一种微生物生产短中长链聚羟基脂肪酸共聚物的方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种微生物生产短中长链聚羟基脂肪酸共聚物的方法。
背景技术：
：聚羟基脂肪酸酯(pha)是许多微生物天然存在的贮能物质，化学本质是一种高分子聚酯。由于具备完全生物可降解和完全生物合成等特征，pha被认为是解决全球塑料污染的一类最具潜力的生物材料。经过几十年的生产探索，已有多种pha被成功合成并投入产业化生产，包括聚3-羟基丁酸酯(phb)、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(phbv)、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(phbhhx)、聚3-羟基丁酸-4-羟基戊酸酯(p3hb4hb)。由于生产成本过高、材料性能难以满足应用需求，与传统不可降解的石油基塑料相比，pha的应用仍然面临困境。pha具有结构多样性，其单体均为r构型，结构通式见式(ⅰ)。根据侧链r基的不同，pha可分为短链pha(sclpha)和中长链pha(mclpha)。sclpha主要由3c到5c单体构成，通常具有结晶度高、脆性大、延展性差等特征，并具有较高的熔融温度和玻璃态转化温度，大大限制其推广和应用。mclpha由6c-14c的单体构成，通常呈现出弹性塑料的低结晶度，高柔韧性等特点，但mclpha在实际加工中容易软化，其应用同样受到限制。短链中长链共聚的pha(scl-co-mclpha)同时含有scl单体和mcl单体，结合两者的优点，改善sclpha或mclpha性能的不足，scl-co-mclpha被认为是一种有潜力的pha材料。目前scl-co-mclpha的研究受限于以下几个方面：(1)低特异性pha聚合酶(phac蛋白，由phac基因编码)。根据pha聚合酶的底物特异性，可被分为三类：scl特异性pha聚合酶、mcl特异性pha聚合酶、低特异性pha聚合酶。目前已知并用于生产的绝大多数phac属于前两类，只能特异性聚合scl单体或mcl单体。仅有少数几种phac被发现能够同时聚合scl和mcl单体，即具有低特异性，且有些是通过突变改造后改善的。(2)合适的底盘菌株。天然微生物一般只能积累scl或mcl其中一种pha。(3)mcl单体比例难以控制。除了phbhhx这种仅含两种单体的聚合物外，常说的scl-co-mclpha实际上由不止两种单体组成。由于大部分菌株的β-氧化循环存在或削弱不彻底，作为底物的脂肪酸进入细胞后每经过一次β-氧化循环就会丢失两个碳原子，因此菌株合成的scl-co-mclpha中的mcl单体部分一般包括c6、c8、c10、c12等多个单体，很少能够合成只由一种scl单体和一种mcl单体组成的聚合物。由于β-氧化循环产生的中长链单体比例(c6：c8：c10：c12)不容易控制，不同批次得到的scl-co-mclpha可能在mcl单体比例上差别较大，材料性能难以得到稳定保证。技术实现要素：针对现有技术中短链中长链共聚的聚羟基脂肪酸酯(scl-co-mclpha)的困难，本发明的发明人经过反复的研究和实验验证，发明了一种微生物生产scl-co-mclpha的方法。本发明保护一种重组菌，是将出发菌进行如下(a1)、(a2)和(a3)的改造得到的：(a1)导入低特异性聚羟基脂肪酸酯(pha)聚合酶基因；(a2)导入聚3-羟基丁酸酯(phb)合成途径的关键蛋白的编码基因；(a3)敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因。本发明还保护一种重组菌，是将出发菌进行如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)和(b5)的改造得到的：(b1)导入低特异性pha聚合酶基因；(b2)导入phb合成途径的关键蛋白的编码基因；(b3)敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因；(b4)敲除内源的β-氧化循环相关基因；(b5)敲除內源的pha聚合酶基因。以上任一所述低特异性pha聚合酶能够聚合短链和中长链的pha单体(比如3-羟基丁酸、3-羟基辛酸、3-羟基癸酸和3-羟基十二烷酸等)。以上任一所述低特异性pha聚合酶包括但不限于经过饱和突变的低特异性pha聚合酶phac61-3(由phac61-3编码)。以上任一所述phb合成途径的关键蛋白包括但不限于β-酮基硫解酶(phaa蛋白,由phaa编码)和nadph/nadh依赖型乙酰辅酶a还原酶(phab蛋白，由phab编码)。以上任一所述β-酮基硫解酶包括但不限于来源于ralstoniaeutrophah16的β-酮基硫解酶。以上任一所述nadph/nadh依赖型乙酰辅酶a还原酶包括但不限于来源于ralstoniaeutrophah16的nadph/nadh依赖型乙酰辅酶a还原酶。导入低特异性pha聚合酶基因和导入phb合成途径的关键蛋白的编码基因具体可通过导入特异dna分子甲实现。所述特异dna分子中具有启动子、低特异性pha聚合酶基因、β-酮基硫解酶基因和nadph/nadh依赖型乙酰辅酶a还原酶基因；由所述启动子启动低特异性pha聚合酶基因、β-酮基硫解酶基因和nadph/nadh依赖型乙酰辅酶a还原酶基因的表达。导入低特异性pha聚合酶基因和导入phb合成途径的关键蛋白的编码基因具体可通过导入特异质粒甲实现。所述特异质粒甲为具有所述特异dna分子甲的质粒。所述特异质粒甲具体可如序列表的序列1所示。以上任一所述脂肪酸从头合成途径关键酶包括但不限于(r)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶a酰基转移酶(phag蛋白，由phag编码)。敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因具体可通过导入特异dna分子乙实现。