细胞色素CYP3A7酶的新型特异性探针反应及其应用的制作方法

本发明属医药技术领域，具体涉及去氧胆酰甘氨酸和去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应作为细胞色素cyp3a7酶的特异性探针反应及其应用。

背景技术：

细胞色素p450酶(cytochromep450,cyps)为一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，广泛参与内源性甾体物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢转化和清除。根据氨基酸序列的同源程度，cyps成员依次分为家族、亚家族和亚型酶三级。cyp1a、cyp2a、cyp2b、cyp2c、cyp2d、cyp2e和cyp3a等亚家族是人体内主要的i相药物代谢酶，它们主要表达在肝脏，参与了约75%的上市药物的代谢清除。其中，cyp3a亚家族最为重要，在肝脏和肠道的表达量分别占cyp总量的40%和80%，参与了约46%的上市药物的代谢清除(natrevdrugdiscov.2005,4(10):825-833)。受遗传因素、非遗传因素和药物相互作用等因素的影响，cyp3a酶的表达量、催化功能和代谢贡献率存在巨大的个体差异，由此导致不同个体使用相同的药物治疗方案后体内药物浓度水平存在巨大的差异，从而产生截然不同的安全性和有效性结局(annurevpharmacoltoxicol.1998,38:389-430)。因此，设计灵敏有效的cyp3a酶活性检测方法是极为迫切的，这对药物开发阶段的药物筛选和药物应用阶段的个体化治疗均具有重要的意义。

人体主要表达三种cyp3a亚型酶，分别为cyp3a4、cyp3a5和cyp3a7，它们的蛋白质序列的一致性超过82%，却呈现出显著不同的底物识别性、代谢反应催化活性和区域选择性(annurevpharmacoltoxicol.1999,39:1-17)。cyp3a4和cyp3a5是成年人体内发挥药物代谢功能的主要cyp3a亚型酶，它们具有高度相似的底物识别性。cyp3a7是新生儿和婴幼儿的主要cyp3a亚型酶：在新生儿期（出生后1周内）cyp3a7约占cyp总表达量的30%，此时cyp3a4的表达量远低于成年人水平；在之后的婴儿期和幼儿期，cyp3a7的表达逐渐下调，而cyp3a4的表达逐渐上调，直到青少年期才发育到成年人的水平(clinpharmacokinet.1999,37(6):485-505)。成年人的cyp3a7表达量通常很低，但cyp3a7*1c基因携带者具有一定程度的表达。有研究表明，cyp3a7*1c基因与多囊卵巢综合症的发病有关(jclinendocrinolmetab.2008,93:2909-12)，与慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌和肺癌化疗失败的结局有关(cancerres.2016,76(6):1485-93)，而且与孕期胎儿发育程度有关(hummolgenet.2018,27(4):742-56)。因此，设计灵敏有效的cyp3a7酶活性检测方法，不仅对于儿科药物的开发和应用具有重要的意义，而且对于cyp3a7有关的代谢性疾病的辅助诊断、孕期胎儿发育和及肿瘤患者化疗预后的评估也潜在重要价值，还可以发展为特异性抑制cyp3a7活性的肿瘤靶向治疗药物的关键筛选技术(biochimbiophysacta.2011,1814(1):161-167)。

cyp3a酶活性的体外评价体系主要包括重组单酶、哺乳动物的亚细胞组分、新鲜分离的肝细胞、肝切片、肝灌流等(toxicolinvitro.2006,20(2):135-53)，其中已商品化的重组细胞色素cyp3a7单酶主要来自于细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌建立的克隆表达体系，而亚细胞组分主要包括微粒体、细胞浆及s9成分。采用这些标准化的评价体系，结合相应的辅因子（如nadph等）和孵育条件，可通过检测探针反应的底物代谢清除速率或产物生成速率，对上述各种体系中表达的cyp3a7酶活性进行表征。

