侧孢短芽孢杆菌A60蛋白激发子PeBL2及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种侧孢短芽孢杆菌a60激发子pebl2及其编码基因和应用。

背景技术：

农作物病害中有70％是由病原真菌引起的，对农业生产造成了巨大的损失。过度依赖化学防治带来的农产品质量安全、人类和环境安全已经受到全球广泛关注，因此，寻求安全有效的生物防治策略成为保障农产品安全生产的重要研究内容。

生防细菌作为一类重要的生物农药已经应用于农作物病虫害的生物防治，该类细菌不仅对靶标病害有直接杀死和生态位竞争作用，还能通过诱导植物抗性而抵御病害的侵染，从而减轻病害的发生，减少化学农药使用量。近年来，从生防细菌中分离鉴定植物免疫激发子越来越受到人们的关注，生防细菌激发子的鉴定不仅能为阐明生防细菌作用机制提供理论基础，同时也可将激发子开发成蛋白免疫诱导剂应用于农作物病害的生物防治，具有广阔的开发利用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够提高植物抗性的侧孢短芽孢杆菌分泌蛋白质pebl2及其编码基因和应用。

一种侧孢短芽孢杆菌a60激发子pebl2，其氨基酸序列如序列表中seqidno:2所示。

本发明所述的侧孢短芽孢杆菌a60激发子pebl2在提高植物抗性中的应用。

本发明所述的应用，其中所述植物为本生烟。

一种pebl2基因，其核苷酸序列为下列所述之一：

(1)编码如seqidno:2所示蛋白质的多核苷酸序列；

(2)与上述多核苷酸序列根据碱基配对原则互补的多核苷酸序列。

本发明所述的pebl2基因，其中，其多核苷酸序列如seqidno:1所示。

一种重组载体，含有本发明所述的pebl2基因。

本发明所述的重组载体，其中所述载体为在pet28载体多克隆位点插入本发明所述的pebl2基因的重组载体。

一种遗传工程的宿主细胞，其含有本发明所述的重组载体。

本发明所述的遗传工程的宿主细胞，其中所述宿主细胞为含有本发明所述的重组载体的大肠杆菌bl21(de3)。

本发明的蛋白质，是指来自侧孢短芽孢杆菌(brevibacilluslaterosporus)a60的培养液、培养液的上清液或菌体的蛋白质。

本发明侧孢短芽孢杆菌a60激发子pebl2与现有技术不同之处在于：

本发明侧孢短芽孢杆菌a60激发子pebl2蛋白质可以明显提高植物对真菌病害的抗性，10μmhis-pebl2处理本生烟叶3d后接种灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)，病斑直径的最高抑制率可分别达到40.2％。

微生物保藏信息

本发明所述的侧孢短芽孢杆菌(brevibacilluslaterosporus)a60菌株是本实验室从海南昌江土壤中分离出的高活性生防菌株，已经于2012年1月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)进行了保藏，登记入册编号cgmccno：5694。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话010-64807355。

下面结合附图对本发明的侧孢短芽孢杆菌a60激发子pebl2蛋白质及其编码基因和应用作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中粗蛋白通过阳离子交换柱hitrapspff的色谱图；a、b代表2个洗脱峰；

图2a为本发明中利用agilent1200hplc高效液相色谱对洗脱峰b进行反相柱层析的图谱，其中a、b、c、d、e、f代表五个洗脱峰；

图2b为不同洗脱峰的激发子活性检测结果；

图3a为本发明中纯化蛋白pebl2的sds-page图谱；m代表marker；

图3b为纯化蛋白pebl2的活性检测；

图4为his-pebl2处理和对照烟草叶片活性氧物质的定性检测图；左为对照，右为处理；

图5为his-pebl1诱导本生烟抑制灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)的侵染实验结果图。

具体实施方式

实施例1侧孢短芽孢杆菌a60培养及发酵代谢液制备

采用lb培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g溶于蒸馏水1000ml，调节ph至7.5)。挑取活化单菌落于2l的lb培养基中进行摇瓶震荡培养，培养条件为30℃、180rpm培养大于48h。4600rpm离心去除菌体细胞，上清液用于蛋白分离。

实施例2粗蛋白的制备和活性监测

对所得上清液用0.45mm的滤膜(whatman产品)抽滤两次，直至没有菌体。之后进行硫酸铵沉淀，缓慢加入硫酸铵使之达到80％饱和度，4℃搅拌过夜。12000rpm，20分钟离心收集沉淀。用25mmol/lmes-naoh(ph6.2)对沉淀物进行重悬，再利用透析袋脱盐，透析袋选取截留分子量在8000d-12000d。首先使用蒸馏水作为透析液，透析三次后使用25mmol/lmes-naoh(ph6.2)缓冲液，再进行透析2-3次，每次透析需要间隔约4h更换一次透析液，保证透析袋内外溶液能够保持盐浓度一致，同时也达到了更换缓冲液的目的。透析完成后，10000rpm，离心10min去除透析过程中产生的沉淀，得到粗蛋白溶液。

生物活性的监测：以生长2个月，具有6-8片叶的本生烟为材料，以25mm、ph6.2的mes-naoh缓冲液为对照，粗蛋白溶液浓度为10μmol/l，利用1ml不带针头的注射器，将50μlmes-naoh缓冲液、50μl粗蛋白溶液从叶子背面分别注射进叶片中去，以tris-hcl(ph7.8)溶液作为对照。24h观察是否有坏死斑形成。

结果：注射粗蛋白溶液的叶片，注射部位6h后出现水渍斑，12h后注射处叶片变得透明较薄一些，24h后可以呈现典型的过敏反应，有坏死斑形成。对照并无任何反应，和正常叶片一样。

实施例3粗蛋白溶液中蛋白质激发子的分离纯化及生物活性测定

(1)离子交换层析分离

使用explore10(gehealthcare)蛋白质纯化仪对所得的粗蛋白进行进一步纯化。样品首先通过阳离子柱hitrapspff阳离子交换柱(gehealthcare)，每次上样40ml，平衡液为25mm的mes(ph6.2)，洗脱液为20mm的mes(ph6.2)与1mnacl，流速2ml/min。进行线性洗脱(0％-100％，30min)，获得到蛋白质洗脱峰(见图1)，将各蛋白质洗脱峰组分脱盐后进行生物活性的检测，结果表明，蛋白质峰b可以引起本生烟的过敏反应。

(2)反相层析纯化

利用agilent1200hplc高效液相色谱纯化洗脱峰b，watersatlantist3c18反相柱(2.1×150mm，3.5m，40℃)，平衡缓冲液为含有1％三氟乙酸的超纯水，洗脱缓冲液为100％乙腈。洗脱梯度：20min，水80％-0％；乙腈20％-100％，洗针上样，一次80ul，流速:1.0ml/min。多次重复上样收集各组分，反相层析图谱见图2a。将得到五个主要峰，按实施例2中生物活性的监测方法进行生测，d峰有明显激发子活性。结果见图2b。

实施例4蛋白激发子的鉴定

切取b5胶条进行质谱分析。使用tripletof5600tofms分析仪(appliedbiosystems)分析制备型hplc后收集的活性链段，并以ms扫描模式获得数据，扫描范围为250-2000(m/z)。使用串联飞行时间质谱仪5800maldi-tof/tof，absciex)进一步分析，激光源为钕，波长355纳米：yag激光加速电压为2kv，使用正离子模式和自动数据采集数据，一阶质谱扫描范围是800-4000道尔顿，选择信噪比大于50两阶段母离子质谱(ms/ms)分析，每个插图点击选择8a母离子，二级质谱(ms/ms)累积叠加2500，碰撞能量2kvcid关闭。将得到的序列信息在ncbi短芽孢杆菌(40021)数据库检索，对结果的可信度进行打分排序。其中分数最高的蛋白为来自侧孢短芽孢杆菌的假设蛋白(登录号erm16658.1)。将此蛋白质激发子命名为pebl2(proteinelicitorbrevibacilluslaterosporus2)。其氨基酸序列见序列表中的sedidno:2。该蛋白理论分子量为17.2kda。

实施例5蛋白质激发子pebl2编码基因的克隆

pebl2蛋白由156个氨基酸组成，理论分子量为17.22kd，等电点9.66。根据质谱测序结果和密码子的简并性设计引物为pebl2正向5’-tcaaccacatcctccgtacagc-3’和pebl1反向5'-tgctacgaaccagagaagcca-3'，如seqidno:3-4所示。并以侧孢短芽孢杆菌a60基因组为模板，pcr扩增出471bp的dna片段，将其命名为pebl2基因，该基因的顺序如seqidno:1所示。