所述特异dna分子乙中具有对应于(r)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶a酰基转移酶基因上游的同源臂和对应于(r)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶a酰基转移酶基因下游的同源臂。敲除脂肪酸从头合成途径关键酶的编码基因具体可通过导入特异质粒乙实现。所述特异质粒乙为具有所述特异dna分子乙的质粒。所述特异质粒乙具体可如序列表的序列2所示。所述低特异性pha聚合酶(phac61-3蛋白)的一种具体形式如序列表的序列4所示。但不限于该具体形式。所述β-酮基硫解酶(phaa蛋白)的一种具体形式如序列表的序列5所示。但不限于该具体形式。所述nadph/nadh依赖型乙酰辅酶a还原酶(phab蛋白)的一种具体形式如序列表的序列6所示。但不限于该具体形式。所述(r)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶a酰基转移酶(phag蛋白)的一种具体形式如序列表的序列7所示。但不限于该具体形式。所述低特异性pha聚合酶基因(phac61-3基因)的一种具体形式如序列表的序列1中第464-2143位核苷酸所示。但不限于该具体形式。所述β-酮基硫解酶基因(phaa基因)的一种具体形式如序列表的序列1中第2228-3409位核苷酸所示。但不限于该具体形式。所述nadph/nadh依赖型乙酰辅酶a还原酶基因(phab基因)的一种具体形式如序列表的序列1中第3484-4224位核苷酸所示。但不限于该具体形式。所述(r)-3-羟基酰基载体蛋白-辅酶a酰基转移酶基因(phag基因)的一种具体形式如序列表的序列3中第808-1692位核苷酸所示。但不限于该具体形式。所述启动子包括但不限于pre启动子。所述pre启动子如序列表的序列1中第33-428位核苷酸所示。以上任一所述出发菌为假单胞菌或嗜盐单胞菌。所述假单胞菌科包括但不限于p.putida、p.entomophila、p.aeruginosa、p.fluorescens、p.oleovorans和p.stutzeri等。所述嗜盐单胞菌包括但不限于h.bluephagenesis、h.campeniesis、h.alkaliphila、h.smymensis和h.levan。以上任一所述出发菌更具体可为嗜虫假单胞菌，包括但不限于p.entomophilal48、p.entomophilalac31等。本发明还保护以上任一所述重组菌在制备scl-co-mclpha中的应用。所述scl-co-mclpha为随机共聚物或嵌段共聚物。本发明还保护一种制备scl-co-mclpha的方法，包括如下步骤：以物质甲和/或物质乙为碳源，发酵以上任一所述重组菌，得到scl-co-mclpha；所述物质甲为短链碳源底物；所述物质乙为中长链碳源底物。所述物质甲可以是葡萄糖但不限于葡萄糖，也可以是葡萄糖酸钠、甘油、乙酸或乙酸钠、蔗糖以及它们的混合物等。所述物质乙可以是饱和/不饱和中长链脂肪酸但不限于饱和/不饱和中长链脂肪酸，也可以是饱和/不饱和中长链脂肪醇、饱和/不饱和中长链烷烃以及它们的混合物。所述物质乙具体可为月桂酸、月桂酸钠、癸酸、癸酸钠、9-癸烯醇等。本发明所涉及的微生物可以在适当的培养条件(温度、培养基成分、转速、溶氧、ph等)下培养，只要该培养能够使其合成期望的pha聚合物即可。例如，培养过程中的温度和培养基成分可以由本领域技术人员根据微生物的特性来适当地设定，或常规的优化实验来进行选择。所述scl-co-mclpha为随机共聚物或嵌段共聚物。物质甲和物质乙同时作为碳源时，所述scl-co-mclpha为随机共聚物。物质甲和物质乙先后(可以物质甲先、物质乙后，也可以物质乙先物质甲后)作为碳源时，所述scl-co-mclpha为嵌段共聚物。所述方法中，可通过调节物质甲和物质乙的比例生产比例可控的scl-co-mclpha。18-22g葡萄糖：0.3-0.7g月桂酸时(具体可为20g葡萄糖：0.5g月桂酸)，scl-co-mclpha中3hdd的摩尔比例为3-6％。18-22g葡萄糖：0.8-1.2g月桂酸时(具体可为20g葡萄糖：1g月桂酸)，scl-co-mclpha中3hdd的摩尔比例为27-30％。13-17g葡萄糖：1.5-2.2g月桂酸时(具体可为20g葡萄糖：2g月桂酸)，scl-co-mclpha中3hdd的摩尔比例为43-46％。3-7g葡萄糖：4.8-5.2g月桂酸时(具体可为5g葡萄糖：5g月桂酸)，scl-co-mclpha中3hdd的摩尔比例为75-80％。月桂酸时，scl-co-mclpha中3hdd的摩尔比例为89-95％。18-22g葡萄糖：0.8-1.0g癸酸时(具体可为20g葡萄糖：0.89g癸酸)，scl-co-mclpha中3hd的摩尔比例为3-6％。18-22g葡萄糖：1.6-1.9g癸酸时(具体可为20g葡萄糖：1.77g癸酸)，scl-co-mclpha中3hd的摩尔比例为23-27％。9-11g葡萄糖：4-6g癸酸时(具体可为10g葡萄糖：4.43g癸酸)，scl-co-mclpha中3hd的摩尔比例为57-60％。4-6g葡萄糖：4-6g癸酸时(具体可为5g葡萄糖：4.43g癸酸)，scl-co-mclpha中3hd的摩尔比例为70-75％。癸酸时，scl-co-mclpha中3hd的摩尔比例为90-95％。18-22g葡萄糖：1.8-2.2g9-癸烯醇时(具体可为20g葡萄糖：2g9-癸烯醇)，scl-co-mclpha中3h9d的摩尔比例为9-12％。以上任一所述scl-co-mclpha为饱和的共聚物或不饱和的共聚物。以上任一所述scl-co-mclpha具体可为poly(3hb-co-mcl3ha)，即(3-羟基丁酸(3hb)与链长为八个碳以上的3-羟基脂肪酸(mcl3ha)的共聚物。链长为八个碳以上具体可为链长为10个碳或链长为12个碳。以上任一所述scl-co-mclpha具体可为聚3-羟基丁酸-3-羟基癸酸酯[p(3hb-co-3hd)]、聚3-羟基丁酸-3-羟基十二烷酸酯[p(3hb-co-3hdd)]、聚3-羟基丁酸-3-羟基-9-癸烯酸酯[p(3hb-co-3h9d)]等。所述特异dna分子或所述特异质粒可采用任何现有方法导入出发菌。例如，电转、化转、接合等。