目前，主要采用特异性探针底物及其探针反应来测定cyp3a酶的活性(drugmetabrev.2007,39(4):699-721)。已经发现的或已在体外和体内研究中广泛应用的探针均为cyp3a4和/或cyp3a5的特异性的，如咪达唑仑1'-羟化反应(midazolam1'-hydroxylation)、睾酮6beta-羟化反应(testosterone6beta-hydroxylation)、戈米辛a的8-羟化反应(gomisina8-hydroxylation)、皮质醇6beta-羟化反应(cortisol6beta-hydroxylation)和胆固醇4beta-羟化(cholesterol4beta-hydroxylation)等。有研究认为脱氢表雄酮的16-羟化(dehydroepiandrosterone16alpha-hydroxylation)和睾酮的2alpha-羟化反应(testosterone2alpha-hydroxylation)可以作为cyp3a7的特异性探针反应，但重组单酶测试结果显示这两种探针反应的特异性远未达到实际应用的要求：cyp3a7对脱氢表雄酮16alpha-羟化的催化活性仅为cyp3a4的3.0倍(jpharmacolexpther.2003,307(2):573-82)，cyp3a7对睾酮的2alpha-羟化的催化活性仅为cyp3a4的2.5倍(jpharmacolexpther.2005,314(2):626-635)。综上所述，目前尚无任何用于cyp3a7活性测定的特异性探针反应，而cyp3a7活性测定技术的关键在于选择高特异性的探针反应。

发明人在发明专利（201810543953.0）中公布了去氧胆酸的19-羟化反应是cyp3a7特异性探针反应的研究结果。去氧胆酰甘氨酸(glycodeoxycholicacid,n-(3α,12α-dihydroxy-24-oxocholan-24-yl)glycine)和去氧胆酰牛磺酸(taurodeoxycholicacid,n-(3α,12α-dihydroxy-24-oxocholan-24-yl)taurine)是去氧胆酸分别与甘氨酸或牛磺酸结合的结合型胆汁酸，去氧胆酰甘氨酸和去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应是本发明首次披露的用于检测细胞色素cyp3a7酶的特异性探针反应。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种细胞色素cyp3a7酶的特异性探针反应及其应用，具体为去氧胆酰甘氨酸和去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应是cyp3a7的高特异性探针反应，可用于定量测定不同来源生物样本中cyp3a7酶的活性。与目前文献报道潜在探针反应（脱氢表雄酮的16-羟化反应和睾酮的2alpha-羟化反应）相比，包括cyp3a4、cyp3a5在内的其它已知cyp亚型酶对去氧胆酰甘氨酸和去氧胆酰牛磺酸-19羟化反应完全没有催化活性，该反应可高度特异性地表征cyp3a7酶的活性。

本发明具体提供了一种细胞色素cyp3a7酶的新型特异性探针反应，其特征在于：该探针反应的底物为去氧胆酰甘氨酸或去氧胆酰牛磺酸，其结构如图1中式（1）或（2）所示；该探针反应的产物分别为19-羟基去氧胆酰甘氨酸或19-羟基去氧胆酰牛磺酸，其结构如图1中式（3）或（4）所示。

本发明还提供了所述特异性探针反应用于定量测定体外生物样本中cyp3a7酶活性的方法，采用去氧胆酰甘氨酸或去氧胆酰牛磺酸作为探针反应的底物，通过定量检测单位时间内19-羟化产物的生成量来测定不同来源生物样品及细胞中cyp3a7酶的活性，具体测定方法为：

——体系中以去氧胆酰甘氨酸或去氧胆酰牛磺酸作为反应的底物，底物浓度范围为1-500µm；

——在ph7.4且具有辅因子nadph或其生成体系的孵育体系中，反应温度为10-60ºc之间；

——反应时间为0~720min，确保生成的19-羟基去氧胆酰甘氨酸或19-羟基去氧胆酰牛磺酸达到检测定量限且底物转化率低于20%时终止反应；

——通过检测单位时间内19-羟化产物的生成量，测定反应产物生成速率，实现细胞色素cyp3a7酶活性的检测。

本发明提供的所述特异性探针反应的应用，适用于人体组织器官来源的细胞、微粒体、细胞浆及s9成分等制备物中cyp3a7酶的活性检测，尤其适用于细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌建立的克隆表达体系生产的cyp3a7重组酶的活性标定。

其中检测探针反应产物的样品处理方法包括直接处理法、将产物水解为未结合形式的处理方法（例如使用酸水解）、将产物酶解为未结合形式的处理方法（例如使用胆酰甘氨酸水解酶）。检测方法为紫外吸收光谱、质谱、放射性同位素示踪技术、免疫分析技术、荧光激发光谱、蒸发光散射或电化学光谱检测；所用检测器包括紫外吸收光谱检测器、质谱、放射性同位素示踪技术、蒸发光散射或电化学光谱检测器中的一种或多种串联。

去氧胆酰甘氨酸或去氧胆酰牛磺酸经细胞色素cyp3a7代谢可生成若干羟化代谢产物，根据文献报道的方法合成19-羟基去氧胆酸(chempharmbull.1995,43(9):1551-1557)，结合发明人开发的使用胆酰甘氨酸水解酶将结合型胆汁酸酶解为未结合型胆汁酸的检测方法(analbioanalchem.2018,410(21):5287-5300)，可以确定其中仅有19-羟化反应是cyp3a7的高度特异性探针反应。采用细胞色素cyp重组酶和人肝微粒体孵育体系进行考察，证明去氧胆酰甘氨酸或去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应仅被cyp3a7选择性催化，其余cyp亚型酶包括cyp1a2,cyp1b1,cyp2a6,cyp2b6,cyp2c8,cyp2c9*1,cyp2c18,cyp2c19,cyp2d6*1,cyp3a4,cyp3a5,cyp2e1,cyp2j2,cyp4a11,cyp4f2,cyp4f3b,和cyp4f12均不能催化去氧胆酰甘氨酸或去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应（如图2和图3所示）。通过考察去氧胆酰甘氨酸或去氧胆酰牛磺酸在cyp3a4、cyp3a5和cyp3a7重组酶体系中孵育12小时的过程中19-羟化产物的生成速率曲线，证实在测试时间范围内去氧胆酰甘氨酸或去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应仅被cyp3a7选择性催化，而cyp3a4和cyp3a5无催化活性（如图4和图5所示）。通过考察去氧胆酰甘氨酸（1-300µm）经cyp3a4和cyp3a7重组酶催化的酶反应动力学（如图6所示），证实在测试底物浓度范围内cyp3a4不能催化去氧胆酰甘氨酸的19-羟化反应，而cyp3a7催化的19-羟化反应速率符合经典的米氏动力学方程，最大反应速率（vmax）和米氏常数（km）分别为715.1pmol/min/nmolp450和110.5µm；同样，对于去氧胆酰牛磺酸的酶动力学（如图7所示），在测试底物浓度范围（1-300µm）内cyp3a4不能催化去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应，而cyp3a7催化的19-羟化反应速率符合经典的米氏动力学方程，最大反应速率（vmax）和米氏常数（km）分别为2035pmol/min/nmolp450和151µm。

使用本发明所述的细胞色素cyp3a7特异性探针反应检测细胞色素cyp3a7酶的体外活性具有以下突出优势：(1)高特异性：去氧胆酰甘氨酸或去氧胆酰牛磺酸可被细胞色素cyp3a7高特异性地代谢成为19-羟化产物；(2)底物易得性：去氧胆酰甘氨酸和去氧胆酰牛磺酸来源于各种哺乳动物的胆汁，且含量较高，可直接提取分离也可化学合成。

附图说明

图1为细胞色素cyp3a7催化的去氧胆酰甘氨酸和去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应通路。

图2为去氧胆酰甘氨酸19-羟化反应的人细胞色素cyp重组酶筛选试验结果。

图3为去氧胆酰牛磺酸19-羟化反应的人细胞色素cyp重组酶筛选试验结果。

图4为去氧胆酰甘氨酸（50µm）在细胞色素cyp3a4、cyp3a5和cyp3a7重组酶体系中孵育12小时的过程中19-羟化产物的生成速率曲线。

图5为去氧胆酰牛磺酸（50µm）在细胞色素cyp3a4、cyp3a5和cyp3a7重组酶体系中孵育12小时的过程中19-羟化产物的生成速率曲线。

图6为去氧胆酰甘氨酸19-羟化反应在细胞色素cyp3a4和cyp3a7重组酶体系中的酶动力学曲线。

图7为去氧胆酰牛磺酸19-羟化反应在细胞色素cyp3a4和cyp3a7重组酶体系中的酶动力学曲线。

图8为混合人肝微粒体、细胞色素cyp3a7重组酶、细胞色素cyp3a5重组酶和细胞色素cyp3a4重组酶反应体系中去氧胆酰甘氨酸和19-羟基去氧胆酰甘氨酸经酶解处理为未结合形式后的液相色谱质谱联用检测色谱图。

图9为混合人肝微粒体、细胞色素cyp3a7重组酶、细胞色素cyp3a5重组酶和细胞色素cyp3a4重组酶反应体系中去氧胆酰牛磺酸和19-羟基去氧胆酰牛磺酸经酶解处理为未结合形式后的液相色谱质谱联用检测色谱图。

图10为成年人个体肝微粒体中去氧胆酰甘氨酸的19-羟化反应速率。

图11为成年人个体肝微粒体中去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应速率。

具体实施方式

下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。

实施例1

去氧胆酰甘氨酸19-羟化反应用于筛选非时间依赖性cyp3a7酶抑制剂

购买商业化的成人混合肝微粒体和各cyp酶的非时间依赖性抑制剂，利用去氧胆酰甘氨酸的19-羟化反应测试各抑制剂对cyp3a7酶活性的抑制作用，具体操作流程如下：

（1）100µl体外反应体系中去氧胆酰甘氨酸的反应起始浓度为50µm，含有：10mm的葡萄糖-6-磷酸、1单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、4mm的mgcl2、1mm的nadp+和一定浓度的cyp酶抑制剂（α-萘酚0.1µm、反苯环丙胺0.2µm、舍曲林10µm、孟鲁斯特0.5µm、槲皮素1µm、磺胺苯吡唑1µm、诺卡酮1µm、奎尼丁1µm、二乙基二硫代氨基甲酸酯20µm、氟康唑10µm或酮康唑0.5µm），于37ºc条件下预孵育5分钟；

（2）于反应体系中加入肝微粒体（体系中微粒体蛋白的浓度为0.5mg/ml）起始反应；

（3）反应60分钟后，加入乙腈300µl终止反应；

（4）采用高速冷冻离心机，在12,000*g的条件下离心10分钟；

（5）取离心后的上清液100µl，在40ºc条件下真空离心挥干；

（6）在残渣中加入150μl乙酸钠缓冲溶液（ph5.0，含胆酰甘氨酸水解酶100u），在37ºc下振摇孵育6h，将结合形式的羟化产物酶解为未结合形式；

（7）加入800µl乙腈（含1%甲酸）终止酶解反应；

（8）采用高速冷冻离心机，在12,000*g的条件下离心10分钟；

（9）取离心后的上清液400µl，在40ºc条件下真空离心挥干；

（10）在挥干的残渣中加入60μl乙腈和60μl水，振摇使溶解；

（11）采用uplc-ms/ms检测19-羟基去氧胆酸的生成量，结果表明：其他cyp酶的选择性抑制剂，包括α-萘酚（cyp1a2抑制剂）、反苯环丙胺（cyp2a6抑制剂）、舍曲林（cyp2b6抑制剂）、孟鲁斯特（cyp2c8抑制剂）、槲皮素（cyp2c8抑制剂）、磺胺苯吡唑（cyp2c9抑制剂）、诺卡酮（cyp2c19抑制剂）、奎尼丁（cyp2d6抑制剂）、二乙基二硫代氨基甲酸酯（cyp2e1抑制剂）、氟康唑（cyp2c/3a抑制剂），对去氧胆酰甘氨酸的19-羟化反应无抑制作用；cyp3a抑制剂酮康唑对去氧胆酰甘氨酸的19-羟化反应有显著抑制作用（p<0.05），0.5µm的酮康唑可导致19-羟基产物的生成量降低56%。

实施例2

去氧胆酰牛磺酸19-羟化反应用于筛选非时间依赖性cyp3a7酶抑制剂

购买商业化的成人混合肝微粒体和各cyp酶的非时间依赖性抑制剂，利用去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应测试和筛选各抑制剂对cyp3a7酶活性的抑制作用，具体操作流程如下：

（1）100µl体外反应体系中去氧胆酰牛磺酸的反应起始浓度为50µm，含有：10mm的葡萄糖-6-磷酸、1单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、4mm的mgcl2、1mm的nadp+和一定浓度的cyp酶抑制剂（α-萘酚0.1µm、反苯环丙胺0.2µm、舍曲林10µm、孟鲁斯特0.5µm、槲皮素1µm、磺胺苯吡唑1µm、诺卡酮1µm、奎尼丁1µm、二乙基二硫代氨基甲酸酯20µm、氟康唑10µm或酮康唑0.5µm），于37ºc条件下预孵育5分钟；

（2）于反应体系中加入肝微粒体（体系中微粒体蛋白的浓度为0.5mg/ml）起始反应；

（3）反应60分钟后，加入乙腈300µl终止反应；

（4）采用高速冷冻离心机，在12,000*g的条件下离心10分钟；

（5）取离心后的上清液100µl，在40ºc条件下真空离心挥干；

（6）在残渣中加入150μl乙酸钠缓冲溶液（ph5.0，含胆酰甘氨酸水解酶100u），在37ºc下振摇孵育6h，将结合形式的羟化产物酶解为未结合形式；

（7）加入800µl乙腈（含1%甲酸）终止酶解反应；

（8）采用高速冷冻离心机，在12,000*g的条件下离心10分钟；

（9）取离心后的上清液400µl，在40ºc条件下真空离心挥干；

（10）在挥干的残渣中加入60μl乙腈和60μl水，振摇使溶解；

（11）采用uplc-ms/ms检测19-羟基去氧胆酸的生成量，结果表明：其他cyp酶的选择性抑制剂，包括α-萘酚（cyp1a2抑制剂）、反苯环丙胺（cyp2a6抑制剂）、舍曲林（cyp2b6抑制剂）、孟鲁斯特（cyp2c8抑制剂）、槲皮素（cyp2c8抑制剂）、磺胺苯吡唑（cyp2c9抑制剂）、诺卡酮（cyp2c19抑制剂）、奎尼丁（cyp2d6抑制剂）、二乙基二硫代氨基甲酸酯（cyp2e1抑制剂）、氟康唑（cyp2c/3a抑制剂），对去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应无抑制作用；cyp3a抑制剂酮康唑对去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应有显著抑制作用（p<0.05），0.5µm的酮康唑可导致19-羟化产物的生成量降低53%。

实施例3

去氧胆酰甘氨酸的19-羟化反应用于14例成人个体肝微粒体中cyp3a7酶活性的测定

购买商业化的14例来源于不同成人个体的肝微粒体，利用去氧胆酰甘氨酸的19-羟化反应测定人肝微粒体样本中cyp3a7酶的活性，具体操作流程如下：

（1）100µl体外反应体系中去氧胆酰甘氨酸的反应起始浓度为50µm，含有：10mm的葡萄糖-6-磷酸、1单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、4mm的mgcl2和1mm的nadp+，于37ºc条件下预孵育5分钟；

（2）于反应体系中加入肝微粒体（体系中微粒体蛋白的浓度为0.5mg/ml）起始反应；

（3）反应60分钟后，加入乙腈300µl终止反应；

（4）采用高速冷冻离心机，在12,000*g的条件下离心10分钟；

（5）取离心后的上清液100µl，在40ºc条件下真空离心挥干；

（6）在残渣中加入150μl乙酸钠缓冲溶液（ph5.0，含胆酰甘氨酸水解酶100u），在37ºc下振摇孵育6h，将结合形式的羟化产物酶解为未结合形式；

（7）加入800µl乙腈（含1%甲酸）终止酶解反应；

（8）采用高速冷冻离心机，在12,000*g的条件下离心10分钟；

（9）取离心后的上清液400µl，在40ºc条件下真空离心挥干；

（10）在挥干的残渣中加入60μl乙腈和60μl水，振摇使溶解；

（11）采用uplc-ms/ms检测19-羟基去氧胆酸的生成量，结果表明，利用去氧胆酰甘氨酸的19-羟化反应作为探针，测得不同来源的成人个体肝微粒体中19-羟化产物的生成速率具有显著差异（图10），最高活性和最低活性差距达262.1倍。

实施例4

去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应用于14例成人个体肝微粒体中cyp3a7酶活性的测定

购买商业化的14例来源于不同成人个体的肝微粒体，利用去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应测定人肝微粒体样本中cyp3a7酶的活性，具体操作流程如下：

（1）100µl体外反应体系中去氧胆酰牛磺酸的反应起始浓度为50µm，含有：10mm的葡萄糖-6-磷酸、1单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、4mm的mgcl2和1mm的nadp+，于37ºc条件下预孵育5分钟；

（2）于反应体系中加入肝微粒体（体系中微粒体蛋白的浓度为0.5mg/ml）起始反应；

（3）反应60分钟后，加入乙腈300µl终止反应；

（4）采用高速冷冻离心机，在12,000*g的条件下离心10分钟；

（5）取离心后的上清液100µl，在40ºc条件下真空离心挥干；

（6）在残渣中加入150μl乙酸钠缓冲溶液（ph5.0，含胆酰甘氨酸水解酶100u），在37ºc下振摇孵育6h，将结合形式的羟化产物酶解为未结合形式；

（7）加入800µl乙腈（含1%甲酸）终止酶解反应；

（8）采用高速冷冻离心机，在12,000*g的条件下离心10分钟；

（9）取离心后的上清液400µl，在40ºc条件下真空离心挥干；

（10）在挥干的残渣中加入60μl乙腈和60μl水，振摇使溶解；

（11）采用uplc-ms/ms检测19-羟基去氧胆酸的生成量，结果表明，利用去氧胆酰牛磺酸的19-羟化反应作为探针，测得不同来源的成人个体肝微粒体中19-羟化产物的生成速率具有显著差异（图11），最高活性和最低活性差距达270.6倍。