一种以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶及其制备方法和高通量应用与流程

本发明属于酶固定化技术领域，具体是一种以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶及其制备方法和高通量应用。

背景技术：

酶是一类生物催化剂，因其催化反应具有专一性强、条件温和、催化效率高等特点，被广泛地应用于诸多领域。游离酶的催化反应虽然操作简单方便，但其酸碱稳定性和热稳定性较差，在有机溶剂中易丧失活性，且不可实现其于反应体系中的回收复用，加之酶的价格比较昂贵，这些缺陷都限制了其工业化应用。酶固定化技术是通过物理或化学方法，将酶分子束缚于载体上的一种技术，所得固定化酶可以克服游离酶存在的不足，从而拓宽其工业应用。

酶固定化载体是固定化酶的关键组成部分，其性质对固定化酶的活性及性能有非常重要的影响。为了提高分析速率，酶固定化载体应易于分离。一般载体固定化酶需要通过离心或过滤实现固定化酶与反应体系的分离，不易控制平行的酶促反应。磁性材料由于其在外加磁场作用下易于分离的特性，被广泛地用于酶的固定，但是由于磁性材料固定化酶易于团聚，在酶促反应过程中会掩盖活性位点，从而影响酶活性。纤维素滤纸无需制备、绿色环保、成本低廉，但是，纤维素滤纸表面没有可以进行酶分子固定的活性基团，需要对其进行改性，而壳聚糖富含氨基，常被用作酶固定化载体改性剂。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服上述已有技术的缺陷，提供一种固定化酶与反应体系可即时分离、固定化酶可重复使用、酶利用率高的以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶。

本发明的另一目的是提供上述以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶的制备方法。

本发明最后一个目的是提供上述以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶的高通量应用。

一、以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶

本发明一种以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶，包括α-葡萄糖苷酶和酶固定化载体壳聚糖修饰纤维素滤纸，α-葡萄糖苷酶和壳聚糖修饰纤维素滤纸通过席夫碱反应以亚胺键进行共价结合；其中，壳聚糖修饰纤维素滤纸为将洁净的纤维素滤纸浸没于质量浓度为0.1~5%的壳聚糖醋酸溶液中，于室温下静置12小时，然后用超纯水漂洗至滤纸表面残余液体为中性，最后，将滤纸于30~40℃下干燥得到。

上述醋酸的体积分数为1.0%，不会对纤维素滤纸造成腐蚀，且方便后续清洗步骤。

上述纤维素滤纸为实验室用于过滤的定性滤纸或定量滤纸。

二、以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶的制备方法

本发明一种以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）将所述壳聚糖修饰纤维素滤纸浸没于质量浓度为2.5~20%的戊二醛溶液中，密封，置于35~45℃恒温振荡器中，反应1~7小时后取出，先用超纯水洗涤，以去除未反应的戊二醛，然后用浓度为10~30mmol/l、ph值为6.0~8.0的磷酸盐缓冲液进行洗涤，最后用纤维素滤纸将其表面残余液体吸干；

（2）将经步骤（1）处理后的壳聚糖修饰纤维素滤纸浸没于质量浓度为0.5~2.5mg/ml的α-葡萄糖苷酶溶液中，密封，置于30~40℃恒温振荡器中，反应1~6小时后取出，用10~30mmol/l、ph值为3.5~4.5的磷酸盐缓冲液进行洗涤，以去除固定效果不佳的α-葡萄糖苷酶；然后用纤维素滤纸将其表面残余液体吸干，并于30~40℃下干燥，即得。

上述步骤（1）中，戊二醛溶液的溶剂为浓度为10~30mmol/l、ph值为6.0~8.0的磷酸盐缓冲液，在此缓冲液中，醛基与氨基之间更易于发生席夫碱反应，从而有利于酶的固定。

步骤（2）中，α-葡萄糖苷酶溶液的溶剂为10~30mmol/l、ph3.0~7.0的磷酸盐缓冲液，有利于酶促反应的进行。

三、以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶的高通量应用

本发明一种以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶的高通量应用，其具体操作为，将上述以壳聚糖修饰纤维素滤纸为载体的固定化酶使用纸张打孔器，裁成直径为6毫米的圆片，然后置于96孔板中，加入底物进行酶促反应。该固定化酶的性能表征实验如下：

以下实验是采用酶标仪，在405nm检测波长下对不同浓度底物对应产物的吸光度进行测定，通过吸光度值的变化率进行酶活测定的。

（1）固定化酶和游离酶的最适反应ph值

以0.8mmol/l4-硝基苯-α-d-吡喃葡萄糖苷（pnpg）为底物，在20mmol/l磷酸缓冲液中，60℃下测定α-葡萄糖苷酶活性，以确定固定化α-葡萄糖苷酶和游离α-葡萄糖苷酶的最适反应ph值，结果如图2所示。其中，以相对酶活进行比较，相对酶活是以同组实验中最高酶活力为100%进行计算。由相对酶活对反应ph值的响应可以看出，在ph4.0下，游离酶和固定化酶都表现了最大催化活性；在所考察的反应ph值范围内，固定化酶的相对催化活性高于游离酶的相对催化活性，表明α-葡萄糖苷酶经固定之后受反应ph值的影响减小。

（2）固定化酶和游离酶的最适反应温度

以0.8mmol/lpnpg为底物，在20mmol/l磷酸缓冲液中（ph=4）测定α-葡萄糖苷酶活性，以确定固定化α-葡萄糖苷酶和游离α-葡萄糖苷酶的最适反应温度，结果如图3所示。由相对酶活对反应温度的响应可以看出，游离酶在60℃时表现了最大催化活性；而固定化酶在70℃时表现了最大催化活性；在所考察的反应温度范围内，固定化酶的相对催化活性高于游离酶的相对催化活性，这表明酶经固定之后受反应温度的影响减小。

（3）固定化酶的重复使用实验

将直径为6毫米的固定化酶置于96孔板中，然后加入40微升0.8mmol/l的pnpg，密封，置于60℃恒温振荡器中。12分钟后，取出固定化酶，用磷酸缓冲液（20mmol/l，ph4.0）清洗三次除去残余的底物和产物。使用干燥的纤维素滤纸将固定化酶表面残余的液体吸干，重复以上操作。如图4所示，随着重复使用次数的增加，固定化酶催化活性降低，但仍保持了良好的催化活性；经过连续10次酶促反应之后，固定化酶仍然保持了其初始酶活的71.0%。

综上，本发明的有益效果为：

1、以壳聚糖修饰纤维素滤纸为酶固定化载体，避免了固定化酶与反应体系繁琐的分离过程，实现固定化酶的即时分离。

2、在相同的反应温度和ph值条件下，固定化酶的相对催化活性均显著高于游离酶的相对催化活性，且经过连续10次酶促反应之后，固定化酶保持了其初始活性的71.0%。该实验结果表明，采用本发明方法制备的固定化酶扩大了酶的酸碱适应范围，实现固定化酶的重复使用，从而提高了酶的利用率。

3、以壳聚糖为改性剂，利用其黏性，使用简单的物理方法使其沉积于纤维素滤纸表面，实现对纤维素滤纸的氨基改性，简化了固定化酶的制备工艺。

4、使用纸张打孔器，将壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶裁成直径6毫米的圆片，置于96孔板中，与底物发生酶促反应，能够实现其高通量应用。

附图说明

图1为本发明壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶的制备方法流程图（以实施例1为例）；

图2为本发明壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶和游离酶对反应ph值的响应结果；

图3为本发明壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶和游离酶对反应温度的响应结果；

图4为本发明壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶的重复使用实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶的制备方法作进一步描述。

实施例1

（1）将洁净的纤维素滤纸浸没于20毫升质量浓度为1.0%的壳聚糖醋酸溶液（1.0%）中，于室温下静置12小时；然后，用超纯水漂洗至滤纸表面残余液体为中性；最后，将滤纸置于35℃鼓风干燥箱中进行干燥，壳聚糖沉积于纤维素滤纸表面及其内部孔径中，得到壳聚糖修饰纤维素滤纸，记为纤维素滤纸-nh2；

（2）将步骤（1）中纤维素滤纸-nh2浸没于15毫升质量浓度为2.5%的戊二醛溶液（溶剂为20mmol/l、ph值为7.4的磷酸盐缓冲液）中，密封，置于40℃恒温振荡器中，反应1小时后取出，先用超纯水洗涤，去除未反应的戊二醛，然后，使用浓度为20mmol/l、ph值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，最后使用洁净、干燥的纤维素滤纸将其表面残余液体吸干，此次修饰所得纤维素滤纸记为纤维素滤纸-cho；

（3）将步骤（2）中纤维素滤纸-cho浸没于12毫升质量浓度为0.5mg/ml的α-葡萄糖苷酶溶液（溶剂为20mmol/l、ph值为4.0的磷酸盐缓冲液）中，密封，置于35℃恒温振荡器中，反应1小时；然后，使用20mmol/l、ph值为4.0的磷酸盐缓冲液洗涤五次，以去除固定不牢的酶；最后，使用洁净、干燥的纤维素滤纸将滤纸表面残余的液体吸干，并将其置于35℃鼓风干燥箱中进行干燥，即得壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶；上述制备过程如图1所示；

（4）使用纸张打孔器，将步骤（3）中壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶裁成直径6毫米的圆片，置于4℃下保存，备用。

实施例2

（1）将洁净的纤维素滤纸浸没于20毫升质量浓度为5.0%的壳聚糖醋酸溶液（1.0%）中，于室温下静置12小时；然后，用超纯水漂洗至滤纸表面残余液体为中性；最后，将滤纸置于40℃鼓风干燥箱中进行干燥，壳聚糖沉积于纤维素滤纸表面及其内部孔径中，得到壳聚糖修饰纤维素滤纸，记为纤维素滤纸-nh2；

（2）将步骤（1）中纤维素滤纸-nh2浸没于15毫升质量浓度为5%的戊二醛溶液（溶剂为20mmol/l、ph值为6.0的磷酸盐缓冲液）中，密封，置于45℃恒温振荡器中，反应4小时后取出，先用超纯水洗涤，去除未反应的戊二醛，然后，使用浓度为20mmol/l、ph值为6.0的磷酸盐缓冲液洗涤，最后使用洁净、干燥的纤维素滤纸将其表面残余液体吸干，此次修饰所得纤维素滤纸记为纤维素滤纸-cho；

（3）将步骤（2）中纤维素滤纸-cho浸没于12毫升质量浓度为1.0mg/ml的α-葡萄糖苷酶溶液（溶剂为20mmol/l、ph值为3.5的磷酸盐缓冲液）中，密封，置于40℃恒温振荡器中，反应3小时；然后，使用20mmol/l、ph值为3.5的磷酸盐缓冲液洗涤五次，以去除固定不牢的酶；最后，使用洁净、干燥的纤维素滤纸将滤纸表面残余的液体吸干，并将其置于40℃鼓风干燥箱中进行干燥，即得壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶；

（4）使用纸张打孔器，将步骤（3）中壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶裁成直径6毫米的圆片，置于4℃下保存，备用。

实施例3

（1）将洁净的纤维素滤纸浸没于20毫升质量浓度为0.1%的壳聚糖醋酸溶液（1.0%）中，于室温下静置12小时；然后，用超纯水漂洗至滤纸表面残余液体为中性；最后，将滤纸置于30℃鼓风干燥箱中进行干燥，壳聚糖沉积于纤维素滤纸表面及其内部孔径中，得到壳聚糖修饰纤维素滤纸，记为纤维素滤纸-nh2；

（2）将步骤（1）中纤维素滤纸-nh2浸没于15毫升质量浓度为20%的戊二醛溶液（溶剂为20mmol/l、ph值为8.0的磷酸盐缓冲液）中，密封，置于40℃恒温振荡器中，反应7小时后取出，先用超纯水洗涤，去除未反应的戊二醛，然后，使用浓度为20mmol/l、ph值为8.0的磷酸盐缓冲液洗涤，最后使用洁净、干燥的纤维素滤纸将其表面残余液体吸干，此次修饰所得纤维素滤纸记为纤维素滤纸-cho；

（3）将步骤（2）中纤维素滤纸-cho浸没于12毫升质量浓度为2.5mg/ml的α-葡萄糖苷酶溶液（溶剂为20mmol/l、ph值为4.5的磷酸盐缓冲液）中，密封，置于30℃恒温振荡器中，反应6小时；然后，使用20mmol/l、ph值为4.5的磷酸盐缓冲液洗涤五次，以去除固定不牢的酶；最后，使用洁净、干燥的纤维素滤纸将滤纸表面残余的液体吸干，并将其置于30℃鼓风干燥箱中进行干燥，即得壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶；

（4）使用纸张打孔器，将步骤（3）中壳聚糖修饰纤维素滤纸固定化酶裁成直径6毫米的圆片，置于4℃下保存，备用。