本发明属于天然产物分离技术领域，具体涉及一种使用白骨壤果实制备苯乙醇苷的方法及应用。
背景技术
白骨壤为马鞭草科白骨壤属真红树植物，为我国分布面积最大的重要红树植物种类之一，主要分布在广东、广西、台湾、海南、福建等沿海地区。白骨壤果实可食用，在我国亚热带沿海地区属于时令食品。随着对白骨壤果实的研究增加，学者研究发现白骨壤果实中含有多种活性物质如生物碱、多酚类化合物和苯乙醇苷等。
苯乙醇苷为糖苷类化合物，在植物界分布广泛。大量研究表明，苯乙醇苷具有显著的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎和改善记忆力等药理活性。苯乙醇苷由于其广泛的药理活性得到了研究学者们越来越多的重视，随着新研究的增多，人们对苯乙醇苷的认识逐渐深入，有望成为一种新的抗菌、提高免疫力、改善痴呆的药物，具有重大的研究价值
中国专利cn201610049397.2公布了一种从小蓟中提取的苯乙醇苷类化合物及其制备方法和用途，选取小蓟作为研究对象，采用现代提取分离技术，从小蓟中分离纯化获得一种新的苯乙醇苷化合物，但该方法提取分离过程复杂，工业化生产困难，且该方法中大量使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇有机溶剂，存在有机溶剂毒副作用大和用量大等不足；cn03119204.1公布了一种来源于管花肉苁蓉的含有苯乙醇苷的制剂及其制备方法和用途，制备获得了一种包含10～50％松果菊苷及1～15％类叶生麻苷的苯乙醇苷制剂，该方法使用水、乙醇、甲醇作为提取试剂，减少了其他有机毒性试剂的使用，但提取得率不稳定。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种使用白骨壤果实制备苯乙醇苷的方法及应用。该方法简单方便，提取效率高且稳定，所得苯乙醇苷含量可达到70～90％，工艺流程安全环保，适合大规模生产，所得提取物抗氧化活性显著，并具有显著的辅助改善记忆作用，可作为主要成分或之一，应用于相关功能食品、药品中。
本发明的技术方案如下：
(1)原料前处理：将新鲜白骨壤果实烘干表面水分或干燥的白骨壤果实使用粉碎机进行粉碎，过40～80目工业用筛，得白骨壤果实粗粉备用；
(2)提取：白骨壤果实粗粉中加入表面活性剂搅拌均匀，然后加入原料重量的1～3倍体积的酸性水溶液，30℃下超声波处理1～2h，超声波处理后加入乙醇使提取溶液中乙醇浓度为50％～75％，继续超声波提取1～5h，真空抽滤，收集提取液；提取2～4次，合并提取液；提取液减压浓缩至体积减少一半，得浓缩液；
(3)除杂：浓缩液中加入复合絮凝剂，30～40℃条件下搅拌均匀，室温静置5h，然后在25℃、转速10000r/min的条件下离心5min，收集上清液，得制备液a；
(4)反相硅胶纯化：将制备液a通过填充有反相硅胶的减压层析柱，然后用20％～40％乙醇溶液以2～7ml/min的洗脱流速进行洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液减压浓缩，真空干燥后即为苯乙醇苷提取物。
作为本发明的进一步说明，步骤(2)中表面活性剂为吐温-80、吐温-20、吐温-60、吐温-40中的一种或几种。
作为本发明的进一步说明，表面活性剂加入量为白骨壤果实粗粉重量的0.20％～0.80％。
作为本发明的进一步说明，步骤(2)中酸性水溶液为含有磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵中的一种或几种，稀硫酸调节ph为3～5。
作为本发明的进一步说明，步骤(3)中的复合絮凝剂为壳聚糖与聚乙烯吡咯烷酮混合。
作为本发明的进一步说明，复合絮凝剂加入比例为壳聚糖：聚乙烯吡咯烷酮＝(3.50％～4.50％)：(0.50％-0.25％)。
作为本发明的进一步说明，步骤(4)中反相硅胶为c8、c18、c4中的一种。
研究表明，糖苷类化合物在非酸性条件和高温条件下稳定性差，苯乙醇苷为糖苷类化合物，其结构中主要组成部分为咖啡酸、苯乙醇苷元和糖基，其降解规律符合一级动力学模型，在中性、碱性和高温的条件下易发生水解和氧化生成苷元酪醇、咖啡酸等，降低其纯度以及生物活性。在提取中，采用酸性水溶液进行提取，使提取体系中的ph维持在酸性条件下，可以提高苯乙醇苷化合物的稳定性，减少苯乙醇苷的水解和氧化，从而提高苯乙醇苷的含量。
