本发明涉及农业微生物领域中一株促进小冠花生长的杨凌根瘤菌及其培养方法与应用。
背景技术：
小冠花(coronillavaria)是豆科小冠花属的多年生草本植物，匍匐地丛生，枝叶茂密，抗逆性强，是较好的覆盖绿肥，也是反刍动物有价值的高蛋白饲草。小冠花的根系发达，除主根外侧根也非常发达，可以在土层中横向走串，根系发达有根瘤，固氮能力强，繁育率高，植株丰茂，产草量高，一般耕地每年可以割草三次，覆盖度大，能迅速形成草皮，是一种很好的保持水土植物。小冠花在我国能适应长江以北和长江以南广大地区，并在一定范围内越过长江。小冠花不但可以培肥地力改良土壤，而且可以美化环境，减少污染。
氮素是植物生长中重要的营养元素，农作物依赖于施用氮素化肥所获得的增产实际上是以消耗能源和污染环境为代价所取得的，而土壤中的固氮微生物将空气中的氮气转化为植物可吸收的氨的过程既是高效且对环境无害。根瘤菌(rhizobia)是一类广泛存在于土壤中的细菌，它们能与豆科植物形成共生关系，通过侵染豆科植物的根部或茎部形成根瘤，以共生体的形式将空气中的氮气转化成植物可吸收利用的优质氮素―谷氨酸和谷氨酚胺类物质。豆科根瘤菌的研究和应用已有一百多年历史，几乎在全世界范围内都提倡对豆科作物进行根瘤菌接种。根瘤菌和豆科植物共生体系是已知生物固氮能力最强的体系之一，每年固氮量占全球生物总固氮量的65％以上，开发和利用豆科植物与根瘤菌共生固氮效应的潜力巨大。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何显著促进小冠花增长和/或增产。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一株根瘤菌。
本发明所提供的根瘤菌是杨凌根瘤菌(rhizobiumyanglingense)，其菌株号为cv8401，该菌株已于2018年03月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.15532，以下简称为杨凌根瘤菌cv8401。
杨凌根瘤菌cv8401具有序列表中序列1所示的16srdna序列。
杨凌根瘤菌cv8401的培养物也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的杨凌根瘤菌cv8401的培养物可为将杨凌根瘤菌cv8401在微生物培养基中培养得到的培养容器内的所有物质。所述培养物包括所述杨凌根瘤菌cv8401和所述杨凌根瘤菌cv8401的代谢物。
上述杨凌根瘤菌cv8401的培养物中，所述微生物培养基可为固体培养基或液体培养基。
为了解决以上技术问题，本发明还提供了促进豆科植物生长和/或增产的菌剂。
本发明所提供的促进豆科植物生长和/或增产的菌剂，含有杨凌根瘤菌cv8401或/和杨凌根瘤菌cv8401的培养物。
上述菌剂中，所述促进豆科植物生长和/或增产具体可为提高豆科植物株高和/或提高豆科植物干草产量和/或提高豆科植物种子产量。
上述菌剂的活性成分可为杨凌根瘤菌cv8401或/和杨凌根瘤菌cv8401的培养物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂对豆科植物株高和/或豆科植物干草产量和/或豆科植物种子产量促进效果确定。
所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，杨凌根瘤菌cv8401或/和杨凌根瘤菌cv8401的培养物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。
杨凌根瘤菌cv8401、杨凌根瘤菌cv8401的培养物或促进豆科植物生长和/或增产的菌剂在制备促进豆科植物生长和/或增产的产品中的应用和促进豆科植物生长和/或增产中的应用均属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述促进豆科植物生长和/或增产具体可为提高豆科植物株高和/或提高豆科植物干草产量和/或提高豆科植物种子产量。
上述应用中，所述促进豆科植物生长和/或增产的产品可为促进豆科植物生长和/或增产的菌剂或含有所述促进豆科植物生长和/或增产的菌剂的生物肥料。
本申请中，所述豆科植物可为小冠花属植物，如小冠花。
为了解决以上技术问题，本发明还提供了一种培养杨凌根瘤菌cv8401的方法。
本发明所提供的培养杨凌根瘤菌cv8401的方法，包括在用于培养根瘤菌的培养基中培养杨凌根瘤菌cv8401的步骤。
所述用于培养根瘤菌的培养基可按照如下方法配制：丙三醇3-5ml，甘露醇2-5g，酵母浸粉0.8-1g，k2hpo40.5-1g，无水mgso40.1-0.2g，caso4·2h2o0.1-0.2g，nacl0.1-0.2g，质量含量为1％的(nh4)6mo7o24·4h2o水溶液1-1.5ml、质量含量为1％的h3bo3水溶液1-1.5ml，琼脂20g，用水定容至1000ml，调ph值为6.8-7.0，灭菌得到用于培养根瘤菌的培养基。
为了解决以上技术问题，本发明还提供了一种制备杨凌根瘤菌cv8401菌剂的方法。
本发明所提供的制备杨凌根瘤菌cv8401菌剂的方法，包括将杨凌根瘤菌cv8401和/或杨凌根瘤菌cv8401的培养物作为所述菌剂的成分的步骤。
实验证明，将杨凌根瘤菌cv8401接种小冠花后，结瘤率、植株高度、植株干草重量和种子产量比不接菌对照均有显著增加：结瘤率比不接菌对照增加326.47％，植株高度比不接菌对照增加106.03％，植株干草产量比不接菌对照增加83.28％，种子产量比不接菌对照增加75.44％。本发明具有较高的实用性和可推广性，有望发展成为杨凌根瘤菌应用领域中一项新的优良组合技术。本发明在小冠花种植业中具有广阔的应用前景。
保藏说明
