本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及小麦中的基因编辑。本申请提高了小麦中的基因编辑效率。
背景技术：
：：小麦是世界上主要的粮食作物，具有重要的经济地位。从染色体和基因组分析，小麦具有比玉米、水稻等作物更为复杂的特征。首先，小麦是异源六倍体，具有三套染色体组(aabbdd)；其次，小麦基因组为大约17gb。而玉米和水稻均为二倍体(aa)，基因组比小麦要小很多，玉米基因组为2.5gb，水稻基因组仅为430mb。同时小麦基因组具有更多的重复序列和可转座原件。这些特性在一定程度上增加了小麦基因组改良的难度[1]。成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(crispr/cassystem,clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/crisprassociated)是细菌和古细菌中的免疫系统，主要功能是抵抗入侵的病毒及外源dna。其中crispr由一系列高度保守的重复序列(repeat)与间隔序列(spacer)相间排列组成，在体内被转录为长的rna前体(pre-crrna)；在crispr序列附近存在高度保守crispr相关基因(crispr-associatedgene，casgene)，这些基因编码的蛋白具有核酸酶功能，可以对dna序列进行特异性切割，产生dna的双链断裂dsb(doublestrandedbreak)；pre-crrna转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crrna(trans-activatingcrrna，tracrrna)也转录出来。2012年，jennifer实验室首次阐明了化脓链球菌(streptococcuspyogenes)sf370中class2,typeiicrispr/cas9系统的作用机理[2]。细菌中，pre-crrna、tracrrna和cas9形成三元复合体，在其他酶的共同作用下，最终会形成多个成熟的复合体，每个复合体包含crrna、tracrrna和cas9蛋白。crrna是由一个间隔区和一段高度保守的重复序列组成，间隔区是可变的，大约20个核苷酸，可以根据目标基因进行设计，通过该间隔区和外源dna互补配对，从而促使三元复合体发挥功能。进一步的优化表明，crrna和tracrrna可以连接形成一个嵌合的rna分子，称为sgrna(singleguidedrna)，sgrna在体外和cas9蛋白形成有活性的二元复合体(sgrna/cas9)，造成目标dna的断裂，大大简化了该系统的应用。2013年两篇文章相继报道了crispr/cas9系统作为基因编辑的工具在哺乳细胞的应用[3],[4]，随后crispr/cas9系统被广泛应用于各种生物体的基因编辑，成为第三代基因编辑的工具。在农业生物技术方面，crispr/cas9广泛应用于各种农作物基因的改良。目前被报道的农作物包括玉米、水稻、大豆和小麦等[5],[6],[7],[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14],[15],[16],[17]。在实际应用中，crispr/cas9都是基于优化的单分子导向rna(sgrna)进行设计[27]。目前，在单子叶作物中，如玉米和水稻，cas9基因一般是由来自于花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子驱动，或者是来自于玉米多聚泛素蛋白基因的启动子zmubi驱动；sgrna一般是由细胞核内小rna(snrna)的启动子驱动，通常是产生u3或u6snrna的启动子，简称u3或u6启动子，目前水稻和玉米来源的u3和u6被广泛应用于单子叶作物的编辑。根据发表的数据，crispr/cas9系统以dna的形式转化外植体，在筛选标记阳性的t0代玉米中，不同目标基因的编辑效率(编辑的植株数目/筛选标记阳性的植株数目)从60％到98％不等，大部分目标基因的编辑效率在80％以上[6],[18]。在水稻的研究中，也取得了类似甚至更高的编辑效率。目前，由于小麦基因组的复杂性，对小麦基因编辑的研究相对较少。大部分发表的文章来自于少数几个实验室。2013年高彩霞实验室首次报道[28]，采用35s启动子驱动水稻密码子优化的spcas9，小麦u6启动子驱动sgrna，在小麦原生质体中实现了对tamlo基因的编辑。2014年报道[19]，采用玉米zmubi启动子驱动水稻密码子优化的spcas9，小麦u6启动子驱动sgrna，获得了tamlo基因突变的t0代植株，编辑效率为5.6％；在随后的报道中，高彩霞实验室一般采用在转化过程中不添加任何筛选试剂，即不筛选转化植株，直接从再生出来的植株中检测目标基因发生突变的植株。采用突变植株的数目对比起始转化的外植体的数目，即突变频率来衡量crispr/cas9系统的有效性。