实施例6pebl2基因的原核表达和纯化

(1)表达载体的构建

本实验使用pet28histev/lic载体，设计蛋白质激发子基因pebl2去除信号肽的特异性引物，正向引物：5’-cgggatcctcaaccacatcctccgtacagc-3’，反向引物：5’-ccctcgagtgctacgaaccagagaagcca-3’，如seqidno:5-6所示。扩增全长pebl2基因(94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35cycles；72℃10min；4℃∝)。反应条件：22℃孵育30min；75℃20min，终止反应。取t4聚合酶处理过的载体2μl和pcr产物1μl混合，22℃连接5min，加入1μl25mmedta，22℃5min终止反应。将连接好的产物转化trans1-t1感受态细胞。挑取阳性克隆，摇菌并提取质粒，酶切并测序验证。

(2)诱导表达

将步骤(1)中所获得表达载体用热激法转化到大肠杆菌bl21(de3)中。质粒提取及转化表达宿主菌株的方法同(1)。将验证正确的重组表达菌株过夜活化，取1ml过夜培养液加入到含有100μg/ml卡那霉素的100mllb液体培养基中(1％接种量)，37℃，200r/min振荡培养2～3h培养至od600为0.6～0.8。加入诱导剂iptg(终浓度为0.2mmol/l)，16℃，220r/min继续振荡培养16h，诱导表达目的蛋白。离心收集菌体加入缓冲液。经超声破碎菌体后，4℃高速离心，收集上清，得到重组蛋白液。

(3)重组蛋白的纯化

利用explorer10蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化。选用histraphpcolumn柱进行亲和层析，先用清洗缓冲液(50mmtris，200mmnacl，ph7.8)平衡亲和柱；取步骤(2)中获得的重组蛋白液40ml进样，流速为2ml/min，淋洗至基线后，洗脱缓冲液(50mmtris，200mmnacl，500mm咪唑，ph7.8)进行洗脱，收集洗脱峰；利用hitrapdesaltingcolumn对样品进行除盐除杂。各组分进行sds-page检测，结果见图3a。

结果：获得纯化的融合表达蛋白(his-pebl2重组蛋白)。重组蛋白(his-pebl1)能够引起本生烟叶片发生过敏反应，与天然蛋白具有相同的活性，结果见图3b。

实施例7重组蛋白(his-pebl1)在本生烟上引起氧爆发防御反应

氧爆发指的是活性氧物质的积累，活性氧物质包括h2o2。本实验通过监测h2o2的积累来说明氧爆发的过程。氧爆发(reactiveoxygenspecies，ros)在激发子诱导的植物抗病防卫反应中起着非常重要的作用，参与调控气孔运动，促进细胞编程性死亡，直接或间接杀死入侵的病原菌，作为第二信使可在转录水平上激活和调控植物体内各种防卫相关基因的表达。本生烟叶片处理方法如实施例2生物活性监测中的方法，his-pebl2浓度为4μm，处理8h取样，以tris-hcl缓冲液作为阴性对照。将切下的番茄叶片置于含有0.01％triton-x-100和1mg/ml硝基3,3'-二氨基联苯胺(dab)的溶液中，以低真空压力渗入该溶液5min，并将叶片在室温下孵育过夜。在酒精乳酚(95％乙醇：乳酸：苯酚，2:1:1)中脱色，直到叶子不含叶绿素，然后用水漂洗。通过观察在叶片中生成的棕红色沉淀，来检测生成的h2o2。

结果：用his-pebl2处理8h的本生烟叶片有明显的褐色沉积物质出现，而对照无褐色产生，说明his-pebl2能引起本生烟叶片h2o2的积累，结果见图4。

实施例8pebl2诱导本生烟抑制灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)的侵染实验

先用30ulhis-pebl2注射烟草叶片右侧，每株处理三片叶，以缓冲液为对照，每处理重复三株。接种灰葡萄孢菌饼后放在28℃培养箱中培养3天，观察发病情况，照相并测量各处理叶片上的菌饼直径，计算抑制率。

结果：his-pebl2处理的叶片，菌饼生长比对照缓慢，抑制率达到40.2％。结果见图5。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>侧孢短芽孢杆菌a60蛋白激发子pebl2及其编码基因和应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>471

<212>dna

<213>侧孢短芽孢杆菌(brevibacilluslaterosporus)

<400>1

atgcgtaaacaatctaaaaaaatgattgtaagtcttttgtctacgtcactattggctgta60

tctctagcagttcctgtttcagcatcaaccacatcctccgtacagcaggctgtagtagta120

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atccaggagattgttgttgctatagagtggcttctctggttcgtagcatag471

<210>2

<211>156

<212>prt

<213>侧孢短芽孢杆菌(brevibacilluslaterosporus)

<400>2

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145150155

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcaaccacatcctccgtacagc22

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<210>5

<211>30

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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