在酸性溶液中，吐温类表面活性剂的性能不受影响。吐温为非离子型表面活性剂，其具有无毒、无刺激性的优点，在溶液中不电解，稳定性强，不易受强电解质无机盐类存在的影响，也不易受ph值的影响。在提取苯乙醇苷时加入吐温型非离子型表面活性剂，使原料与溶剂的表面张力降低，溶剂容易渗透入原料细胞组织内，有效成分的渗出更加充分。加入表面活性剂可以减少原料粉碎次数，从而减少苯乙醇苷由于粉碎受到瞬时高温的作用而分解氧化的次数，减少提取次数和提取时间，减少有机试剂的使用，降低提取成本。
壳聚糖是一种天然高分子化合物，属于碳水化合物中的直链多糖，在酸性溶液中溶解度增大。壳聚糖分子链上分布着大量的游离氨基，在稀酸溶液中质子化，从而使壳聚糖分子链上带上大量的正电荷，成为一种阳离子聚电解质，可吸附溶液中带负电荷的成分，如蛋白质、树胶、鞣质、单宁等。聚乙烯吡咯烷酮是一种非离子型水溶性高分子化合物，具有优异的溶解性能和生理相容性，作为絮凝沉淀剂或澄清剂，其能与单宁、单宁酸、花色苷络合，形成沉淀。其中聚乙烯吡咯烷酮形成其链和吡络烷酮环上的甲基是非极性基团，具有亲油性，分子中的内酰胺是强极性基团，具有亲水和极性基团作用，在酸性条件下由于氢键作用两者交联形成多孔结构，壳聚糖在水中的溶解性增加，吸附能力增加，絮凝效果增加。
本发明的优点：
本发明在对苯乙醇苷的结构进行充分了解下，首先采用表面活性剂结合酸性水溶液提取，获得稳定的苯乙醇苷化合物，并利用复合絮凝剂在酸性条件下絮凝效果更优的特点，代替有机溶剂的使用，更有效除去提取液中的杂质，减少了有机试剂的使用，克服了现有技术的缺陷。本发明简单易行，苯乙醇苷提取率稳定，适合于工业化生产，有较大的应用价值。
经初步活性试验表明，白骨壤果实苯乙醇苷提取物具有一定的抗氧化及辅助改善记忆力作用，可应用与相关功能食品、药品中，具有很好的开发应用前景。
具体实施方式
实施例1：
(1)原料前处理：将10kg新鲜白骨壤果实控干表面水分后用粉碎机粉碎，过50目筛，得白骨壤果实粗粉备用；
(2)提取：白骨壤果实粗粉中加入粗粉重量0.25％的吐温-80，加入2倍体积即20l的ph3.8的磷酸二氢钾和硫酸铵水溶液,30℃下超声波处理1h，超声波处理后加入乙醇使溶液中乙醇浓度为55％，继续超声波提取2h，真空抽滤，收集提取液；提取2次，合并提取液液；减压浓缩至提取液体积减少一半，得浓缩液；
(3)除杂：浓缩液中加入3.50％壳聚糖与5.00％聚乙烯吡咯烷酮，40℃条件下搅拌均匀，静置5h，然后在25℃、10000r/min条件下离心5min，收集上清液，得制备液a；
(4)反相硅胶纯化：将制备液a通过填充有c18反相硅胶的减压层析柱，用40％乙醇溶液以6ml/min的洗脱流速进行洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液减压浓缩，真空干燥得到苯乙醇苷粉末1，hplc检测得苯乙醇苷含量为85.27％。
实施例2：
(1)原料前处理：将5kg干燥的白骨壤果实用粉碎机粉碎，过80目筛，得白骨壤果实粗粉备用；
(2)提取：白骨壤果实粗粉中加入粗粉重量0.3％的吐温-20，加入2倍体积即10l的ph3.5的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶液在30℃下超声波处理2h，超声波处理后加入乙醇使溶液中乙醇浓度为75％，继续超声波提取2h，真空抽滤，收集提取液；提取3次，合并提取液；提取液减压浓缩至体积减少一半得浓缩液；
(3)除杂：浓缩液中加入3.6％壳聚糖与2.5％聚乙烯吡咯烷酮，35℃条件下搅拌均匀，静置5h，25℃、10000r/min离心5min，收集上清液，得制备液a；
(4)反相硅胶纯化：将制备液a通过填充有c18反相硅胶的减压层析柱，用40％乙醇溶液以4ml/min的洗脱流速进行洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液减压浓缩，真空干燥得到苯乙醇苷粉末2，hplc检测得苯乙醇苷含量为79.89％。