目前，crispr/cas9系统以dna的形式转化外植体，不同突变位点的突变频率一般在1.0％到9.5％，大部分位点的突变频率在2.0％左右[20]。另一个对小麦研究的是美国的danielf.voytas实验室，采用小麦的原生质体进行crispr/cas9系统的优化[21],[22]。在低筋小麦的研究中，采用crispr/cas9对相应的基因进行片段缺失突变，获得21株转基因的t0植物，并没有报道t0代植株基因突变的结果，而是在t1代的植株进行目标基因的突变分析[23]，这可能和小麦中低的编辑效率有关。另外，就目前我们所查阅到的所有对小麦编辑的文章中，sgrna都由小麦内源tau6启动子驱动，还没有使用小麦内源tau3的启动子的报道；cas9基因在早期的文章中使用35s启动子驱动，最近的文章大多用玉米zmubi启动子驱动，这种改变主要是由于玉米zmubi启动子在小麦未成熟胚中表达更稳定和高效。然而基因编辑效率仍然不尽人意。和其他单子叶作物玉米和水稻相比，crispr/cas9系统在小麦中产生的编辑效率偏低，还需要进一步提高编辑效率；目前没有报道用小麦u3的启动子驱动sgrna进行基因编辑的研究，需要评估小麦u3启动子表达的sgrna的活性，这样在设计多位点编辑的sgrna中，可以有更多的选择，降低在同一个载体上多次使用同一个启动子引起载体不稳定的风险。技术实现要素：在一个方面，本发明涉及一种表达盒，其包含与植物内源高表达启动子有效连接的cas9基因，以及添加在所述植物内源高表达启动子前面的有效连接的增强子。在此处所述的“有效连接”意指，所连接的相关元件能够有效地发挥各自的相关功能或活性。优选地，所述植物内源高表达启动子为植物泛素启动子或植物肌动蛋白启动子。更优选地，所述植物泛素启动子为玉米泛素启动子przmubi1、甘蔗泛素启动子prsoubi4或二穗短柄草泛素启动子prbdubi10。更优选地，所述玉米泛素启动子przmubi1的序列如seqidno:4所示；所述甘蔗泛素启动子prsoubi4的序列如seqidno:5所示；所述二穗短柄草泛素启动子prbdubi10的序列如seqidno:6所示。更优选地，所述植物肌动蛋白启动子为水稻肌动蛋白启动子prosact1。更优选地，所述水稻肌动蛋白启动子prosact1的序列如seqidno:20所示。优选地，所述增强子为植物病毒来源的增强子。更优选地，所述植物病毒来源的增强子为玄参花叶病毒fmv增强子、花椰菜花叶病毒camv35s增强子或者玄参花叶病毒fmv增强子和花椰菜花叶病毒camv35s增强子这两者。更优选地，所述玄参花叶病毒fmv增强子的序列如seqidno:1所示；所述花椰菜花叶病毒camv35s增强子的序列如seqidno:2所示。优选地，所述cas9基因的序列如seqidno:7或8所示。在另一个方面，本发明涉及一种表达盒，其包含与小麦u3启动子有效连接的编码sgrna的dna序列。优选地，所述小麦u3启动子的序列如seqidno:13所示。优选地，所述编码sgrna的dna序列如seqidno:16、17、18或19所示。在另一个方面，本发明涉及一种表达载体，其包含前述的包含与植物内源高表达启动子有效连接的cas9基因以及添加在所述植物内源高表达启动子前面的有效连接的增强子的表达盒，或者前述的包含与小麦u3启动子有效连接的编码sgrna的dna序列的表达盒，或者包含前述的两种表达盒。在另一个方面，本发明涉及一种细胞，其包含前述的表达载体。优选地，所述细胞为农杆菌细胞或小麦细胞。在另一个方面，本发明涉及前述的包含与植物内源高表达启动子有效连接的cas9基因以及添加在所述植物内源高表达启动子前面的有效连接的增强子的表达盒，和/或前述的包含与小麦u3启动子有效连接的编码sgrna的dna序列的表达盒，用于在小麦中进行基因编辑或者用于提高小麦中的基因编辑效率的用途。在另一个方面，本发明涉及一种在小麦中进行基因编辑或者提高小麦中的基因编辑效率的方法，其包括：(1)用在前面添加有有效连接的增强子的植物内源高表达启动子驱动cas9基因的表达；和/或(2)用小麦u3启动子驱动编码sgrna的dna序列的表达。优选地，所述植物内源高表达启动子为植物泛素启动子或植物肌动蛋白启动子。更优选地，所述植物泛素启动子为玉米泛素启动子przmubi1、甘蔗泛素启动子prsoubi4或二穗短柄草泛素启动子prbdubi10。更优选地，所述玉米泛素启动子przmubi1的序列如seqidno:4所示；所述甘蔗泛素启动子prsoubi4的序列如seqidno:5所示；所述二穗短柄草泛素启动子prbdubi10的序列如seqidno:6所示。更优选地，所述植物肌动蛋白启动子为水稻肌动蛋白启动子prosact1。更优选地，所述水稻肌动蛋白启动子prosact1的序列如seqidno:20所示。优选地，所述增强子为植物病毒来源的增强子。更优选地，所述植物病毒来源的增强子为玄参花叶病毒fmv增强子、花椰菜花叶病毒camv35s增强子或者玄参花叶病毒fmv增强子和花椰菜花叶病毒camv35s增强子这两者。更优选地，所述玄参花叶病毒fmv增强子的序列如seqidno:1所示；所述花椰菜花叶病毒camv35s增强子的序列如seqidno:2所示。优选地，所述cas9基因的序列如seqidno:7或8所示。优选地，所述小麦u3启动子的序列如seqidno:13所示。优选地，所述编码sgrna的dna序列如seqidno:16、17、18或19所示。附图说明图1显示了四个双元载体23748、24052、24066和24067的主要区别。pmi*表示pmi(6-磷酸甘露糖异构酶)基因表达盒。图2显示了双元载体23748的图谱。图3显示了双元载体24052的图谱。图4显示了双元载体24066的图谱。图5显示了双元载体24067的图谱。序列表信息seqidno:1为efmv(玄参花叶病毒增强子)。seqidno:2为e35s(花椰菜花叶病毒35s增强子)。seqidno:3为pr35s(花椰菜花叶病毒35s启动子)。seqidno:4为przmubi1(玉米泛素启动子)。seqidno:5为prsoubi4(甘蔗泛素启动子)。seqidno:6为prbdubi10(二穗短柄草泛素启动子)。seqidno:7为ccas9-zm(玉米密码子优化cas9基因)。seqidno:8为ccas9-ta(小麦密码子优化cas9基因)。seqidno:9为tnos(农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子)。seqidno:10为tzmmtl(玉米类金属硫蛋白基因终止子)。seqidno:11为tzmabp3(玉米肌动蛋白结合蛋白3终止子)。seqidno:12为prtau6(小麦u6启动子)。seqidno:13为prtau3(小麦u3启动子)。seqidno:14为prosu3(水稻u3启动子)。seqidno:15为cpmi(6-磷酸甘露糖异构酶基因)。seqidno:16为rsgrnatadep1(sgrna靶标tadep1)。seqidno:17为rsgrnatalox2(sgrna靶标talox2)。seqidno:18为rsgrnatagasr7(sgrna靶标tagasr7)。seqidno:19为rsgrnaosdep1(sgrna靶标osdep1)。seqidno:20为prosact1(水稻肌动蛋白启动子)。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1.经优化的双元载体的构建以及其在小麦中的编辑效率的验证1.材料与方法1.1.双元载体构建实验中用到的spcas9表达盒的各个元件，以及sgrna表达盒的各个元件均在金斯瑞(genscript)进行合成，载体的构建方法采用标准的酶切连接的方法。所有的载体均含有6-磷酸甘露糖异构酶基因表达盒作为植物中的筛选标记。最终构建形成四个双元载体23748、24052、24066和24067用于遗传转化。23748载体上的ccas9-zm在3’端包括核定位信号，采用为玉米密码子优化，其余三个载体上的ccas9-ta在5’端和3’端包括核定位信号，采用小麦密码子进行优化。小麦u3和u6启动子序列参考文献[26],[28]。1.2.小麦的农杆菌转化实验中小麦转化品种为fielder。采用农杆菌转化方法，具体操作见参考文献[24]。1.3.目标基因的序列及检测方法分别选小麦中的dep1基因、lox2基因及gasr7基因作为目标基因进行编辑，采用pcr/re方法对t0代转基因植株进行检测。具体靶标序列，pcr/re方法，pcr扩增引物，以及所用的限制性内切酶见参考文献[25]。1.4.ngs(二代测序；next-generationsequencing)检测方法高通量测序文库的构建和基于illuminamiseq平台的测序由genewiz公司(苏州,中国)完成。使用qubit2.0fluorometer(invitrogen,carlsbad,ca)检测dna样品的浓度，使用metavxtm文库构建试剂盒(genewiz,inc.,southplainfield,nj,usa)构建测序文库。以30-50ngdna为模板，pcr扩增小麦lox2基因的片段，采用5’端添加了5’-acactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’序列的上游引物(5’-tatggctggcgcagagcc-3’)和5’端添加了5’-ctggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’序列的下游引物(5’-cgtagagcttgaggatgtcggc-3’)扩增包含靶标序列的289bp序列。以第一轮扩增产物为模板进行第二轮pcr，在pcr产物5’和3’端分别引入测序引物结合位点和p5,p7序列；在3’端引入index序列用于后续数据拆分。采用miseqpe300，单一文库产生50kreads。使用agilent2100生物分析仪(agilenttechnologies,paloalto,ca,usa)检测文库质量，并且通过qubit2.0fluorometer(invitrogen,carlsbad,ca)检测文库浓度。