简易测定微生物菌剂中生物量的方法与流程

本发明涉及一种简易测定微生物菌剂中生物量的方法，属于微生物菌剂制备领域。

背景技术：

生物强化技术是向废水处理系统中投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因组合技术产生的高效菌种，强化去除某一种或某一类有害物质的方法。该处理技术可有效改善传统生物处理法的处理效果，近年来在各行业都得到了广泛的应用。微生物菌剂主要分为三类：第一类为单株细菌的微生物菌剂，即单一微生物菌剂(如中国专利号201410774238.x,申请日为2014年12月16日，发明创造名称为一株降解含酯键农药的铜绿假单胞菌菌株)；第二类为由多种细菌组成的微生物菌剂，即复合微生物菌剂(如中国专利申请号02156977.0，申请日为2002年12月24日，发明创造名称为一种低温硝化菌剂及其用途)；第三类为高富集微生物菌剂(如中国专利申请号201310296780.4，申请日为2013年07月15日，发明创造名称为一种耐低温自养硝化菌剂的富集及其在废水处理中的应用)。

生物量是微生物菌剂产品质量优劣的重要参数之一，但是目前国内微生物菌剂市场中的产品很少有其生物量的信息，导致菌剂市场中以次充好的情况常有发生，造成市场秩序混乱。上述情况发生的主要原因是由于没有合适的微生物菌剂生物量测定方法。微生物生物量的测定通常为活菌计数法，但由于微生物菌剂不同批次所生产的产品有较大差异，该方法虽然较为准确，但是因其操作繁琐，耗时较长并不适合作为微生物菌剂生物量测定方法。为了促进国内微生物菌剂市场的健康有序发展，提供一种简易微生物菌剂中生物量的方法十分必要。

技术实现要素：

为克服上述缺陷，本发明的目的在于提供一种操作简单、耗时短暂、结果直观可信的简易测定微生物菌剂种生物量的方法。此方法，可应用于各类微生物菌剂。

为了解决上述问题，本发明简易测定方法具体测定步骤为：

(1)取待测样品分成若干等份分别进行培养；

(2)每隔一预定时间段取出其中一个培养后的样品，置于4℃下保存；

(3)培养完毕，测定各份样品在600nm处的吸光度(即od值)；

(4)提取并测定各份样品的总蛋白质的浓度；

(5)建立总蛋白质浓度与od值的线性回归方程；

(6)测定各份样品中的生物量，建立od值与测定的生物量的线性回归方程；

(7)将总蛋白质浓度代入总蛋白质浓度与od值的线性回归方程以及od值与细菌数的线性回归方程中，计算出该菌剂细菌数。

其中，步骤4中，的总蛋白质的浓度是利用bca蛋白测定试剂盒测定的。

其中，所述的步骤2中，每份样品中微生物菌剂为10～100ul或10～100mg，培养温度为25～37℃，预定时间段的长度为1～4h。

进一步地，所述的测定的微生物菌剂类型包括单一微生物菌剂、复合微生物菌剂、高富集微生物菌剂等三种，可测定的微生物菌剂形态包括液态和固态。

更进一步地，第(7)步中的od值与细菌数的线性回归方程以实验测定最佳，但是也可以参考相关文献报道。

有益效果

本发明提供了一种简易测定微生物菌剂种生物量的方法，具有以下有有益效果：

(1)本发明方法操作简单、耗时短暂、结果直观可信，可应用于各类微生物菌剂。

(2)本发明所述方法可让需方快速分辨微生物菌剂品质，减少菌剂市场中滥竽充数的现象，有效规范市场。

附图说明

图1铜绿假单胞菌总蛋白质浓度与od值之间的关系

图2耐低温硝化菌剂总蛋白质浓度与od值之间的关系

图3磷霉素降解菌剂总蛋白质浓度与od值之间的关系

图4耐盐cod降解菌剂蛋白质浓度与od值之间的关系

图5硝化菌剂总蛋白质浓度与od值之间的关系

图6除油菌剂总蛋白质浓度与od值之间的关系

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述。

本发明简易测定方法具体测定步骤为：

(1)取待测样品分成若干等份分别进行培养；

(2)每隔一预定时间段取出其中一个培养后的样品，置于4℃下保存；

(3)全部培养完毕后，测定各份样品在600nm处的吸光度(即od值)；

(4)提取各份样品的总蛋白质并进行测定；

(5)建立总蛋白质浓度与od值的线性回归方程；

(6)测定各份样品中的生物量，建立od值与测定的生物量的线性回归方程；

(7)将总蛋白质浓度代入总蛋白质浓度与od值的线性回归方程以及od值与细菌数的线性回归方程中，计算出该菌剂细菌数。

其中，步骤4中，的总蛋白质的浓度可利用bca蛋白测定试剂盒测定的。

其中，所述的步骤2中，每份样品中微生物菌剂为10～100ul(液态)或10～100mg(固态)，培养温度为25～37℃，预定时间段的长度为1～4h。上述的测定的微生物菌剂类型包括单一微生物菌剂、复合微生物菌剂、高富集微生物菌剂等三种，可测定的微生物菌剂形态包括液态和固态。第(7)步中的od值与细菌数的线性回归方程以实验测定最佳，但是也可以参考相关文献报道。

实施例1：

某苯酚降解菌剂生物量简易测定

某苯酚降解菌剂中的菌种为铜绿假单胞菌，其生物量测定步骤如下：

(1)取6个灭菌干燥的50ml离心管，向离心管中加入20mlmh肉汤培养液。

(2)取100ul苯酚降解菌剂分别加入6个离心管中，将离心管置于37℃下培养6h，每隔1h取出其中一个离心管，置于4℃下保存。

(3)培养6h后，测定各离心管中菌剂在600nm处的od值。

(4)提取6个离心管里菌剂中微生物的总蛋白质，并使用bca蛋白测定试剂盒测定提取总蛋白质的浓度。

(5)建立od值与总蛋白质浓度的线性回归方程，结果为y1＝987.39x1-9.6247；其中x1为od值；y1为总蛋白质浓度。

(6)查阅参考文献，铜绿假单胞菌标准浓度(cfu/ml)与od值之间的回归方程为：y2＝5.11x2+0.5018；其中x2为od值；y2为菌液标准浓度(单位为10⁸cfu/ml)。

(7)提取1ml待测苯酚降解菌剂的总蛋白质，并进行测定，总蛋白质浓度为862.14mg/l。

(8)将测定的总蛋白质浓度带入相关线性方程，最终得到待测苯酚降解菌剂的生物量为5.01×10⁸cfu/ml。

实施例2：

某耐低温硝化菌剂生物量简易测定

某耐低温硝化菌剂由汉堡硝化杆菌、维氏硝化杆菌和nitrobactervulgaris组成，其生物量测定步骤如下：

(1)取6个灭菌干燥的50ml离心管，向离心管中加入20ml培养液，培养液包括硫酸铵(2g/l)、亚硝酸钠(1g/l)、磷酸二氢钠(0.25g/l)、磷酸氢二钾(0.75g/l)，硫酸锰(0.01g/l)，硫酸镁(0.03g/l)，碳酸钙(5g/l)。

(2)取50ul耐低温硝化菌剂分别加入6个离心管中，将离心管置于25℃下培养24h，每隔4h取出其中一个离心管，置于4℃下保存。

(3)培养24h后，测定各离心管中菌剂在600nm处的od值。

(4)提取6个离心管里菌剂中微生物的总蛋白质，并使用bca蛋白测定试剂盒测定提取总蛋白质的浓度。

(5)建立od值与蛋白质浓度的线性回归方程，结果为y1＝1017.5x1-18.47；其中x1为od值；y1为总蛋白质浓度。

(6)使用平板计数法测定6个离心管里菌剂中细菌数，建立od值与细菌数的线性回归方程：y2＝8.41x2+0.2726；其中x2为od值；y2为菌液标准浓度(单位为10⁸cfu/ml)。

(7)提取2ml待测耐低温硝化菌剂的总蛋白质，并进行测定，总蛋白质浓度为942.38mg/l。

(8)将测定的总蛋白质浓度带入相关线性方程，最终得到待测耐低温硝化菌剂的生物量为4.11×10⁸cfu/ml。

实施例3：

某磷霉素降解菌剂生物量简易测定

某磷霉素降解菌剂由磷霉素抗生素制药废水污水处理厂的活性污泥为磷霉素降解土著菌的菌源，不断驯化富集得到，其生物量测定步骤如下：

(1)取6个灭菌干燥的50ml离心管，向离心管中加入20mllb培养液。

(2)取10ul耐低温硝化菌剂分别加入6个离心管中，将离心管置于30℃下培养12h，每隔2h取出其中一个离心管，置于4℃下保存。

(3)培养12h后，测定各离心管中菌剂在600nm处的od值。

(4)提取6个离心管里菌剂中微生物的总蛋白质，并使用bca蛋白测定试剂盒测定提取总蛋白质的浓度。

(5)建立od值与蛋白质浓度的线性回归方程，结果为y1＝1252.3x1-27.452；其中x1为od值；y1为总蛋白质浓度。

(6)使用平板计数法测定6个离心管里菌剂中细菌数，建立od值与细菌数的线性回归方程：y2＝3.39x2+0.294；其中x2为od值；y2为菌液标准浓度(单位为10⁸cfu/ml)。

(7)提取1ml待测磷霉素降解菌剂的总蛋白质，并进行测定，总蛋白质浓度为1482.38mg/l。

(8)将测定的总蛋白质浓度带入相关线性方程，最终得到待测磷霉素降解菌剂的生物量为4.38×10⁸cfu/ml。

实施例4：

某耐盐cod降解菌剂生物量简易测定

某耐盐cod降解菌剂的菌种为芽孢杆菌，其生物量测定步骤如下：

(1)取6个灭菌干燥的50ml离心管，向离心管中加入20ml培养液，培养液包括蔗糖(10g/l)、蛋白胨(10g/l)、氯化钠(10g/l)、磷酸氢二钾(0.75g/l)。

(2)取10mg耐盐cod降解菌剂分别加入6个离心管中，将离心管置于32℃下培养12h，每隔2h取出其中一个离心管，置于4℃下保存。

(3)培养12h后，测定各离心管中菌剂在600nm处的od值。

(4)提取6个离心管里菌剂中微生物的总蛋白质，并使用bca蛋白测定试剂盒测定提取总蛋白质的浓度。

(5)建立od值与蛋白质浓度的线性回归方程，结果为y1＝920.18x1-17.536；其中x1为od值；y1为总蛋白质浓度。

(6)查阅参考文献，芽孢杆菌标准浓度(cfu/ml)与od值之间的回归方程为：y＝3.24x+0.51；其中x为od值；y为菌液标准浓度(单位为10⁸cfu/ml)。

(7)提取20mg待测耐盐cod降解菌剂的总蛋白质，并进行测定，总蛋白质浓度为1154.62mg/l。

(8)将测定的总蛋白质浓度带入相关线性方程，最终得到待测耐盐cod降解菌剂生物量为2.32×10¹⁰cfu/g。

实施例5：

某硝化菌剂简易测定

某硝化菌剂的菌种由亚硝化单胞菌和硝化杆菌组成，其生物量测定步骤如下：

(1)取6个灭菌干燥的50ml离心管，向离心管中加入20ml培养液，培养液包括葡萄糖(0.2g/l)、氯化铵(0.8g/l)、碳酸氢钠(2.4g/l)、磷酸氢二钾(0.1g/l)。

(2)取100mg硝化菌剂分别加入6个离心管中，将离心管置于32℃下培养24h，每隔4h取出其中一个离心管，置于4℃下保存。

(3)培养24h后，测定各离心管中菌剂在600nm处的od值。

(4)提取6个离心管里菌剂中微生物的总蛋白质，并使用bca蛋白测定试剂盒测定提取总蛋白质的浓度。

(5)建立od值与蛋白质浓度的线性回归方程，结果为y1＝1052.6x1-14.93；其中x1为od值；y1为总蛋白质浓度。

(6)使用平板计数法测定6个离心管里菌剂中细菌数，建立od值与细菌数的线性回归方程：y＝2.75x+0.722；其中x为od值；y为菌液标准浓度(单位为10⁸cfu/ml)。

(7)提取100mg待测硝化菌剂的总蛋白质，并进行测定，蛋白质浓度为1526.37mg/l。

(8)将测定的蛋白质浓度带入相关线性方程，最终得到待测硝化菌剂标准浓度为4.75×10⁹cfu/g。

实施例6：

某除油菌剂简易测定

某除油菌剂的菌种由芽孢杆菌、酵母菌属和微球菌属组成，其生物量测定步骤如下：

(1)取6个灭菌干燥的50ml离心管，向离心管中加入20mllb培养液。

(2)取50mg除油菌剂分别加入6个离心管中，将离心管置于28℃下培养6h，每隔1h取出其中一个离心管，置于4℃下保存。

(3)培养6h后，测定各离心管中菌剂在600nm处的od值。

(4)提取6个离心管里菌剂中微生物的总蛋白质，并使用bca蛋白测定试剂盒测定提取总蛋白质的浓度。

(5)建立od值与蛋白质浓度的线性回归方程，结果为y1＝963.44x1-11.842；其中x1为od值；y1为总蛋白质浓度。

(6)使用平板计数法测定6个离心管里菌剂中细菌数，建立od值与细菌数的线性回归方程：y＝5.24x+0.251；其中x为od值；y为菌液标准浓度(单位为10⁸cfu/ml)。

(7)提取10mg待测除油菌剂的总蛋白质，并进行测定，总蛋白质浓度为1321.58mg/l。

(8)将测定的总蛋白质浓度带入相关线性方程，最终得到待测除油菌剂生物量为7.5×10¹⁰cfu/g。