对于scl-co-mclpha中短链前体的来源，本发明中通过如下实现：向微生物中引入phb合成途径，以短链碳源底物为碳源，得到短链pha前体，特别是3hb。对于scl-co-mclpha中中长链前体的来源，本发明中通过如下实现：削弱微生物的β-氧化循环途径，利用中长链碳源底物为碳源，能够没有碳原子损失的得到对应碳链长度的中长链pha前体；抑制微生物中内源的脂肪酸从头合成途径，排除从头合成途径的干扰，保证mcl3ha前体结构的单一性和稳定性。对于将短链pha前体和中长链pha前体聚合形成scl-co-mclpha，特别是poly(3hb-co-mcl3ha)，本发明通过如下实现：敲除微生物內源的编码pha聚合酶的基因phac，替换为具有广泛聚合范围即低特异性的pha聚合酶基因，能够同时聚合3hb和mcl3ha前体。具体地，可以通过调节底物碳源浓度生产比例可控的scl-co-mclpha，还可以通过控制碳源的添加时间来生产poly(3hb-co-mcl3ha)随机共聚物或嵌段共聚物。本发明提供的重组菌和方法，对于生产比例可控的scl-co-mclpha具有重要意义。附图说明图1为质粒pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan的结构示意图。图2为质粒pk18mobsacb-phag的结构示意图。图3为实施例3中细胞干重测定和菌体pha含量以及各个单体含量的测定结果。图4为实施例3中的1hnmr图谱。图5为实施例4中细胞干重测定和菌体pha含量以及各个单体含量的测定结果。图6为实施例4中的1hnmr图谱。图7为实施例5中的1hnmr图谱。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。聚3-羟基丁酸酯标样：sigma–aldrich，usa.lot#bcbq3366v。phb代表聚3-羟基丁酸酯，phd代表聚3-羟基癸酸酯，phdd代表聚3-羟基十二烷酸酯。3hb代表3-羟基丁酸，3hhx代表3-羟基己酸，3ho代表3-羟基辛酸，3hd代表3-羟基癸酸，3hdd代表3-羟基十二烷酸。lb培养基(ph7.0-7.2)：含5g/l酵母提取物(购自英国oxid公司，产品目录号lp0021)、10g/l蛋白胨(购自英国oxid公司，产品目录号lp0042)、10g/lnacl，余量为水。p.entomophila为假单胞菌属(pseudomonasspp.)中的嗜虫假单胞菌。本发明发明人所在实验室，敲除了p.entomophilal48的β-氧化循环相关基因(削弱β-氧化循环)，获得了p.entomophilalac25，进一步敲除了p.entomophilalac25的phac1-phaz-phac2操纵子，获得了p.entomophilalac31。p.entomophilalac31具有氯霉素和氨苄青霉素抗性。实施例中制备种子液的方法如下：(1)菌种活化取保存于-80℃冰箱的菌种甘油管，划线接种至含50mg/l卡那霉素和100mg/l氨苄青霉素的lb培养基平板，30℃培养12-24h。(2)一级种子从完成步骤(1)的平板上挑取接单菌落，接种于20ml含50mg/l卡那霉素的液体lb培养基，30℃、200rpm振荡培养10-12h。(3)二级种子取步骤(2)得到的一级种子液，按照1％的接种量接种于20ml含50mg/l卡那霉素的液体lb培养基，30℃、200rpm振荡培养10-12h。实施例中冷冻干燥的方法：以葡萄糖作为唯一碳源进行发酵后，取30ml液相体系，10000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用水进行洗涤，然后进行冷冻干燥(将装有菌体沉淀的离心管先置于-80℃1h，再放入真空冷冻干燥仪中12h)，得到冷冻干燥产物；以葡萄糖和中长链脂肪酸(包括月桂酸、癸酸、9-癸烯醇等)共同作为碳源进行发酵后，取30ml液相体系，10000rpm离心10min，收集菌体沉淀，依次用无水乙醇和水进行洗涤，然后进行冷冻干燥(将装有菌体沉淀的离心管先置于-80℃中1h，再放入真空冷冻干燥仪中12h)，得到冷冻干燥产物。实施例中细胞干重以每升发酵后体系中的细胞干重计量。细胞干重的单位为g/l。细胞干重(cdw)＝(进行冷冻干燥后的离心管的重量-原空离心管的重量)÷0.03；进行冷冻干燥后的离心管的重量和原空离心管的重量，单位均为g；0.03代表0.03l。实施例中菌体pha含量以及各个单体含量的检测方法：冷冻干燥产物进行酯化反应，然后通过气相色谱法(gc)测定单体含量；酯化反应：取30-40mg冷冻干燥产物于酯化管中，加入2ml氯仿和2ml酯化液(含1g/l苯甲酸和3％浓硫酸的甲醇溶液)混匀，加盖密闭，100℃金属浴中酯化4小时；冷却至室温后，加入1ml蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层；待氯仿相与水完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析；取20-25mg的聚3-羟基丁酸酯(phb)、聚3-羟基十二烷酸酯(phdd)或聚3-羟基癸酸酯(phd)进行酯化反应后作为标准样品；气相色谱(gc)分析参数：在岛津gc-2014型气相色谱仪中使用hp-5型色谱柱分离被测物质；进样口、检测器温度分别为240℃、150℃；色谱柱温度按照以下条件变化：80℃，1.5min；80℃+30℃/min，升温至140℃；140℃+40℃/min，升温至240℃；240℃，2min；通过定量比较待测样品和标准样品在相同保留时间下的出峰面积计算各个单体的质量；pha的含量(wt％)＝(3hb的质量+3hhx的质量+3ho的质量+3hd的质量+3hdd的质量)÷冷冻干燥产物的质量×100％；3hb的含量(mol％)＝3hb的摩尔数÷(3hb的摩尔数+3hhx的摩尔数+3ho的摩尔数+3hd的摩尔数+3hdd的摩尔数)×100％；3hhx的含量、3ho的含量、3hd的含量、3hdd的含量的计算方法参见3hb的含量。