dna文库混合后，按illuminamiseq(illumina,sandiego,ca,usa)仪器使用说明书进行pe300双端测序，由miseq自带的miseqcontrolsoftware(mcs)读取序列信息。2.实验结果2.1.优化载体的设计本实验设计选取三种泛素启动子来驱动cas9表达，同时在三种泛素启动子前面分别添加两种转录增强子(玄参花叶病毒增强子efmv和花椰菜花叶病毒增强子e35s)来进一步提高启动子的活性。ccas9-ta基因采用小麦密码子优化。对于sgrna的表达，分别选用小麦的u6和u3启动子来驱动不同的sgrna，从而靶向突变不同的基因组位点(载体24052、24066和24067)，三个载体之间的比较可以确定优化的设计。同时，35s启动子驱动的玉米密码子优化的ccas9-zm作为对照载体也可以比较编辑效率的变化(载体23748)。本实验所用的小麦品种为fielder，对目标基因测序分析，三个基因靶标位点的序列与参考文献一致。lox2的靶标序列在fieldera、b和d基因组上均有分布。四个载体设计图1所示，其中24052、24066和24067主要区别在于表达cas9的启动子和终止子不同，载体上的其余元件均相同。每个优化载体可以表达产生4个不同的sgrna，前三个sgrna分别靶向小麦的基因，其中g1(rsgrnatadep1)由小麦u6启动子驱动，可以靶向小麦的dep1基因，g2(rsgrnatalox2)由小麦u3启动子驱动，可以靶向小麦的lox2基因，g3(rsgrnatagasr7)由小麦u6启动子驱动，可以靶向小麦的gasr7基因。三个小麦的靶标序列分别来自文献[25]。最后一个导向rna(g4)(rsgrnaosdep1)靶向水稻的dep1基因。通过与23748在g1靶标序列产生的编辑效率比较，可以分析出三个优化载体的编辑效率高低。通过对比24052，24066和24067这三个载体在g1靶标序列的突变，可以得出在小麦中高表达cas9的启动子。分析u3启动子驱动的sgrna所靶标的目标序列的突变，可以分析小麦u3启动子产生的sgrna是否有活性，从而推断小麦u3启动子是否可用于基因编辑。2.2.优化的cas9表达盒采用农杆菌转化方法，小麦幼胚作为外植体，分别转化双元载体23748、24052、24066和24067，通过甘露糖筛选和taqman分析，最终获得分别获得126、63、102和86株转基因t0代植株。采用pcr/re分析t0代转基因植株b染色体组上g1靶标序列的突变，23748载体的编辑效率是1.6％，24052载体的编辑效率是22.22％，而24066和24067载体均获得了80％以上的编辑效率。和23748载体相比，24052的编辑效率提高了12倍，24066和24067的编辑效率大约提高了50倍。具体数据见表1。说明优化的cas9表达基因盒均提高了小麦中的编辑效率。通过对比小麦密码子优化的三个cas9基因表达盒，甘蔗的泛素启动子prsoubi4和二穗短柄草泛素启动子prbdubi10控制cas9的表达，可以显著提高小麦基因组的编辑效率。表1.四个双元载体在小麦b基因组的dep1靶标序列产生的编辑效率对比选取部分转基因植株，进一步对比分析23748和24066产生的t0转基因植株，分别分析在小麦a、b和d染色体上产生的编辑效率，结果见表2。表明甘蔗的泛素启动子prsoubi4驱动的cas9基因表达盒，不仅在b染色体组的靶标序列产生高的编辑效率，同时也在a和d染色体组的同一靶标序列产生了高的编辑效率。因此优化的cas9基因表达盒在小麦三个染色体组中均显著提高了目标基因的编辑效率。表2.两个双元载体在小麦a、b和d基因组的dep1靶标序列产生的编辑效率对比2.3.小麦u3启动子活性分析采用扩增子二代测序，对24066双元载体产生的部分(47株)t0转基因植株的lox2的靶标序列进行分析。结果表明(表3)，a、b和d三个基因组的总体编辑效率为93.62％，在三个基因组上的编辑效率分别为87.23％、89.36％和68.09％。说明小麦的u3启动子可以有效的产生活性的靶向rna分子，并且与高表达的cas9基因盒同时使用对于在小麦中的靶标序列产生了高的编辑效率。表3.24066在小麦a、b和d基因组的lox2靶标序列产生的编辑效率对比3.讨论本研究主要针对crispr/cas9系统在小麦中编辑效率较低的问题，进行了系统的优化。结果表明，提高cas9基因的表达量可以提高小麦的编辑效率。本实验中采用高表达的组成型启动子，通过对比试验表明，甘蔗的泛素启动子prsoubi4和二穗短柄草泛素启动子prbdubi10均可以显著提高小麦的编辑效率在80％以上。高效稳定的cas9表达盒保证了在外植体转化的早期阶段，细胞中有大量的cas9蛋白存在，在同时有靶向rna产生时，crispr/cas9系统就可以在细胞中发挥编辑作用，产生dna的双链断裂(dsb)，随后细胞自身的非同源末端连接(nhej)的修复途径会将dsb重新连接起来，这一修复过程不是精准的，会引入随机的少数碱基的缺失或插入，从而导致基因失活。这一优化可以大大减少转化过程中起始外植体的数量，并且很容易筛选到不同项目想要的突变类型。相对于二倍体的作物，小麦是异源六倍体作物，各染色体间高度同源，在小麦中完全敲除一个基因，意味中同时要敲除每个基因的6个拷贝，高效稳定的编辑系统对小麦尤其重要。低的编辑效率很容易造成基因的部分拷贝失活，对于研究基因的功能是有局限的。同时本研究证明了小麦u3启动子同样可以在小麦中产生高的编辑效率。在目前的研究报道中，尚无小麦u3启动子控制的靶向rna产生突变的数据。这主要的原因可能是因为小麦中的编辑效率较低，同时大家普遍认为u3的启动效率比u6的启动效率要低，因此小麦的报道均采用u6启动子。本实验数据拓宽了在小麦中启动靶向rna的启动子的选择，在高表达的cas9前提下，小麦u6和u3均可以产生高效编辑效率的靶向rna。这对在小麦中进行多个靶标位点编辑是非常有帮助的，多个启动子的使用，可以减少t-dna区域中的同源序列，降低在整个转化过程中同源重组的风险。参考文献[1]wang,y.,(2014).simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.nat.biotechnol.32,947-951.[2]m.jineketal.,(2012).aprogrammabledual-rna-guideddnaendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.science337,816-821.[3]mali,p.,(2013).rna-guidedhumangenomeengineeringviacas9.science.339,823–826.[4]cong,l.,(2013).multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.science.339,819–823.[5]liang,z.,zhang,k.,chen,k.andgao,c.(2014)targetedmutagenesisinzeamaysusingtalensandthecrispr/cassystem.j.genet.genom.41,63–68.[6]svitashev,s.,young,j.k.,schwartz,c.,gao,h.,falco,s.c.andcigan,a.m.(2015)targetedmutagenesis,precisegeneeditingandsite-specificgeneinsertioninmaizeusingcas9andguiderna.plantphysiol.2,931–945.[7]wang,y.,cheng,x.,shan,q.,zhang,y.,liu,j.,gao,c.andqiu,j.l.(2014)simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.naturebiotechnol.32,947-951.[8]jiang,w.,zhou,h.,bi,h.,fromm,m.,yang,b.andweeks,d.p.(2013)demonstrationofcrispr/cas9/sgrna-mediatedtargetedgenemodificationinarabidopsis,tobacco,sorghumandrice.nucleicacidsres.41,e188.[9]shan,q.,zhang,y.,chen,k.,zhang,k.andgao,c.(2015)creationoffragrantricebytargetedknockoutoftheosbadh2geneusingtalentechnology.plantbiotechnol.j.13,791–800.[10]sun,y.,zhang,x.,wu,c.,he,y.,ma,y.,hou,h.,guo,x.,du,w.,zhao,y.andxia,l.(2016)engineeringherbicide-resistantriceplantsthroughcrispr/cas9-mediatedhomologousrecombinationofacetolactatesynthase.mol.plant9,628–631.[11]zhang,h.,zhang,j.,wei,p.etal.(2014)thecrispr/cas9systemproducesspecificandhomozygoustargetedgeneeditinginriceinonegeneration.plantbiotechnol.j.12,797–807.[12]zhou,h.,liu,b.,weeks,d.p.,spalding,m.h.andyang,b.(2014)largechromosomaldeletionsandheritablesmallgeneticchangesinducedbycrispr/cas9inrice.nucleicacidsres.42,10903–10914.