实施例3：
(1)原料前处理：将10kg干燥的白骨壤果实用粉碎机粉碎，过80目筛，得白骨壤果实粗粉备用；
(2)提取：白骨壤果实粗粉中加入粗粉重量0.5％的吐温-80和0.2％吐温-40，加入1倍体积即10l的ph4.5的硫酸铵水溶液在30℃下超声波处理1h，超声波处理后加入乙醇使溶液中乙醇浓度为65％，继续超声波提取3h，真空抽滤，收集提取液；提取4次，合并提取液；提取液减压浓缩至体积减少一半得浓缩液；
(3)除杂：浓缩液中加入4.00％壳聚糖与0.25％聚乙烯吡咯烷酮，40℃条件下搅拌均匀，静置5h，25℃、10000r/min离心5min，取上清液，得制备液a；
(4)反相硅胶纯化：将制备液a通过填充有c8反相硅胶的减压层析柱，用30％乙醇溶液以2ml/min的洗脱流速进行洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥得到苯乙醇苷粉末3，hplc检测得苯乙醇苷含量为89.51％。
实施例4：
(1)原料前处理：将5kg新鲜白骨壤果实烘干表面水分后用粉碎机粉碎，过40目筛，得白骨壤果实粗粉备用；
(2)提取：白骨壤果实粗粉中加入0.75％吐温-60和0.05％吐温-40，加入3倍体积即15l的ph4.5的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠水溶液在30℃下超声波处理2h，超声波处理后加入乙醇使溶液中乙醇浓度为70％，继续超声波提取2h，真空抽滤，收集提取液；提取4次，合并提取液液；提取液减压浓缩至体积减少一半得浓缩液；
(3)除杂：浓缩液中加入4.5％壳聚糖与3.5％聚乙烯吡咯烷酮，30℃加热搅拌均匀，静置5h，25℃、10000r/min离心5min，收集上清液，得制备液a；
(4)反相硅胶纯化：将制备液a通过填充有c4反相硅胶的减压层析柱，用35％乙醇溶液以7ml/min的洗脱流速进行洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液减压浓缩，真空干燥得到苯乙醇苷粉末4，hplc检测得苯乙醇苷含量为71.46％。
实施例5：
(1)原料前处理：将10kg新鲜白骨壤果实烘干表面水分后用粉碎机粉碎，过40目筛，得白骨壤果实粗粉备用；
(2)提取：白骨壤果实粗粉中加入粗粉重量0.4％的吐温-20和0.4％吐温-80，加入3倍体积即30l的ph5.0的硫酸铵和磷酸二氢钠水溶液在30℃下超声波处理1h，超声波处理后加入乙醇使溶液中乙醇浓度为60％，继续超声波提取1h，真空抽滤，收集提取液；提取2次，合并提取液液；提取液减压浓缩至体积减少一半得浓缩液；
(3)除杂：浓缩液中加入3.80％壳聚糖与3.00％聚乙烯吡咯烷酮，40℃条件下搅拌均匀，静置5h，25℃、10000r/min离心5min，收集上清液，得制备液a；
(4)反相硅胶纯化：将制备液a通过填充有c4反相硅胶的减压层析柱，用25％乙醇溶液以5ml/min的洗脱流速进行洗脱，收集乙醇洗脱液，洗脱液减压浓缩，真空干燥得到苯乙醇苷粉末5，hplc检测得苯乙醇苷含量为78.12％。
实施例6：
抗氧化试验：
(1)试验材料
苯乙醇苷提取物：实施例1、2、3中制备所得苯乙醇苷粉末1、2、3，苯乙醇苷含量分别为85.27％、79.89％、89.51％；4月龄雄性spf级昆明小鼠(青年小鼠)，15月龄雄性spf级昆明小鼠(老龄小鼠)，广西医科大学动物实验中心提供。
(2)方法
将青年小鼠设为对照组，老龄小鼠随机分成5组，即模型组、阳性组(维生素c)、实验1组(苯乙醇苷粉末1)、实验2组(苯乙醇苷粉末2)、实验3组(苯乙醇苷粉末3)，每组12只小鼠。其中模型组与对照组小鼠每天灌胃生理盐水，1ml/kg/d，阳性组小鼠灌胃维生素c水溶液，100mg/kg/d，实验1、2、3组分别灌胃苯乙醇苷粉末1、2、3水溶液,100mg/kg/d，灌胃30天。
(3)试验结果
研究发现，白骨壤果实中苯乙醇苷提取物对老龄小鼠具有显著的抗氧化作用，能降低过氧化脂质含量，增加抗氧化酶活力。
实验结果(见表1)：与对照组相比，模型组小鼠血清中mda含量显著增加(p＜0.01)，实验1、2、3组能显著降低老龄小鼠血清中mda含量(p＜0.01)，减少老龄小鼠血清中过氧化脂质生成。与对照组相比，模型组小鼠血清中超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)活力显著降低(p＜0.01)，实验1、2、3组能显著增加老龄小鼠血清中sod、gsh0px酶活力(p＜0.01)，提高老龄小鼠的抗氧化能力。
表1白骨壤果实中苯乙醇苷提取物对老龄小鼠抗氧化能力的影响(
注：##p＜0.01，与对照组相比；*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组相比。
实施例7：
辅助改善记忆试验：
(1)试验材料
苯乙醇苷提取物：实施例2、4、5中制备所得苯乙醇苷粉末2、4、5，苯乙醇苷含量分别为79.89％、71.46％、78.12％；6月龄雄性spf级昆明小鼠，18±2g，，广西医科大学动物实验中心提供。
(2)动物分组及给药
将昆明小鼠随机分成6组，即正常对照组、模型组、阳性组(吡拉西坦，250mg/kg/d)、实验1组(苯乙醇苷粉末2，250mg/kg/d)、实验2组(苯乙醇苷粉末4,250mg/kg/d)、实验3组(苯乙醇苷粉末5,250mg/kg/d)，每组12只小鼠。实验前连续灌胃给药2周，其中正常对照组和模型组分别给予等量的生理盐水。第14天时除正常对照组外，其余组别小鼠均腹腔注射东莨菪碱2mg/kg，20min后进行实验。
(3)试验方法
跳台实验：腹腔注射东莨菪碱20min后将动物放入反应箱适应环境3min，然后立即通以36v连续电流刺激5min，小鼠受到电击后正常逃避反应是跳回平台，多数动物可能再次或多次跳到铜栅上，受到电击又迅速跳回到平台上。训练5min，24h后重复测验。记录这两天小鼠第一次跳下平台的时间(潜伏期)以及5min内小鼠跳下平台受到电击的次数(错误次数)。
避暗实验：腹腔注射东莨菪碱20min后将小鼠头部背向洞口放入明室，同时开始计时，动物穿过洞口进入暗室受到电击时计时器记录的时间即为潜伏期。24h后重做测试，记录潜伏期和5min内受到电击次数即错误次数。
morris水迷宫实验：腹腔注射东莨菪碱20min后将小鼠放入水迷宫中，通过摄像头跟踪记录每只小鼠的游泳情况，连续4d，记录第四天小鼠在120s内爬上平台的时间即逃避潜伏期。第五天将平台撤去，记录每只小鼠经过原平台的次数。
(4)统计学处理
实验结果采用spss20.0软件进行统计处理，所有数据均用平均值±标准差
(5)试验结果
①跳台实验结果
实验结果(见表2)：与空白对照组相比，模型组小鼠的潜伏期显著降低(p＜0.01)，表面模型组小鼠的记忆能力降低，模型建立成功，白骨壤果实苯乙醇苷提取物能有效提高记忆障碍小鼠跳台实验的潜伏期和减少错误次数(p＜0.05)，提高记忆障碍小鼠的记忆能力。
表2跳台实验结果(
注：##p＜0.01，与对照组相比；*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组相比。
②避暗实验结果
实验结果(见表3)：与空白对照组相比，模型组小鼠的潜伏期显著降低(p＜0.01)，错误次数增加(p＜0.05)，模型组小鼠的记忆能力下降，实验1、2、3组能有效提高记忆障碍小鼠跳避暗实验的潜伏期和减少错误次数(p＜0.05)，改善记忆障碍小鼠的记忆能力。
表3避暗实验结果(
注：##p＜0.01，与对照组相比；*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组相比。
③morris水迷宫实验结果
实验结果(见表4)：与空白对照组相比，模型组小鼠的逃避潜伏期显著延长(p＜0.01)，穿过平台的次数减少(p＜0.01)，模型组小鼠的学习记忆能力下降，实验1、2、3组能有效缩短记忆障碍小鼠水迷宫实验的逃避潜伏期，并增加平台穿越次数(p＜0.05)，提高小鼠的学习与记忆能力。
表4morris水迷宫实验结果(
注：##p＜0.01，与对照组相比；*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组相比。