一种产海洋低温尿酸氧化酶菌株的发酵培养基及发酵条件的制作方法

本发明属于酶工程和基因工程领域，具体涉及一种产海洋低温尿酸氧化酶菌株的发酵培养基及发酵条件。

背景技术

尿酸氧化酶是以尿酸为底物，能催化尿酸嘌呤环氧化开放，生成尿囊素，二氧化碳和过氧化氢的一种胞内酶。尿酸氧化酶广泛应用于医药、临床检测和商用染发剂，具有广阔的研究前景。国内医药所需的尿酸氧化酶主要依赖于进口，价格昂贵，但是国内外对尿酸氧化酶的研究仍处在起步阶段，现有的尿酸氧化酶的产量低，所得到的酶活也不高，因此需要对尿酸氧化酶进行深入研究，以提高其酶活和产量，丰富我国的医药市场。

对尿酸氧化酶生理代谢产生重要影响的是其培养条件，剧烈的温度变化会影响酶的活性，从而影响相关代谢产物的积累，培养基ph的变化会改变细胞膜表面的电荷状态，从而直接影响细胞膜的通透性以及细胞的物质运输与能量交换，最终影响微生物的生理代谢功能。培养基是微生物生长代谢的必须成分，培养基的各种成分及其变化对微生物的生理生化功能产生重要影响，培养基成分变化直接影响微生物代谢产物的积累。因此需要筛选出最优培养基及发酵条件，充分发挥菌株产酶潜能，提高产酶率，从而实现工业化生产。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种产海洋低温尿酸氧化酶菌株的发酵培养基及发酵条件。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种产尿酸氧化酶的发酵培养基，所述培养基的碳源为尿酸，氮源为酵母膏。

上述产尿酸氧化酶的发酵培养基，所述培养基为尿酸浓度1.00％，酵母膏0.75％、k2hpo40.25％、mgso40.05％、kh2po40.07％。

上述产尿酸氧化酶的发酵培养基的发酵条件，培养温度25℃、转速160r/min、接种量5％、ph7.5、装液量125ml/500ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过优化后的培养基及发酵条件，尿酸氧化酶酶活由优化前的约12.1u/ml提高到42.57u/ml，比优化前提高了351.2％；且该酶具有较强的耐低温和耐盐性，使该酶能够在更多不同的环境中得到应用，对提高该酶的市场竞争力有着非常重要的意义。

附图说明

图1酵母膏与尿酸对酶活交互影响的曲面图和等高线图；

图2温度与尿酸对酶活交互影响的曲面图和等高线图；

图3温度与酵母膏对酶活交互影响的曲面图和等高线图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明做进一步说明。

实施例1优化发酵培养基及发酵条件

1.发酵条件优化单因素试验

(1)碳源、氮源优化：分别在发酵培养基中加入可溶性淀粉、尿酸、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖作为碳源，添加量为0.5％；分别在发酵培养基中加入蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、磷酸氢二铵、氯化铵、尿素作为氮源，添加量为3％。在25℃、160r/min条件下培养36h，按照酶活测定方法测定酶活，考察碳源、氮源对苛求芽孢杆菌z7-1产尿酸氧化酶活力的影响。每个处理做3个平行。

(2)尿酸添加量分别为0.25％、0.50％、0.75％、1.00％、1.25％，酵母膏添加量分别为0.25％、0.50％、0.75％、1.00％、1.25％，k2hpo4添加量分别为0.10％、0.15％、0.20％、0.25％、0.30％；kh2po4添加量分别为0.01、0.03％、0.05％、0.07％、0.09％的；mgso4添加量分别为0.01％、0.03％、0.05％、0.07％、0.09％，培养基初始ph值分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，发酵温度分别为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，转速分别为140r/min、150r/min、160r/min、170r/min、180r/min，装液量分别为50ml/500ml、75ml/500ml、100ml/500ml、125ml/500ml、150ml/500ml、175ml/500ml，接种量分别为3％、4％、5％、6％、7％。在25℃、160r/min条件下振荡培养36h后测定酶活，考察各个因素对苛求芽孢杆菌z7-1产尿酸氧化酶活力的影响。每个处理做3个平行。

单因素优化结果为：尿酸浓度1.00％酵母膏0.75％、k2hpo40.25％、mgso40.05％、kh2po40.07％、培养温度25℃、转速160r/min、接种量5％、ph7.5、装液量125ml/500ml。

2.plackett-burman设计

在单因素试验的基础上，选取9个影响因素作为研究对象，以尿酸氧化酶酶活(y)为响应值，进行试验次数n＝12的plackett-burman(pb)设计，pb试验设计的因素与水平见表1。

表1plackett-burman试验因素及水平设计

采用mintab软件设计plackett-burman试验得出尿酸、酵母膏、温度3个最重要影响因素。

3.最陡爬坡试验设计

根据plackett-burman试验结果中各个显著影响因素效应的大小来设定步长及变化方向，找出峰值，快速逼近最佳值区域。

最陡爬坡试验是为了确定显著影响因素的取值逼近中心点以及提高尿酸氧化酶的产量，尿酸、发酵温度和酵母膏这3个因素的变化方向和步长的试验设计及结果见表2。由表2可知，3个显著影响因素的中心点在第2组试验附近，因此确定以第2组的水平作为响应面试验的中心点，即尿酸添加量(x1)、酵母膏添加量(x2)、发酵温度(x3)分别为1.00％，0.75％℃和25℃。

表2最陡爬坡试验设计及结果

4.中心组合试验设计

根据最佳爬坡试验结果，将酶活最高的一组作为中心组合试验中心点，运用minitab15软件进行box-behnken试验设计，采用响应面分析法对产酶条件参数进行优化分析。运用minitab15软件分析得到最优结果，最后对预测值进行验证。每个试验重复3次，取平均值。

利用上述plackett-burman试验结果，在pb试验和最陡爬坡试验确定的3因素3水平的基础上，以酶活(y)为响应值，响应面试验因素与水平见表3，设计及结果见表4。

表3响应面试验因素与水平

表4box-behnken试验设计及结果

运用minitab15软件对表4中心组合试验数据进行回归模型方差分析，结果见表5。回归拟合二次多项式得到回归方程：

y＝45.53+2.80x1+2.25x2+3.45x3-0.48x1x2+1.28x1x3-1.68x2x3-3.00x1²-1.85x2²-3.05x3²

由表5可知，该回归模型的影响达到极显著水平(p＜0.01)，失拟项p值为0.106＞0.05，因而无失拟因素存在。其自变量x1，x2，x3，x2x3，x3²对响应值影响显著(p＜0.05)，其他项均不显著(p＞0.05)。回归方程的决定系数r²＝0.9661＞0.9，校正决定系数r²(adj)为0.9512＞0.9，表明响应值变化有96.61％来源于所选变量，说明模型拟合度较好，该回归方程可用于代替试验真实点对试验结果进行初步分析和预测。

表5回归系数显著性检验

注：“*”表示对结果影响显著(p＜0.05)，“**”表示对结果影响极显著(p＜0.01)。

利用minitab15软件绘制响应面曲线图1，结果见图1。由图1可知，响应值存在最大值，经软件分析获得酶活发酵条件为尿酸添加量1.14％，酵母膏添加量0.81％，发酵温度28.1℃，软件分析预测最大酶活为45.6u/ml。为了便于实际操作，将发酵条件修改为尿酸添加量1.0％，酵母膏添加量0.8％，发酵温度28℃，在此条件下重复3次验证试验，平均酶活为42.5u/ml，与理论值接近，表明采用响应面法优化得到的最佳条件准确可靠。优化后的酶活比优化前的12.1u/ml提高了351.2％。

本发明产尿酸氧化酶的发酵培养基为：尿酸浓度1.14％、酵母膏0.81％、k2hpo40.25％、mgso40.05％、kh2po40.07％。最佳发酵条件为：培养温度28.1℃、转速160r/min、接种量5％、ph7.5、装液量125ml/500ml。