[13]zhou,j.,peng,z.,long,j.,sosso,d.,liu,b.,eom,j-s.,huang,s.,liu,s.,veracruz,c.,frommer,w.b.,white,f.f.andyang,b.(2015)genetargetingbythetaleffectorpthxo2revealscrypticresistancegeneforbacterialblightofrice.plantj.82,632–643.[14]cai,y.,chen,l.,liu,x.,sun,s.,wu,c.,jiang,b.,han,t.andhou,w.(2015)crispr/cas9-mediatedgenomeeditinginsoybeanhairyroots.plosone,10,e0136064.[15]du,h.,zeng,x.,zhao,m.,cui,x.,wang,q.,yang,h.,cheng,h.andyu,d.(2016)efficienttargetedmutagenesisinsoybeanbytalensandcrispr/cas9.j.biotechnol.217,90–97.[16]jacobs,t.b.,lafayette,p.r.,schmitz,r.j.andparrott,w.a.(2015)targetedgenomemodificationsinsoybeanwithcrispr/cas9.bmcbiotechnol.15,16[17]li,z.,liu,z.b.,xing,a.,moon,b.p.,koellhoffer,j.p.,huang,l.,ward,r.t.,clifton,e.,falco,s.c.andcigan,a.m.(2015)cas9-guidernadirectedgenomeeditinginsoybean.plantphysiol.169,960-970.[18]shij,gaohetal.(2017)argos8variantsgeneratedbycrispr-cas9improvemaizegrainyieldunderfielddroughtstressconditions.plantbiotechnologyjournal,15(2):207-216[19]wangy,chengx,shanq,zhangy,liuj,gaoc,qiuj(2014)simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.nat.biotechnol.,32,947-951.[20]zhang,y.etal.efficientandtransgene-freegenomeeditinginwheatthroughtransientexpressionofcrispr/cas9dnaorrna.nat.commun.7:12617doi:10.1038/ncomms12617(2016).[21]gil-humanesj,wangy,liangz,etal.(2017)high-efficiencygenetargetinginhexaploidwheatusingdnarepliconsandcrispr/cas9.plantjournal,89(6):1251-1262[22]t,curtinsj,gil-humanesj,etal.amultipurposetoolkittoenableadvancedgenomeengineeringinplants.plantcell.201729(6):1196-1217.[23]sánchez-leóns,gil-humanesj,etal.low-gluten,non-transgenicwheatengineeredwithcrispr/cas9.plantbiotechnologyjournal,2017,16(4)[24]ishiday.etal.wheat(triticumaestivuml.)transformationusingimmatureembryos.methodsmolbiol.2015；1223:189-98.[25]shanq,wangy,lij,gaoc.genomeeditinginriceandwheatusingthecrispr/cassystem.natprotoc.2014；9(10):2395-410[26]christophermarshallsay,sheilaconnellyandwitoldfilipowicz.1992.characterizationoftheu3andu6snrnagenesfromwheat:u3snrnagenesinmonocotplantsaretranscribedbyrnapolymeraseiii.plantmolecularbiology19:973-983[27]patrickdhsu,davidascott,etal.2013.dnatargetingspecificityofrna-guidedcas9nucleases.nat.biotechnol.,31,827-832.[28]qiweis,yanpengw,junl,etal.2013.targetedgenomemodificationofcropplantsusingacrispr-cassystem.nat.biotechnol.,31,686-688.序列表<110>先正达参股股份有限公司(syngentaparticipationsag)先正达生物科技（中国）有限公司(syngentabiotechnologychinaco.,ltd.)<120>小麦中基因编辑效率的优化<130>81623-cn-reg-org-nat-1<141>2018-09-05<160>20<170>patentinversion3.5<210>1<211>194<212>dna<213>人工序列<220><223>玄参花叶病毒增强子efmv<400>1agctgcttgtggggaccagacaaaaaaggaatggtgcagaattgttaggcgcacctacca60aaagcaactttgcctttattgcaaagataaagcagattcctctagtacaagtggggaaca120aaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccactcactattgcgtttgacgaacgcag180tgacgaccacaaaa194<210>2<211>293<212>dna<213>人工序列<220><223>花椰菜花叶病毒35s增强子e35s<400>2acttttcaacaaagggtattatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgt60cactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgat120aaaggaaaggctatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggaccccca180cccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggat240tgatgtgatatctccactgacgtaagggttgacgaacaatcccactatccttc293<210>3<211>521<212>dna<213>人工序列<220><223>花椰菜花叶病毒35s启动子pr35s<400>3agtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttca60tacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacttggtggagcacg120acacgctagtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattg180agacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatct240gtcacttaattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcg300ataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccc360cacccacgaggagcatcgtggtaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtgg420attgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaag480acccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagg521<210>4<211>1993<212>dna<213>人工序列<220><223>玉米泛素启动子przmubi1<400>4ctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtcta60agttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatcta120tctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataa180tatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattga240gtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctccttttt300ttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagtacatccatttagg360gtttagggttaatggtttt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