菌种名称：杨凌根瘤菌(rhizobiumyanglingense)
菌株编号：cv8401
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：cgmcc
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年03月30日
保藏中心登记入册编号：cgmccno.15532
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的根瘤菌(rhizobiumsp.)accc19628于1987年2月1日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称accc，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。以下简称根瘤菌accc19628。
下述实施例中的固体培养基的配制方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，k2hpo40.5g，无水mgso40.2g，caso4·2h2o0.2g，nacl0.1g，质量含量为1％的(nh4)6mo7o24·4h2o水溶液1ml、质量含量为1％的h3bo3水溶液1ml，琼脂20g，用水定容至1000ml，调ph值为6.8-7.0，121℃灭菌30min。
下述实施例中的液体培养基的配制方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，k2hpo40.5g，无水mgso40.2g，caso4·2h2o0.2g，nacl0.1g，质量含量为1％的(nh4)6mo7o24·4h2o溶液1ml、质量含量为1％的h3bo3水溶液1ml，用水定容至1000ml，调ph值为6.8-7.0，121℃灭菌30min。
实施例1、杨凌根瘤菌(rhizobiumyanglingense)cv8401cgmccno.15532的分离及鉴定
1、菌株的分离
从陕西省境内采集小冠花根瘤，用平板(取甘露醇10g，酵母浸粉1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，质量含量为1％的钼酸铵水溶液1ml和质量含量为1％的硼酸水溶液1ml，0.5％刚果红1ml，20g琼脂，用水定容至1l，ph值为6.8-7.0)划线分离得到菌株cv8401。
2、菌株的鉴定
2.1、形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤1分离并纯化得到的菌株cv8401进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。另一方面，对处于对数生长期的菌株cv8401，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明菌株cv8401菌体短小杆状，大小为0.5～0.9微米×1.2～3.0微米，在不同培养基生长的菌体形态不同。含有聚-β-羟基丁酸盐颗粒。革兰氏阴性，无芽孢，具鞭毛，运动，好氧。最适生长温度25～30℃，最适ph6.0～9.0。菌落呈圆形，边缘整齐，凸起，无色半透明或浅乳白色，粘稠。刚果红培养不吸色，在含糖培养基上的生长物常伴有丰富的胞外粘液。
2.2、16srdna序列同源性分析
采用菌落pcr方法扩增步骤1所得的菌株cv8401的16srdna片段，相关试剂由全式金公司提供。对16srrna基因片段进行扩增并克隆测序的结果表明，菌株cv8401的16srdna具有序列表中序列1的核苷酸序列。菌株cv8401的16srdna与杨凌根瘤菌rhizobiumyanglingense的16srrna基因(sequenceid:jf273845.1)的相似性最高为100％。
2.3、生理生化特征鉴定
参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)《伯杰细菌鉴定手册》第八版(r.e.布坎南、n.e.吉本斯等编.科学出版社，1984.)测定菌株cv8401的生理生化特征。结果表明菌株cv8401是化能异养型，能利用多种碳水化合物和有机酸的盐类作为碳源，如能利用葡萄糖、乳糖、d-核糖、d-阿拉伯糖、甘露醇、麦芽糖、d-半乳糖、果糖、海藻糖和肌醇；能利用蛋白胨、酵母汁、谷氨酸、铵盐、硝酸盐和多数氨基酸可作为氮源；刚果红吸色反应微吸色；石蕊牛奶反应产酸，有血清环；btb产酸；不能水解酪素；不利用3-酮基乳糖；从甘露醇产酸；在含糖培养基上生长常伴有丰富的胞外粘液；不在甘油磷酸钙培养基产生沉淀。
鉴于上述形态、生理生化特征分析和16srdna序列同源性分析结果，将步骤1分离纯化得到的菌株cv8401鉴定为杨凌根瘤菌(rhizobiumyanglingense)。该杨凌根瘤菌(rhizobiumyanglingense)cv8401已于2018年03月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.15532，以下简称为杨凌根瘤菌cv8401。
实施例2、促进小冠花生长的杨凌根瘤菌cv8401菌剂的制备
1、杨凌根瘤菌cv8401的斜面培养
将杨凌根瘤菌cv8401接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养72h，得到斜面培养的杨凌根瘤菌cv8401。
2、菌种的活化
挑取步骤1斜面培养的杨凌根瘤菌cv8401，将其接种于500ml液体培养基中，在28℃下培养60h，得到杨凌根瘤菌cv8401菌液。
3、种子罐培养
取6l步骤2的杨凌根瘤菌cv8401菌液，将其接入100l种子罐中(含有60l液体培养基)进行种子培养，在28℃、150rpm下振荡培养60h培养，得到杨凌根瘤菌cv8401种子液。
4、发酵罐培养
按10％比例(体积比)将步骤3的杨凌根瘤菌cv8401种子液接入1000l发酵罐中(含有600l液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下振荡培养60h，得到杨凌根瘤菌cv8401发酵液，该杨凌根瘤菌发酵液中cv8401的含量为2×109cfu/ml。
5、杨凌根瘤菌cv8401菌剂的制备
将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调ph值为6.8，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。
将步骤4的杨凌根瘤菌cv8401发酵液与该无菌草炭混合均匀，再在28℃条件下增殖培养48h，得到杨凌根瘤菌cv8401菌剂，分装入库。经检测成品合格，该杨凌根瘤菌cv8401菌剂中的cv8401菌数含量为2.0×108cfu/g。
实施例3、杨凌根瘤菌(rhizobiumyanglingense)cv8401cgmccno.15532与根瘤菌accc19628接种小冠花的效果对比试验
以本申请人从中国陕西省境内的小冠花根瘤中分离得到的根瘤菌accc19628作为对照进行下述试验：
一、根瘤菌accc19628菌剂的制备
1、斜面培养
将根瘤菌accc19628接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养72h。
2、菌种的活化
挑取步骤1斜面培养的根瘤菌accc19628接种于500ml的液体培养基中，在28℃下培养60h，得到根瘤菌accc19628菌液。
3、种子罐培养
取6l步骤2的根瘤菌accc19628菌液，将其接入100l种子罐中(含有60l液体培养基)进行种子培养，在30℃、120rpm下振荡培养60h培养，得到根瘤菌accc19628种子液。
4、发酵罐培养
按10％比例(体积比)将步骤3的根瘤菌accc19628种子液接入1000l发酵罐中(含有600l液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下振荡培养60h，得到根瘤菌accc19628发酵液。
5、小冠花根瘤菌(rhizobiumsp.)accc19628菌剂的制备
将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调ph值为6.8，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。
将步骤4的根瘤菌accc19628发酵液与该无菌草炭混匀，再在28℃条件下增殖培养48h，得到根瘤菌accc19628菌剂，分装入库。经检测成品合格，该根瘤菌accc19628菌剂中的有效活菌数含量为2.0×108cfu/g。
二、促进小冠花生长的田间效果试验
试验地点在内蒙古自治区通辽市。本试验采用随机区组设计，随机设置三个处理区，每个处理区设三个小区重复。三个处理区分别为不接菌对照处理区、cv8401菌剂处理区、accc19628菌剂处理区。每个小区大小为4×5m2,土壤ph值为7.6。
将实施例2制备的杨凌根瘤菌cv8401菌剂与小冠花种子按照1：10的质量比混合、拌匀，得到的种子称为cv8401-小冠花种子。
将步骤一制备的根瘤菌accc19628菌剂与小冠花种子按照1：10的质量比混合、拌匀，得到的种子称为accc19628-小冠花种子。
将无菌草炭与小冠花种子按照1：10的质量比混合、拌匀，得到的种子称为无菌草炭-小冠花种子。
上述种子按照小区设计均匀播种到土壤中，播种方法为条播，行距为10cm。上述各处理区除所播种的种子不同外，其他条件完全相同。其中，不接菌对照处理区播种的种子为无菌草炭-小冠花种子；cv8401菌剂处理区播种的种子为cv8401-小冠花种子；accc19628菌剂处理区播种的种子为accc19628-小冠花种子。
播种当年种子成熟时和第二年种子成熟时，分别记录各地下部分结瘤率(简称结瘤率)、地上部分植株高度、干草产量和种子产量，计算出各组的平均值，得出两年的平均结瘤率、地上部分植株平均高度(简称植株平均高度)、平均干草产量和平均种子产量。
表1、杨凌根瘤菌cv8401菌剂、根瘤菌accc19628菌剂接种小冠花的试验结果
结果如表1所示，表明：
1、cv8401菌剂处理区的小冠花与不接菌对照处理区的小冠花相比，两年的平均结瘤率增加326.47％、两年的平均植株高度增加106.03％、两年的平均干草产量增加83.28％，两年的平均种子产量增加75.44％。
2、cv8401菌剂处理区的小冠花与accc19628菌剂处理区的小冠花相比，两年的平均结瘤率增加81.25％、两年的平均植株高度增加46.59％、两年的干草产量增加48.40％，两年的平均种子产量增加42.57％。
上述结果表明本发明的杨凌根瘤菌cv8401对小冠花，比根瘤菌accc19628具有更显著的促进生长和增产效果。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110>中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
<120>一株促进小冠花生长的杨凌根瘤菌及其培养方法与应用
<130>gncfh182036
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<213>杨凌根瘤菌（rhizobiumyanglingense）
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