实施例1、制备重组假单胞菌一、制备质粒pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan制备质粒pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan，如序列表的序列1所示。质粒pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan的结构示意图如图1所示，为环形质粒。序列表的序列1中，第33-428位核苷酸为pre启动子，第464-2143位核苷酸为phac61-3基因，第2228-3409位核苷酸为phaa基因，第3484-4224位核苷酸为phab基因，第4780-5574位核苷酸为卡那霉素抗性基因。二、制备p.entomophilalac31(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)1、将质粒pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan导入大肠杆菌s17-1，得到重组菌，命名为e.colis17-1(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)。2、将e.colis17-1(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)和p.entomophilalac31在lb培养基平板上共培养(30℃、6h)，然后挑取菌苔，划线接种于含50mg/l卡那霉素和100mg/l氨苄青霉素的lb培养基平板，30℃培养过夜。3、完成步骤2后，挑取平板上的单克隆，接种至含有含50mg/l卡那霉素的液体lb培养基，30℃、200rpm振荡培养。得到导入质粒pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan的重组假单胞菌，命名为p.entomophilalac31(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)。三、制备质粒pk18mobsacb-phag制备质粒pk18mobsacb-phag，如序列表的序列2所示。质粒pk18mobsacb-phag的结构示意图如图2所示，为环形质粒。序列表的序列2中，第5671-6692核苷酸和第1-400位核苷酸组成sacb基因，第2859-3333位核苷酸为h1同源臂，第3334-3833位核苷酸为h2同源臂，第4385-5179位核苷酸为卡那霉素抗性基因。p.entomophilalac31的基因组dna中的phag基因及其周边序列如序列表的序列3所示，其中第808-1692位核苷酸为phag基因的开放阅读框。质粒pk18mobsacb-phag与p.entomophilalac31的基因组dna发生同源重组后，重组假单胞菌的基因组dna缺失了序列表的序列3第808-1692位核苷酸所示的dna分子。四、制备p.entomophilalac321、将质粒pk18mobsacb-phag导入大肠杆菌s17-1，得到重组菌，命名为e.colis17-1(pk18mobsacb-phag)。2、将e.colis17-1(pk18mobsacb-phag)和p.entomophilalac31在lb培养基平板上共培养(30℃、6h)，然后挑取菌苔，划线接种于含50mg/l卡那霉素和100mg/l氨苄青霉素的lb培养基平板，30℃培养过夜。3、完成步骤2后，挑取平板上的菌苔，划线接种至含有70g/l蔗糖、100mg/l氨苄青霉素的lb培养基平板上进行培养(30℃、12h；携带含有sacb基因的质粒的重组菌会在高浓度蔗糖中致死)，然后挑取单菌落，进行菌落pcr鉴定，pcr鉴定为阳性的菌株即为基因组dna中缺失了序列表的序列3第808-1692位核苷酸所示的dna分子的目标重组假单胞菌，命名为p.entomophilalac32。菌落pcr鉴定的方法：采用phag-ko-test-f和phag-ko-test-r组成的引物对对基因组dna进行pcr扩增，如果得到978bp的扩增产物，pcr鉴定为阳性。phag-ko-test-f:ttgcatcgggagcgtatg；phag-ko-test-r:acgttaccggaacgtcatgc。五、制备p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)1、将质粒pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan导入大肠杆菌s17-1，得到重组菌，命名为e.colis17-1(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)。2、将e.colis17-1(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)和p.entomophilalac32在lb培养基平板上共培养(30℃、6h)，然后挑取菌苔，划线接种于含50mg/l卡那霉素和100mg/l氨苄青霉素的lb培养基平板，30℃培养过夜。3、完成步骤2后，挑取平板上的单克隆，接种至含有含50mg/l卡那霉素的液体lb培养基，30℃、200rpm振荡培养。得到导入质粒pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan的重组假单胞菌，命名为p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)。实施例2、应用重组假单胞菌生产p(3hb-co-3hdd)一、应用p.entomophilalac31(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)1、制备p.entomophilalac31(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)的种子液。2、以葡萄糖为唯一碳源进行发酵取2.5ml步骤1得到的种子液，接种于47.5ml发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48小时。发酵培养基：含50mg/l卡那霉素和25g/l葡萄糖的lb培养基。3、以葡萄糖和月桂酸为碳源进行发酵取2.5ml步骤1得到的种子液，接种于47.5ml发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48小时。发酵培养基：含50mg/l卡那霉素、20g/l葡萄糖和5g/l月桂酸的lb培养基。4、细胞干重测定和菌体pha含量以及各个单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。气相色谱图谱显示，以葡萄糖为唯一碳源得到的待测样品具有两个峰，依次对应于phb的酯化产物的出峰位置(位置甲)、phd的酯化产物的出峰位置(位置乙)。气相色谱图谱表明，待测样品中仅含有3hb和3hd，不含有3hhx、3ho、3hdd等其他pha单体组分。气相色谱图谱显示，以葡萄糖和月桂酸为碳源得到的待测样品具有三个峰，依次对应于phb的酯化产物的出峰位置(位置甲)、phd的酯化产物的出峰位置(位置乙)、phdd的酯化产物的出峰位置(位置丙)。气相色谱图谱表明，待测样品中仅含有3hb、3hd和3hdd，不含有3hhx、3ho等其他pha单体组分。结果见表1。p.entomophilalac31(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)在以葡萄糖为唯一碳源时能够聚合生成phb，在以葡萄糖和月桂酸为混合碳源时能够同时聚合3hb单体和3hdd单体(3hdd与底物月桂酸有相同碳原子数，即底物月桂酸通过削弱的β-氧化循环途径产生3hdd单体)。证明了外源引入phb合成途径(由phaa-phab基因编码)能够成功利用葡萄糖生成3hb单体，底物月桂酸能够通过削弱的β-氧化循环途径产生3hdd单体，并且phac61-3聚合酶具备底物低特异性，能够同时聚合scl单体和mcl单体，由此合成scl-co-mclpha。在以葡萄糖为唯一碳源时，有少量的3hd生成，一定程度上影响了p.entomophilalac31(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)合成的scl-co-mclpha的成分组成的单一性和稳定性。表1二、p.entomophilalac31(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)和p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)的比较供试假单胞菌为p.entomophilalac31(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)或p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)。1、制备供试假单胞菌的种子液。2、以葡萄糖为唯一碳源进行发酵取2.5ml步骤1得到的种子液，接种于47.5ml发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48小时。发酵培养基：含50mg/l卡那霉素和25g/l葡萄糖的lb培养基。3、细胞干重测定和菌体pha含量以及各个单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。气相色谱图谱显示，对于两种供试假单胞菌，以葡萄糖为唯一碳源得到的待测样品均具有两个峰，依次对应于phb标样的酯化产物的出峰位置(位置甲)、phd标样的酯化产物的出峰位置(位置乙)。气相色谱图谱表明，待测样品中仅含有3hb和3hd，不含有3hhx、3ho、3hdd等其他pha单体组分。结果见表2。以葡糖糖作为唯一碳源时，与p.entomophilalac31(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)相比，p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)菌体pha中3hd的含量减少了约90％。由于p.entomophilalac32合成的pha中3hd极少，可以认为，p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)能够合成与底物碳原子数一致的pha，不存在其他单体成分对材料性质的的干扰。表2实施例3、用p.entomophilalac32合成不同比例的p(3hb-co-3hdd)1、制备p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)的种子液。2、进行发酵取2.5ml步骤1得到的种子液，接种于47.5ml发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48小时。发酵培养基为以下任一：发酵培养基20g：含50mg/l卡那霉素和20g/l葡萄糖的lb培养基；发酵培养基20g+0.5c12：含50mg/l卡那霉素、20g/l葡萄糖和0.5g/l月桂酸的lb培养基；发酵培养基20g+1c12：含50mg/l卡那霉素、20g/l葡萄糖和1g/l月桂酸的lb培养基；发酵培养基15g+2c12：含50mg/l卡那霉素、15g/l葡萄糖和2g/l月桂酸的lb培养基；发酵培养基5g+5c12：含50mg/l卡那霉素、5g/l葡萄糖和5g/l月桂酸的lb培养基；发酵培养基5c12：含50mg/l卡那霉素和5g/l月桂酸的lb培养基。3、细胞干重测定和菌体pha含量以及各个单体含量的测定。气相色谱图谱显示，以葡萄糖为唯一碳源得到的待测样品均具有两个峰，依次对应于phb的酯化产物的出峰位置(位置甲)、phd的酯化产物的出峰位置(位置乙)。气相色谱图谱表明，待测样品中仅含有3hb和3hd，但3hd的含量为5‰以下可忽略不计，不含有3hhx、3ho、3hdd等其他pha单体组分。气相色谱图谱显示，以葡萄糖和月桂酸为碳源得到的待测样品均具有三个峰，依次对应于phb的酯化产物的出峰位置(位置甲)、phd的酯化产物的出峰位置(位置乙)、phdd的酯化产物的出峰位置(位置丙)。气相色谱图谱表明，待测样品中仅含有3hb、3hd和3hdd，但3hd的含量为5‰以下可忽略不计，不含有3hhx、3ho等其他pha单体组分。气相色谱图谱显示，以月桂酸为唯一碳源得到的待测样品均具有三个峰，依次对应于phb的酯化产物的出峰位置(位置甲)、phd的酯化产物的出峰位置(位置乙)、phdd的酯化产物的出峰位置(位置丙)。气相色谱图谱表明，待测样品中仅含有3hb、3hd和3hdd，但3hd的含量为5‰以下可忽略不计，不含有3hhx、3ho等其他pha单体组分。结果见图3。p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)，通过改变两种底物碳源(葡萄糖和月桂酸)的比例，能够生成不同单体比例的p(3hb-co-3hdd)，3hdd的摩尔比例基本上能够达到从0至100％任意调节。4、nmr证实p(3hb-co-3hdd)的合成发酵后进行冷冻干燥，然后进行pha的提取和纯化，然后进行nmr检测，分析pha的化学组成和结构。提取方法(采用soxtectm2050索式提取仪)：5g左右经过冷冻干燥的细胞沉淀，装入提取滤纸筒(soxhletextractionthimbles)，然后将滤纸浸入装有60ml三氯甲烷的提取筒(以三氯甲烷作为萃取剂)，打开冷却水，设定仪器程序(依次进行110℃加热3.5h、淋洗2h、挥发1h，共计9h)，结束后放出残液，关闭冷却水。纯化方法：向金属筒中加入10-20ml三氯甲烷以完全溶解金属筒中的pha，转移到大烧杯，边搅拌边缓慢加入三氯甲烷10倍体积的无水乙醇，搅拌30min后，静置析出pha颗粒，然后10000rpm离心10min，去除上清液，转移白色絮状物至玻璃平皿，在通风橱处晾干，得到纯化产物。nmr检测参数：使用日本jeol公司的核磁共振仪jnm-eca300测定1h氢谱，以1ml氘代氯仿(cdcl3)溶解10-20mg纯化产物，以四甲基硅烷(tms)作为化学位移的标准品。采用发酵培养基15g+2c12时，1hnmr图谱见图4中的右图。p(3hb-co-3hdd)中3hb和3hdd所有的不同化学环境的h原子都可以在1hnmr图谱得到证实存在，说明用p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)成功合成了p(3hb-co-3hdd)。p(3hb-co-3hdd)的结构式如图4中的左图所示。采用发酵培养基20g+0.5c12、发酵培养基20g+1c12、发酵培养基5g+5c12、发酵培养基5c12得到的产物也均为p(3hb-co-3hdd)。实施例4、用重组假单胞菌生产p(3hb-co-3hd)1、制备p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)的种子液。2、进行发酵取2.5ml步骤1得到的种子液，接种于47.5ml发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48小时。发酵培养基为以下任一：发酵培养基20g：含50mg/l卡那霉素、20g/l葡萄糖的lb培养基；发酵培养基20g+0.89c10：含50mg/l卡那霉素、20g/l葡萄糖和0.89g/l癸酸的lb培养基。发酵培养基15g+1.77c10：含50mg/l卡那霉素、20g/l葡萄糖和1.77g/l癸酸的lb培养基。发酵培养基10g+4.43c10：含50mg/l卡那霉素、10g/l葡萄糖和4.43g/l癸酸的lb培养基。发酵培养基5g+4.43c10：含50mg/l卡那霉素、5g/l葡萄糖和4.43g/l癸酸的lb培养基。发酵培养基4.43c10：含50mg/l卡那霉素和4.43g/l癸酸的lb培养基。3、细胞干重测定和菌体pha含量以及各个单体含量的测定。结果见图5。p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)，通过改变两种底物碳源(葡萄糖和癸酸)的比例，能够生成不同单体比例的p(3hb-co-3hd)，且3hd的摩尔比例基本上能够达到从0至100％任意调节。4、nmr证实p(3hb-co-3hdd)的合成发酵后进行冷冻干燥，然后进行pha的提取和纯化，然后进行nmr检测，分析pha的化学组成和结构。方法同实施例3的步骤4。采用发酵培养基10g+4.43c10时，1hnmr图谱见图6中的右图。p(3hb-co-3hd)中3hb和3hd所有的不同化学环境的h原子都可以在1hnmr图谱得到证实存在，说明用p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)成功合成了p(3hb-co-3hd)。p(3hb-co-3hd)的结构式如图6的左图所示。采用发酵培养基20g+0.89c10、发酵培养基15g+1.77c10、发酵培养基5g+4.43c10、发酵培养基4.43c10得到的产物也均为p(3hb-co-3hd)。实施例5、用重组假单胞菌生产p(3hb-co-3h9d)1、制备p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)的种子液。2、进行发酵取2.5ml步骤1得到的种子液，接种于47.5ml发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48小时。发酵培养基：含50mg/l卡那霉素、20g/l葡萄糖和2g/l9-癸烯醇的lb培养基。3、nmr证实p(3hb-co-3h9d)的合成发酵后进行冷冻干燥，然后进行pha的提取和纯化，然后进行nmr检测，分析pha的化学组成和结构。方法同实施例3的步骤4。1hnmr图谱见图7中的右图。p(3hb-co-3h9d)中3hb和3h9d所有的不同化学环境的h原子都可以在1hnmr图谱得到证实存在，尤其是在5.7ppm左右的标志性的特征峰也证实了双键的存在，说明用p.entomophilalac32(pseva341-pre-phac61-3-phaa-phab-kan)成功合成了p(3hb-co-3h9d)。不饱和双键基团的引入大大增加了材料后期化学修饰的可能性，含有双键的scl-co-mclpha有望为pha的高附件值应用奠定基础。p(3hb-co-3h9d)的结构式如图7的左图所示。实施例6、构建其他重组菌株生产短中长链聚羟基脂肪酸共聚物poly(3hb-co-mcl3ha)假单胞菌属菌株是天然的mclpha生产菌，典型的假单胞菌如p.putida、p.aeruginosa、p.fluorescens、p.oleovorans和p.stutzeri等，可以通过相同的基因操作(削弱β-氧化循环途径，抑制内源脂肪酸从头合成途径，引入phb合成途径关键基因phaa和phab，并用低特异性的phac替换内源的phac)获得工程菌，在相同的培养条件下[30℃；lb培养基中添加糖(如葡萄糖、蔗糖或甘油等)和相应中长链脂肪酸(或醇、或烷烃)作为混合碳源]生产poly(3hb-co-mcl3ha)。嗜盐单胞菌,如h.bluephagenesis、h.campeniesis、h.alkaliphila、h.smymensis和h.levan等,也可以通过相同的基因操作(削弱β-氧化循环途径，抑制内源脂肪酸从头合成途径，引入phb合成途径关键基因phaa和phab，并用低特异性的phac替换内源的phac)获得工程菌，只需略微调整培养条件(37℃；培养基中所需nacl的浓度为60g/l，如mm60培养基)即可生产poly(3hb-co-mcl3ha)。嗜盐单胞菌能达到更高的cdw和pha含量。mm60培养基：2g/l酵母提取物，60g/lnacl，其余为水，溶解后高压灭菌；冷却后每50ml加入1ml组分i(10g(nh4)2so4和2gmgso4加水定容至200ml，高压蒸汽灭菌)和1ml组分ii(96.5gna2hpo4·12h2o和15gkh2po4，加水定容至200ml，高压蒸汽灭菌)；最后用5m的naoh水溶液将体系的ph值调整为约9.0。野生型嗜盐单胞菌h.bluephagenesis，采用37℃、mm60液体培养基生产poly(3hb-co-mcl3ha)的相应结果见表3。其他参数参见前述实施例。表3野生型嗜盐单胞菌h.bluephagenesis于mm60液体培养基的摇瓶培养的结果检测菌株碳源cdw(g/l)phb(wt％)h.bluephagenesistd01葡萄糖30g/l11.27±0.0579.41±0.56以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。sequencelisting<110>清华大学<120>一种微生物生产短中长链聚羟基脂肪酸共聚物的方法<130>cggnqayx-186093<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>7930<212>dna<213>artificialsequence<400>1ttaattaaagcggataacaatttcacacaggatcgcctatgctctggggcctcggcagat60gcgagcgctgcataccgtccggtaggtcgggaagcgtgcagtgccgaggcggattcccgc120attgacagcgcgtgcgttgcaaggcaacaatggactcaaatgtctcggaatcgctgacga180ttcccaggtttctccggcaagcatagcgcatggcgtctccatgcgagaatgtcgcgcttg240ccggataaaaggggagccgctatcggaatggacgcaagccacggccgcagcaggtgcggt300cgagggcttccagccagttccagggcagatgtgccggcagaccctcccgctttgggggag360gcgcaagccgggtccattcggatagcatctccccatgcaaagtgccggccagggcaatgc420ccggagccggttcgaatagtgacggcagagagacaatcaaatcatgagtaacaagaatag480cgatgacttgaatcgtcaagcctcggaaaacaccttggggcttaaccctgtcatcggcct540gcgtggaaaagatctgctgacttctgcccgaatggttttaacccaagccatcaaacaacc600cattcacagcgtcaagcacgtcgcgcattttggcatcgagctgaagaacgtgatgtttgg660caaatcgaagctgcaaccggaaagcgatgaccgtcgtttcaacgaccccgcctggagtca720gaacccactctacaaacgttatctacaaacctacctggcgtggcgcaaggaactccacga780ctggatcggcaacagcaaactgtccgaacaggacatcaatcgcgctcacttcgtgatcac840cctgatgaccgaagccatggccccgaccaacagtgcggccaatccggcggcggtcaaacg900cttcttcgaaaccggcggtaaaagcctgctcgacggcctcacacatctggccaaggacct960ggtaaacaacggcggcatgccgagccaggtggacatgggcgctttcgaagtcggcaagag1020tctggggacgactgaaggtgcagtggttttccgcaacgacgtcctcgaattgatccagta1080ccggccgaccaccgaacaggtgcatgagcgaccgctgctggtggtcccaccgcagatcaa1140caagttttatgtgtttgacctgagcccggataaaagcctggcgcgcttctgcctgagcaa1200caaccagcaaacctttatcgtcagctggcgcaacccgaccaaggcccagcgtgagtgggg1260tctgtcgacttacatcgatgcgctcaaagaagccgtcgacgtagtttccgccatcaccgg1320cagcaaagacatcaacatgctcggcgcctgctccggtggcattacctgcaccgcgctgct1380gggtcactacgccgctctcggcgagaagaaggtcaatgccctgacccttttggtcaccgt1440gctcgacaccaccctcgactcccaggttgcactgttcgtcgatgagaaaaccctggaagc1500tgccaagcgtcactcgtatcaggccggcgtgctggaaggccgcgacatggccaaagtctt1560cgcctggatgcgccctaacgacctgatctggaactactgggtcaacaactacctgctggg1620taacgagccaccggtcttcgacattcttttctggaacaacgacaccacccggttgcctgc1680tgcgttccacggcgatctgatcgaaatgttcaaaaataacccactggtgcgcgccaatgc1740actcgaagtgagcggcacgccgatcgacctcaaacaggtcactgccgacatctactccct1800ggccggcaccaacgatcacatcacgccctggaagtcttgctacaagtcggcgcaactgtt1860cggtggcaaggtcgaattcgtgctgtccagcagtgggcatatcaagagcattctgaaccc1920gccgggcaatccgaaatcacgttacatgaccagcaccgacatgccagccaccgccaacga1980gtggcaagaaaactcaaccaagcacaccgactcctggtggctgcactggcaggcctggca2040ggccgagcgctcgggcaaactgaaaaagtccccgaccagcctgggcaacaaggcctatcc2100gtcaggagaagccgcgccgggcacgtatgtgcatgaacgttaacgcttgcatgagtgccg2160gcgtgcgtcatgcacggcgccggcaggcctgcaggttccctcccgtttccattgaaagga2220ctacacaatgactgacgttgtcatcgtatccgccgcccgcaccgcggtcggcaagtttgg2280cggctcgctggccaagatcccggcaccggaactgggtgccgtggtcatcaaggccgcgct2340ggagcgcgccggcgtcaagccggagcaggtgagcgaagtcatcatgggccaggtgctgac2400cgccggttcgggccagaaccccgcacgccaggccgcgatcaaggccggcctgccggcgat2460ggtgccggccatgaccatcaacaaggtgtgcggctcgggcctgaaggccgtgatgctggc2520cgccaacgcgatcatggcgggcgacgccgagatcgtggtggccggcggccaggaaaacat2580gagcgccgccccgcacgtgctgccgggctcgcgcgatggtttccgcatgggcgatgccaa2640gctggtcgacaccatgatcgtcgacggcctgtgggacgtgtacaaccagtaccacatggg2700catcaccgccgagaacgtggccaaggaatacggcatcacacgcgaggcgcaggatgagtt2760cgccgtcggctcgcagaacaaggccgaagccgcgcagaaggccggcaagtttgacgaaga2820gatcgtcccggtgctgatcccgcagcgcaagggcgacccggtggccttcaagaccgacga2880gttcgtgcgccagggcgccacgctggacagcatgtccggcctcaagcccgccttcgacaa2940ggccggcacggtgaccgcggccaacgcctcgggcctgaacgacggcgccgccgcggtggt3000ggtgatgtcggcggccaaggccaaggaactgggcctgaccccgctggccacgatcaagag3060ctatgccaacgccggtgtcgatcccaaggtgatgggcatgggcccggtgccggcctccaa3120gcgcgccctgtcgcgcgccgagtggaccccgcaagacctggacctgatggagatcaacga3180ggcctttgccgcgcaggcgctggcggtgcaccagcagatgggctgggacacctccaaggt3240caatgtgaacggcggcgccatcgccatcggccacccgatcggcgcgtcgggctgccgtat3300cctggtgacgctgctgcacgagatgaagcgccgtgacgcgaagaagggcctggcctcgct3360gtgcatcggcggcggcatgggcgtggcgctggcagtcgagcgcaaataaggaaggggttt3420tccggggccgcgcgcggttggcgcggacccggcgacgataacgaagccaatcaaggagtg3480gacatgactcagcgcattgcgtatgtgaccggcggcatgggtggtatcggaaccgccatt3540tgccagcggctggccaaggatggctttcgtgtggtggccggttgcggccccaactcgccg3600cgccgcgaaaagtggctggagcagcagaaggccctgggcttcgatttcattgcctcggaa3660ggcaatgtggctgactgggactcgaccaagaccgcattcgacaaggtcaagtccgaggtc3720ggcgaggttgatgtgctgatcaacaacgccggtat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