一种磺化聚苯乙烯微球固定化碱性蛋白酶及其制备方法与流程

本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及一种磺化聚苯乙烯微球固定化碱性蛋白酶及其制备方法。

背景技术：

蛋白酶是工业酶中用的最多的一类酶，约占酶总量的60％，而碱性蛋白酶又占蛋白酶市场销售额的50％以上，它在食品工业中发挥了巨大作用。碱性蛋白酶是指在ph值碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，作为一种生物催化剂，具有普通的化学催化剂无可比拟的优势：具有髙效性、专一性、且反应条件温和、污染低、来源广泛。然而在实际应用中，酶对环境条件要求较高，酶对各种物理或化学因素较敏感，如强酸、强碱、强热、有机溶剂等，都有可能导致酶活的丧失；而且在工业生产过程中酶的分离提纯也较为复杂，回收利用比较困难，不利于降低生产成本，为了克服酶的这些缺点，固定化酶技术成为研究的热点，固定化碱性蛋白酶的研究具有重要的意义。

酶的固定化是将酶制剂固定化在特定的载体上，在保留生物酶催化特性的同时，还可以达到回收反复利用，且易分离的一种方法。固定化酶与游离酶相比，具有稳定性高、可多次重复利用、分离回收容易、适合多酶反应、便于连续化生产且反应过程便于控制等优点。目前固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、交联法以及共价结合法等。包埋法传质阻力大同时容易泄露；交联法与共价结合法反应比较激烈，容易降低固定化酶的活力，且交联剂一般价格昂贵；而吸附法反应条件温和、简单易行，能够很好的保留酶催化活性，受到了研究者的广泛关注。此外固定化载体也是影响酶催化效率的重要因素，因此探寻可行、有效的固定化载体以及固定化方法来增强固定化酶的催化性能是目前需要解决的重要问题。

随着功能性聚合物材料的快速崛起，越来越多的聚合物材料被开发并应用于各个领域。磺化聚苯乙烯微球作为近年来各学者的研究热点，不仅具有原料丰富、价格低廉、刚性大、化学性质稳定等特点，而且通过对聚苯乙烯微球的磺化改性，可以大大增强其亲水性能，使得其在水溶液中具有良好的分散性和生物相容性。但目前暂未有磺化聚苯乙烯微球负载碱性蛋白酶的报道。

技术实现要素：

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种磺化聚苯乙烯微球固定化碱性蛋白酶。

本发明的另一目的在于提供上述磺化聚苯乙烯微球固定化碱性蛋白酶的制备方法。本发明以磺化聚苯乙烯微球为载体，然后利用自组装法固定碱性蛋白酶，制得一种具有高活性回收率的固定化酶，此方法不仅简单方便、安全高效，而且能够在短时间内快速制得，活性回收率和负载量高。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种磺化聚苯乙烯微球固定化碱性蛋白酶，由磺化聚苯乙烯微球载体及吸附固定化的碱性蛋白酶构成。

优选地，所述磺化聚苯乙烯微球载体的粒径为100～200nm。

优选地，所述碱性蛋白酶为枯草芽孢杆菌蛋白酶。

上述磺化聚苯乙烯微球固定化碱性蛋白酶的制备方法，包括如下制备步骤：

将磺化聚苯乙烯微球超声分散于蒸馏水中，然后加入到碱性蛋白酶溶液进行吸附固定化反应，产物经分离、洗涤，得到磺化聚苯乙烯微球固定化碱性蛋白酶。

优选地，所述吸附固定化反应体系中磺化聚苯乙烯微球的浓度为0.2～2.0g/ml，碱性蛋白酶的浓度为1.8～9.0mg/ml。

优选地，所述吸附固定化反应的温度为4～35℃，ph值为4.0～6.5，时间为2～120min。

优选地，所述磺化聚苯乙烯微球通过如下方法制备得到：将聚苯乙烯微球与浓硫酸混合后在30～40℃搅拌反应，产物经洗涤、干燥，得到磺化聚苯乙烯微球。

优选地，所述聚苯乙烯微球与浓硫酸的加入比为1:40g/ml。

优选地，所述搅拌反应的时间为5～12h。

本发明的原理为：磺化聚苯乙烯微球表面接枝的磺酸基团，带有很强的电负性，可增强其与生物活性物质如酶、蛋白质的固定化能力。研究表明，碱性蛋白酶的相对分子质量通常在15000～40000，其等电点较高，多为8～9。因此，可以通过调节体系ph溶液，利用静电吸附的原理使得磺化聚苯乙烯微球与碱性蛋白酶发生高效自组装反应，从而达到温和、高效、快速制备固定化酶的目的。

相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：

(1)本发明通过浓硫酸改性聚苯乙烯微球制备得到磺化聚苯乙烯微球，该方法简单方便，制备得到纳米级微球不仅具有高比表面积，而且磺化度高，在水溶液中具有良好的分散性以及强电负性。

(2)本发明利用带强电负性的磺化聚苯乙烯微球自组装吸附带相反电荷的碱性蛋白酶，此制备固定化酶的方法不仅简单方便、不需要添加额外的交联剂，而且能够快速制备得到固定化酶，反应2min即可得到达到91.59％高活性回收率的固定化酶。

(3)本发明制备的固定化酶具有高活性回收率、高负载量。固定化酶的活性位点未受到化学试剂的破坏，最高活性回收率可达91.59％，同时负载量为273.36mg/g；反应1小时，能达到369.87mg/g的高负载量，且活性回收率为67.77％。

附图说明

图1为本发明实施中磺化聚苯乙烯微球(a)和所得磺化聚苯乙烯微球固定化酶(b)的扫描电镜图。

图2为本发明实施例1～6中固定化时间对固定化酶活性回收率和负载量的影响结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例所用磺化聚苯乙烯微球通过如下方法制备得到：

称取5g纳米聚苯乙烯微球加入至含有200ml96％h2so4的圆底烧瓶，超声分散均匀，在33℃条件下机械搅拌反应6h。反应完成后，所得的磺化微球用蒸馏水、无水乙醇交替洗涤数次，并于40℃真空干燥24h，得到粒径为100～200nm的纳米磺化聚苯乙烯微球。

实施例1

用蒸馏水配制4.5mg/ml的枯草芽孢杆菌蛋白酶溶液，加入已超声分散均匀的纳米磺化聚苯乙烯微球溶液，使微球终浓度为1mg/ml。在室温下，磁力搅拌固定化2min，离心分离，用水洗涤3次，得到磺化聚苯乙烯微球固定化酶沉淀。收集合并上清液，根据考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，计算酶负载量；收集沉淀，根据国家行业标准sb/t10317蛋白酶活力测定法测定酶活力，计算酶活回收率，计算公式如下(1)、(2)所示。得到固定化酶的活性回收率为91.59％，负载量为273.36mg/g。

(1)酶活回收率(％)＝固定化酶活力/固定化前游离酶活力×100％；

(2)负载量(mg/g)＝(m0-m1)/m；

特别地：m0为加入反应的蛋白酶含量，mg；

m1为离心后上清液与洗液中蛋白酶含量，mg；

m为加入反应的载体含量，g。

实施例2

用蒸馏水配制4.5mg/ml的枯草芽孢杆菌蛋白酶溶液，加入已超声分散均匀的纳米磺化聚苯乙烯微球溶液，使微球终浓度为1mg/ml。在室温下，磁力搅拌固定化5min，离心分离，用水洗涤3次，得到磺化聚苯乙烯微球固定化酶，活性回收率为82.55％，负载量为288.6mg/g。

实施例3

用蒸馏水配配制4.5mg/ml的枯草芽孢杆菌蛋白酶溶液，加入已超声分散均匀的纳米磺化聚苯乙烯微球溶液，使微球终浓度为1mg/ml。在室温下，磁力搅拌固定化10min，离心分离，用水洗涤3次，得到磺化聚苯乙烯微球固定化酶，活性回收率为80.49％，负载量为306.38mg/g。

实施例4

用蒸馏水配配制4.5mg/ml的枯草芽孢杆菌蛋白酶溶液，加入已超声分散均匀的纳米磺化聚苯乙烯微球溶液，使微球终浓度为1mg/ml。在室温下，磁力搅拌固定化30min，离心分离，用水洗涤3次，得到磺化聚苯乙烯微球固定化酶，活性回收率为69.68％，负载量为339.40mg/g。

实施例5

用蒸馏水配配制4.5mg/ml的枯草芽孢杆菌蛋白酶溶液，加入已超声分散均匀的纳米磺化聚苯乙烯微球溶液，使微球终浓度为1mg/ml。在室温下，磁力搅拌固定化60min，离心分离，用水洗涤3次，得到磺化聚苯乙烯微球固定化酶，活性回收率为67.77％，负载量为369.87mg/g。

实施例6

用蒸馏水配配制4.5mg/ml的枯草芽孢杆菌蛋白酶溶液，加入已超声分散均匀的纳米磺化聚苯乙烯微球溶液，使微球终浓度为1mg/ml。在室温下，磁力搅拌固定化120min，离心分离，用水洗涤3次，得到磺化聚苯乙烯微球固定化酶，活性回收率为67.35％，负载量为370.71mg/g。

实施例7

用ph6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制4.5mg/ml的枯草芽孢杆菌蛋白酶溶液，加入超声分散均匀的纳米磺化聚苯乙烯微球溶液，微球终浓度为1mg/ml，在室温下，磁力搅拌固定化60min，离心分离，用水洗涤3次，得到磺化聚苯乙烯微球固定化酶，活性回收率为77.30％，负载量为397.15mg/g。

实施例8

用ph5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制4.5mg/ml的枯草芽孢杆菌蛋白酶溶液，加入超声分散均匀的纳米磺化聚苯乙烯微球溶液，微球终浓度为1mg/ml，在室温下，磁力搅拌固定化60min，离心分离，用水洗涤3次，得到磺化聚苯乙烯微球固定化酶，活性回收率为60.58％，负载量为497.73mg/g。

实施例9

用ph6.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制4.5mg/ml的枯草芽孢杆菌蛋白酶溶液，加入超声分散均匀的纳米磺化聚苯乙烯微球溶液，微球终浓度为1mg/ml，在4℃下，磁力搅拌固定化60min，离心分离，用水洗涤3次，得到磺化聚苯乙烯微球固定化酶，活性回收率为87.06％，负载量为320.04mg/g。

以上实施中磺化聚苯乙烯微球(a)和所得磺化聚苯乙烯微球固定化酶(b)的扫描电镜图如图1所示。图1中可见，磺化聚苯乙烯微球载体及所得磺化聚苯乙烯微球固定化酶的粒径为100～200nm。

以上实施例1～6中在不同固定化时间对所得固定化酶活性回收率和负载量的影响结果如图2所示。由图2可见，随着固定化反应时间的增加，固定化酶活性回收率和负载量均增加，在固定化反应时间为60min时达到稳定。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。