例4

本实施例用于说明对猪圆环病毒3型微滴数字pcr引物和探针进行灵敏度实验。

本实验采用猪圆环病毒3型基因组dna进行10倍梯度稀释，共设置8个梯度，按照实施例2给出的方法进行检测。微滴数字pcr结果显示，本实验在样品模板量为1.6个拷贝的情况下，可以产生稳定的扩增；或者说，本微滴数字pcr实验方法，在20μl扩增体系时最低可以检测到1.6个拷贝。

图2、图3为本发明提供的引物pcv3-cap-f/r和taqman探针pcv3-cap-p的灵敏度实验结果示意图。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>猪圆环病毒3型微滴数字pcr检测引物和探针及其应用

<141>2018-08-08

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

yagtgctccccattgaacggt21

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cggaaagttccactcgtaaagttat25

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctttgtcctgggtgagcgctggtagtt27