基于杂交链式反应和动态光散射检测尿液中端粒酶活性的方法与流程

本发明涉及一种端粒酶活性检测方法，属于癌症无创诊断技术领域，具体涉及一种基于杂交链式反应和动态光散射检测尿液中端粒酶活性的方法。

背景技术：

膀胱癌是一种常见的恶性疾病，是泌尿生殖系统中第二常见的肿瘤，已成为男性中最常见的恶性肿瘤第四名，女性中第九名。膀胱癌的诊断方法主要包括膀胱镜检查和尿细胞学检查。膀胱镜检查是诊断泌尿系统症状的标准方法，但其成本较高，并会让病人产生不适或者引起并发症。尿细胞学检查是一种非侵入性的方法，它具有较高的特异性，但是由于尿液中脱落细胞较少，尤其是在低级和早期肿瘤过程中，导致其灵敏度较低。因此，一种无创、简单、可靠的膀胱癌诊断方法是极其需要的。

近年来，针对尿液进行的一些非侵入性检测得到研究，如端粒重复扩增(trap)法检测端粒酶活性水平，彗星试验检测尿脱落细胞dna损伤，尿dna甲基化分析等。然而，这些生物标志物需要进一步进行研究验证。

端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，它可以通过其自身固有的rna模板和逆转录酶和相关蛋白在端粒末端加入ttaggg重复序列维持端粒长度。端粒酶活性在大多数正常人体组织中被抑制，端粒长度随着细胞的周期分裂递减，导致细胞的衰老和死亡。但在85％以上的恶性肿瘤细胞中端粒酶活性被激活并表达，使癌细胞可以不断增殖。因此，端粒酶被认为是一种潜在的肿瘤生物标志物，是一种很有前景的治疗靶点。

目前端粒酶活性检测的主要方法是基于pcr的端粒重复序列扩增法(telomericrepeatamplificationprotocol，trap)。然而，该法存在操作复杂，工艺繁琐，费用昂贵以及非特异性扩增等问题。

因此，如何开发出一种简单、灵敏方法来实现端粒酶活性的检测是很有必要的，也是所属领域技术人员急需解决的技术难题。

技术实现要素：

针对上述问题和需求，本发明提供了一种基于hcr和dls检测尿液中端粒酶活性的方法，通过测定金纳米颗粒动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现对端粒酶活性的高灵敏定量分析。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下。

一种基于杂交链式反应和动态光散射检测尿液中端粒酶活性的方法，主要包括如下步骤：

1)制备dna修饰的金纳米颗粒(dna-aunp)探针；

2)延伸反应：在含有待测端粒酶引物(tsprimer)、dntps和扩增缓冲液中加入待测端粒酶提取液，恒温孵育，使tsprimer发生延伸反应，得到延伸反应产物溶液；

3)hcr反应：延伸反应产物溶液中加入两发夹探针h1和h2，混合均匀后进行hcr反应，得到长的、带缺口的双链dna产物；

4)将dna-aunp探针加入到hcr产物中，通过dna杂交使金纳米颗粒发生聚集。

上述检测尿液中端粒酶活性的方法，步骤2)中，在待测样品中端粒酶的催化下，tsprimer的延伸产物可以诱导h1和h2发生hcr反应，而未延伸的tsprimer不能引发hcr反应。

上述检测尿液中端粒酶活性的方法，所述tsprimer具有seqidno:1所示核苷酸序列(5`-aatccgtcgagcagagtt-3`)，延伸产物的序列为5`-aatccgtcgagcagagttagggttaggg-3`。

上述检测尿液中端粒酶活性的方法，步骤3)中，发夹探针h1和h2包含两部分，一部分参与hcr反应，另一部分可以与dna-aunp探针杂交。

上述检测尿液中端粒酶活性的方法，所述发夹探针h1具有seqidno:2所示核苷酸序列(5`-ccctaaccctaactctgctcgaaagagatcgagcagagttagggtttttttttttttt-3`)；

探针h2具有seqidno:3所示核苷酸序列(5`-tcgagcagagttagggttagggccctaactctgctcgatctctttttttttttttttt-3`)。

上述检测尿液中端粒酶活性的方法，步骤4)中，金纳米颗粒修饰的dna序列根据发夹探针h1和h2的互补片段进行设计；根据金纳米颗粒的动态光散射信号(粒径大小)，测定样品中的端粒酶活性。

上述检测尿液中端粒酶活性的方法，dna-aunp探针具有seqidno:4所示核苷酸序列(hs-5`-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa)。

上述检测尿液中端粒酶活性的方法，还包括步骤5)，测定金纳米颗粒动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现对端粒酶活性的高灵敏定量分析。

上述检测尿液中端粒酶活性的方法，该方法的检测下限为4个细胞；该方法尤其适用于膀胱癌患者的尿液检测。

上述检测尿液中端粒酶活性的方法，尿液中端粒酶的提取工艺如下：

收集新鲜尿样在4℃，850rpm下离心10分钟，用pbs冲洗一次后再在2300rpm，4℃下离心5分钟，然后将沉淀溶解在200μl裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟，最后在4℃，12000rpm下离心20分钟，将上清液转移，储存在-80℃备用。

借由上述技术方案，本发明具有如下优点和有益技术效果：

1)本发明的方法是当活性端粒酶存在时，其引物(tsprimer)的延长产物会引发hcr反应，hcr产物可以与dna-aunp探针杂交，导致金纳米颗粒发生聚集，通过测定金纳米颗粒动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现对端粒酶活性的高灵敏定量分析。

2)本发明的方法具有操作简单、灵敏度高、成本低等优点，而且该方法尤其适用于膀胱癌患者的尿液检测。

3)结果表明，本发明对膀胱癌具有特异性响应，为膀胱癌的无创诊断提供了新的途径。

附图说明

附图用来对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明实施例一起用来解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1为本发明基于hcr和动态光散射检测尿液中端粒酶活性的方法原理图。

图2a和图2b分别显示的是本发明采用动态光散射分析不同样品(未引发hcr和引发hcr)的粒径大小分布图。

图3为本发明检测不同数量mcf-7细胞端粒酶活性的粒径大小图，插图为10到1000个mcf-7细胞的标准曲线。

图4为本发明检测不同癌症病人尿液端粒酶活性的粒径大小图。

具体实施方式

本发明公开了一种基于杂交链式反应(hcr)和动态光散射(dls)检测尿液中端粒酶活性的方法。

杂交链式反应(hybridizationchainreaction，hcr)作为一种等温、无酶核酸放大技术备受关注，是在引发链的诱导下使两发夹探针发生级联杂交反应，形成长的、带缺口的双螺旋dna。hcr可以与多种探针结合，金纳米颗粒(goldnanoparticles,aunps)是一种最常用的纳米材料，由于其比表面积大、光学性质独特、生物相容性好，被广泛用于传感平台的构建。aunps随着分散/聚集状态的改变，其粒径大小也随之变化，因此，可以将aunps与hcr结合，金纳米颗粒粒径大小可以转换为hcr产物的量。

动态光散射(dynamiclightscattering，dls)是一种常用光学测量技术，测定直径在0.5nm～6μm之间的粒子尺寸，大多数纳米材料的尺寸范围在dls的理想检测范围内，金纳米颗粒的粒径大小可以采用dls进行检测。

如图1所示，为本发明基于hcr和dls检测尿液中端粒酶活性的方法原理图。当没有端粒酶或端粒酶失活时，金纳米颗粒保持分散状态；而当活性端粒酶存在时，金纳米颗粒发生聚集，其粒径明显增大。

该方法是当活性端粒酶存在时，其底物的延长产物会引发探针h1和h2发生hcr反应，形成长的、带缺口的双链dna产物。然后hcr产物可以与dna修饰的金纳米颗粒(dna-aunp)探针杂交，导致金纳米颗粒发生聚集。测定金纳米颗粒动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现对端粒酶活性的高灵敏定量分析。

本发明的方法操作简单、检测成本低、所需样品少，灵敏度高且特异性好。同时，该方法的检测下限为4个细胞；我们将该方法用于多种癌症病人尿液中端粒酶活性的检测。

以下通过具体较佳实施例结合附图对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。

如图1所示，本发明涉及一种基于hcr和动态光散射检测尿液中端粒酶活性的方法。具体如下：

1、基于端粒酶可在端粒酶引物(tsprimer)末端加入ttaggg重复序列的性质：

tsprimer的延伸产物可引发hcr反应，tsprimer具有seqidno:1所示核苷酸序列(5`-aatccgtcgagcagagtt-3`)，延伸产物的序列为5`-aatccgtcgagcagagttaggg(ttaggg)n-3`；

2、hcr反应：

将延伸产物与发夹探针h1(具有seqidno：2所示核苷酸序列5`-ccctaaccctaactctgctcgaaagagatcgagcagagttagggtttttttttttttt-3`)和h2(具有seqidno:3所示核苷酸序列5`-tcgagcagagttagggttagggccctaactctgctcgatctctttttttttttttttt-3`)混合进行hcr反应(划线部分为参与hcr反应部分)，得到长的、带缺口的hcr产物；

3、杂交：

制备dna-aunp探针(具有seqidno:4所示核苷酸序列hs-5`-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa)，将dna-aunp探针加入到hcr产物中，通过dna杂交使金纳米颗粒发生聚集；

4、动态光散射分析：测定金纳米颗粒动态光散射信号(粒径大小)的变化，实现对端粒酶活性的分析及膀胱癌的诊断。

如图2a和2b所示，分别显示的是本发明采用动态光散射分析不同样品(未引发hcr和引发hcr)的粒径大小分布图。

当没有端粒酶或端粒酶失活时，不能引发hcr反应，金纳米颗粒的粒径为56.4nm；而当活性端粒酶存在时，其引物的延伸产物会引发hcr反应，金纳米颗粒的粒径增大到347.5nm。

如图3所示，图3中显示了本发明检测不同数量mcf-7细胞端粒酶活性的粒径大小图，插图为10到1000个mcf-7细胞的标准曲线。

mcf-7的细胞数和金纳米颗粒的粒径在10到1000个范围内呈良好的线性关系，检出限为4个细胞。如图4所示，图4中显示了本发明检测不同癌症病人尿液端粒酶活性的粒径大小图。

只有膀胱癌病人尿液样品的粒径明显增大，而正常人和其他癌症病人的尿液样品的粒径与空白样品(无端粒酶)的粒径相比没有明显变化，表明本发明对膀胱癌具有特异性响应。

实施例1

一种基于杂交链式反应(hcr)和动态光散射(dls)检测尿液中端粒酶活性的方法，具体包括如下步骤：

1)端粒酶的提取

细胞中端粒酶的提取：将mcf-7细胞在含有10％胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基中培养。用胰蛋白酶提取细胞后，收集了7×10⁶个细胞。将细胞分散在1.5毫升ep管中，在1000rpm下离心5min，并用冰冷的pbs洗涤两次。再将提取液悬浮于200μl裂解缓冲液，在冰上孵育30分钟后，在4℃、12000rpm下离心20分钟。将上清液转移，稀释，储存在-80℃下备用。

尿液中端粒酶的提取：收集新鲜尿样在4℃，850rpm下离心10分钟，用pbs冲洗一次后再在2300rpm，4℃下离心5分钟，然后将沉淀溶解在200μl裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟，最后在4℃，12000rpm下离心20分钟，将上清液转移，储存在-80℃备用。

2)dna修饰的金纳米颗粒制备

aunps的制备是根据经典的柠檬酸钠还原法，并做了适当的调整。将2ml新鲜配制的38.8mm柠檬酸钠溶液迅速加到20ml煮沸的1mm氯金酸haucl4溶液中，反应液由淡黄色变为黑色，再变成紫色，最后变为酒红色，继续加热回流并搅拌10分钟。最后，让反应液冷却至室温并保持搅拌，然后用0.45微米的尼龙滤膜过滤，保存在4℃冰箱中备用。

aunps表面修饰dna：巯基修饰的dna先用磷酸三(2-氯乙基)酯tcep处理，接着按200：1的摩尔比加入到预先制备的aunps溶液中，在室温下孵育16小时。然后在接下来的44小时内分多次加入nacl进行盐老化，nacl的最终浓度为0.1m。最后，将反应液以13800rpm的转速离心30分钟以除去游离的dna(重复3次)，得到的油状沉淀物溶解在10mmpbs缓冲液(ph7.4，0.1mnacl)中，保存在4℃冰箱中备用。

3)hcr反应的进行

将含有端粒酶提取液、1.5μmtsprimer、1mmdntps、0.2mg/mlbsa、0.4u/mlrnase抑制剂的溶液在37℃下孵育3h，然后在95℃加热5分钟使灭活。h1和h2在95℃加热5min，冷却至室温。然后将含有h1(1μm)、h2(1μm)和端粒酶延伸产物的溶液在37℃反应过夜。

4)将hcr产物与dna-aunp探针混合，并检测粒径变化。

加入适量dna-aunp探针到hcr产物中，在30℃下孵育4h，通过dna杂交反应使金纳米颗粒发生聚集，采用动态光散射测定相应的粒径大小变化(如图3所示，粒径最大可以增加到400nm左右)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110>中山大学

<120>基于杂交链式反应和动态光散射检测尿液中端粒酶活性的方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aatccgtcgagcagagtt18

<210>2

<211>58

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccctaaccctaactctgctcgaaagagatcgagcagagttagggtttttttttttttt58

<210>3

<211>58

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcgagcagagttagggttagggccctaactctgctcgatctctttttttttttttttt58

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa20