高效利用脂肪酸合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用与流程

本发明涉及工业微生物的生物技术以及生物化工领域，具体涉及高效利用脂肪酸合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。

背景技术：

随着社会的发展，人类面临着能源短缺、资源紧张、环境恶化、经济衰退和气候变化等一系列严峻的挑战，生物制造、生物能源等新型产业正在兴起。生物技术较传统的化学品生产具有节能、减排、降耗的优势。通过对工业微生物菌株进行遗传改造，可以增强微生物细胞对原料的利用、提高产品转化率，从而降低生产成本。

甘氨酸(英文名为glycine)又名氨基乙酸，是结构最简单的α-氨基酸。它是一种非常重要的精细化工合成中间体，在医药、食品、农药以及饲料添加剂等领域都广泛应用。(1)在生物体内，甘氨酸是一些重要的小分子代谢物的合成前体，在饮食中加入适量的甘氨酸可以有效的治疗心血管疾病、炎症、肥胖、肿瘤以及糖尿病病人的代谢紊乱。(2)甘氨酸是盐酸地拉普利、草甘氨酸阿司匹林钙、扑热息痛甘氨酸盐、以及利血胺注射液等多种药物合成的中间体。(3)甘氨酸作为氨基酸强化剂、调味剂、甜味剂以及抗氧化剂广泛应用于食品行业。(4)甘氨酸是合成除草剂草甘膦的前体物质，该除草剂曾被美国政府评为最优秀的农药。

目前合成甘氨酸的方法主要有氯乙酸氨解法、施特雷克法(strecker)、催化脱氢氧化法、辐射合成法和生物合成法等。其中的生物合成法，在此之前有利用乙醇胺为底物，在好氧土壤杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属等微生物的作用下转化获得，也有利用假细胞菌属、酪蛋白菌属、产碱杆菌属等菌属将甘氨酰胺水解生成甘氨酸。虽然以上方法可以实现甘氨酸的生产，但是存在原料成本较高以及酶活较低，需要大量菌株的问题，使得生物转化仍需要建立一种更为廉价的原料路线。脂肪酸是一类具有高度还原状态的物质，经过β氧化生成大量的二碳物质乙酰辅酶a，然后通过乙醛酸循环得到乙醛酸最后生成甘氨酸，以脂肪酸(棕榈酸)为底物生成甘氨酸，其理论转化率能高达234.21％，显著高于葡萄糖，并且用于生物转化的脂肪酸原料可以以低廉的价格从油料粗加工产物、地沟油等来源获得，因此以脂肪酸为底物生产甘氨酸具有巨大的潜力。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何提高甘氨酸的合成效率。

为了解决上述技术问题，本发明通过增强脂肪酸摄入途径及脂肪酸β氧化途径提高了脂肪酸底物的利用能力，又通过改造初级代谢加强中间产物乙醛酸的积累、引入/增强甘氨酸合成途径所需的谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因的表达提高了甘氨酸的合成能力，同时改进了nadph、谷氨酸等辅助因子的供应进一步提高了甘氨酸的合成效率。提供了一种高效利用脂肪酸合成甘氨酸的重组大肠杆菌。

第一方面，本发明保护高效利用脂肪酸合成甘氨酸的重组大肠杆菌的构建方法。

本发明提供的高效利用脂肪酸合成甘氨酸的重组大肠杆菌的构建方法包括对受体菌进行(1)-(13)的改造或对受体菌进行(1)-(7)的改造，得到重组大肠杆菌的步骤；

(1)抑制所述受体菌中fadr基因的表达或/和抑制所述受体菌中fadr基因所编码的蛋白质即脂肪酸降解转录因子的活性；

(2)增强所述受体菌中stha基因的表达或/和增强所述受体菌中stha基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶的活性；

(3)抑制所述受体菌中pnta基因的表达或/和抑制所述受体菌中pnta基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶α亚基的活性；

(4)增强所述受体菌中fadl基因的表达或/和增强所述受体菌中fadl基因所编码的蛋白质即长链脂肪酸摄入外膜蛋白的活性；

(5)增强所述受体菌中脂肪酸β氧化途径所涉及的基因的表达或/和增强所述受体菌中脂肪酸β氧化途径所涉及的基因所编码的蛋白质的活性；

(6)增强所述受体菌中短链脂肪酸降解途径所涉及的基因的表达或/和增强所述受体菌中短链脂肪酸降解途径所涉及的基因所编码的蛋白质的活性；

(7)增强所述受体菌中外源alkl基因的表达或/和增强所述受体菌中外源alkl基因所编码的蛋白质即外源烷烃摄入外膜蛋白的活性；

(8)抑制所述受体菌中iclr基因的表达或/和抑制所述受体菌中iclr基因所编码的蛋白质即乙醛酸途径转录抑制因子的活性；

(9)抑制所述受体菌中aceb基因的表达或/和抑制所述受体菌中aceb基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶a的活性；

(10)抑制所述受体菌中glcb基因的表达或/和抑制所述受体菌中glcb基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶g的活性；

(11)增强所述受体菌中乙醛酸途径acea基因的表达或/和增强所述受体菌中乙醛酸途径acea基因所编码的蛋白质即异柠檬酸裂解酶的活性；

(12)增强所述受体菌中外源cgat基因的表达或/和增强所述受体菌中外源cgat基因所编码蛋白质即谷氨酸乙醛酸转氨酶ii的活性；

(13)增强所述受体菌中gdha基因的表达或/和增强所述受体菌中gdha基因所编码蛋白质即谷氨酸脱氢酶的活性。

上述方法中，fadr基因所编码的蛋白质即脂肪酸降解转录因子的氨基酸序列的genbank：np_415705.1(提交日期为2016年8月8日)。stha基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶的氨基酸序列的genbank：np_418396.1(提交日期为2016年8月8日)。pnta基因所编码的蛋白质即吡啶核苷酸转氢酶α亚基的氨基酸序列的genbank：np_416120.1(提交日期为2016年8月8日)。fadl基因所编码的蛋白质即长链脂肪酸摄入外膜蛋白的氨基酸序列的genbank：np_416846.2(提交日期为2016年8月8日)。外源alkl基因所编码的蛋白质即外源烷烃摄入外膜蛋白的氨基酸序列的genbank：ccg96306.1(提交日期2015年2月27日)。iclr基因所编码的蛋白质即乙醛酸途径转录抑制因子的氨基酸序列的genbank：np_418442.2(提交日期为2016年8月8日)。aceb基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶a的氨基酸序列的genbank：np_418438.1(提交日期为2016年8月8日)。glcb基因所编码的蛋白质即苹果酸合酶g的氨基酸序列的genbank：np_417450.1(提交日期为2016年8月8日)。acea基因所编码的蛋白质即异柠檬酸裂解酶的氨基酸序列的genbank：np_418439.1(提交日期为2016年8月8日)。gdha基因所编码蛋白质即谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列的genbank：np_416275.1(提交日期为2016年8月8日)。

上述方法中，所述(5)中，所述脂肪酸β氧化途径所涉及的基因选自如下一种或多种基因：编码脂酰辅酶a合酶的基因fadd、编码脂酰辅酶a脱氢酶的基因fade、编码3-羟酰辅酶a脱氢酶的基因fadb、编码3-酮脂酰辅酶a硫解酶的基因fada、编码3-酮脂酰辅酶a硫解酶的基因fadi、编码3-羟酰辅酶a脱氢酶的基因fadj和编码短链脂酰辅酶a合酶的基因fadk。在本发明的一个实施例中，所述脂肪酸β氧化途径所涉及的基因具体为编码脂酰辅酶a合酶的基因fadd。

上述方法中，所述(6)中，所述短链脂肪酸降解途径所涉及的基因选自如下基因簇所包含的基因：短链脂肪酸降解调控基因簇atosc、短链脂肪酸降解基因簇atodaeb。其中，所述短链脂肪酸降解调控基因簇atosc包含如下基因：编码atoc转录激活因子的基因atoc、编码atos感应组氨酸激酶的基因atos；所述短链脂肪酸降解基因簇atodaeb包含如下基因：编码乙酰乙酰辅酶a转移酶α亚基的基因atoa、编码乙酰乙酰辅酶a转移酶β亚基的基因atod、编码乙酰乙酸转运蛋白的基因atoe、编码乙酰辅酶a乙酰转移酶的基因atob。在本发明的一个实施例中，所述短链脂肪酸降解途径所涉及的基因具体为编码atoc转录激活因子的基因atoc和编码atos感应组氨酸激酶的基因atos。atoc基因所编码的atoc转录激活因子的氨基酸序列的genbank：nc_416724.1(提交日期为2016年8月8日)；atos基因所编码atos感应组氨酸激酶的氨基酸序列的genbank：nc_416723.1(提交日期为2016年8月8日)。

上述方法中，所述(7)中，增强所述受体菌中外源alkl基因的表达或/和增强所述受体菌中外源alkl基因所编码的蛋白质即外源烷烃摄入外膜蛋白的活性是指在所述受体菌中过表达外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkl。所述过表达的方法是通过将外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkl导入受体菌中来实现的。

所述外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkl可来源于除烃海杆菌(marinobacterhydrocarbonoclasticus)或铜绿假单胞菌(pseudomonasputida)。在本发明的一个实施例中，所述外源烷烃摄入外膜蛋白基因alkl具体来源于除烃海杆菌(marinobacterhydrocarbonoclasticus)，其序列如seqidno.4第15-686位所示。

上述方法中，所述(12)中，增强所述受体菌中外源cgat基因的表达或/和增强所述受体菌中外源cgat基因所编码蛋白质即谷氨酸乙醛酸转氨酶ii的活性是指在所述受体菌中过表达外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat。所述过表达的方法是通过将外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat导入受体菌中来实现的。

所述外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat有如下7种来源：甜菜(betavulgaris)、大豆(glycinemax)、菠菜(spinaciaoleracea)、番薯(ipomoeanil)、藜麦(chenopodiumquinoa)、烟草(nicotianaattenuata)和玉米(zeamays)。在本发明的一个实施例中，所述外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat分别为经过改造的来源于甜菜(betavulgaris)的谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(seqidno.2)、经过改造的来源于大豆(glycinemax)的谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(seqidno.5)、经过改造的来源于菠菜(spinaciaoleracea)的谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(seqidno.6)、经过改造的来源于番薯(ipomoeanil)的谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(seqidno.7)、经过改造的来源于藜麦(chenopodiumquinoa)的谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(seqidno.8)、经过改造的来源于烟草(nicotianaattenuata)的谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(seqidno.9)或经过改造的来源于玉米(zeamays)的谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(seqidno.10第1-1399位)。

上述方法中，所述(13)中，增强所述受体菌中gdha基因的表达或/和增强所述受体菌中gdha基因所编码蛋白质即谷氨酸脱氢酶的活性可为增强所述受体菌中内源谷氨酸脱氢酶基因gdha的表达，也可为在所述受体菌中过表达外源谷氨酸脱氢酶基因gdha。所述外源谷氨酸脱氢酶基因gdha可来源于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)或大肠杆菌(escherichiacoli)。在本发明的一个实施例中，所述外源谷氨酸脱氢酶gdha基因具体来源于大肠杆菌(escherichiacoli)。

上述方法中的抑制和增强可以通过本领域技术人员利用本领域熟知的手段实现，也可以是通过花费创造性劳动实现。

进一步的，所述(1)、(3)、(8)、(9)和(10)中，抑制基因表达的方法为将所述受体菌中的所述基因进行敲除。所述基因具体为fadr基因、pnta基因、iclr基因、aceb基因和glcb基因。

所述(2)、(4)、(5)、(6)、(11)和(13)中，增强基因表达的方法为将所述受体菌中的所述基因的启动子替换为cpa1启动子。所述基因为stha基因、fadl基因、fadd基因、atoc基因、atos基因、acea基因或gdha基因。

所述敲除和替换均可通过同源重组实现。

上述方法中，所述受体菌可为现有技术中常见的大肠杆菌(escherichiacoli)，如k系列、b系列和w系列的大肠杆菌。在本发明的一个实施例中，所述大肠杆菌具体为大肠杆菌bw25113。

上述方法中所涉及的步骤(1)-(13)的改造方法没有顺序要求，只要对受体菌完成(1)-(13)的改造或对受体菌完成(1)-(7)的改造即可得到本发明的高效利用脂肪酸合成甘氨酸的重组大肠杆菌。

上述方法构建的重组大肠杆菌也属于本发明的保护范围。

第二方面，本发明保护上述重组大肠杆菌的新用途。

本发明提供了上述重组大肠杆菌在生产甘氨酸中的应用。

第三方面，本发明保护一种生产甘氨酸的方法。

本发明提供的生产甘氨酸的方法是以脂肪酸为底物，采用上述重组大肠杆菌进行生物转化，合成甘氨酸。

上述生产甘氨酸的方法中，所述生物转化的方法为将上述重组大肠杆菌经阿拉伯糖诱导培养得到诱导后重组菌，用所述诱导后重组菌将脂肪酸底物转化合成甘氨酸。

所述阿拉伯糖诱导培养在阿拉伯糖浓度为0.2％的培养基中进行，所述诱导培养的温度可为30-37℃，所述诱导培养时间可为20-25小时。

进一步的，所述诱导培养的温度可为37℃，所述诱导培养时间可为24小时。

上述生产甘氨酸的方法中，所述脂肪酸为硬脂酸(c18)、棕榈酸(c16)、肉豆蔻酸(c14)、月桂酸(c12)、癸酸(c10)、辛酸(c8)或己酸(c6)。在本发明的一个实施例中，所述脂肪酸具体为棕榈酸(c16)。

本发明提供了一种以脂肪酸为原料合成甘氨酸的重组大肠杆菌工程菌株及方法。该重组大肠杆菌工程菌株，含有如下一种或多种遗传修饰：(1)脂肪酸摄入途径及脂肪酸β氧化途径的增强；(2)改造了乙醛酸循环相关基因靶点，增强了乙醛酸的合成能力；(3)引入/提高了谷氨酸乙醛酸转氨酶的表达；所述工程菌株具有将不同长度脂肪酸底物全细胞转化合成甘氨酸的能力，所述脂肪酸包括硬脂酸(c18)、棕榈酸(c16)、肉豆蔻酸(c14)、月桂酸(c12)、癸酸(c10)、辛酸(c8)、己酸(c6)。所述工程菌株的利用脂肪酸合成甘氨酸的能力使其具有工业生产甘氨酸产品的用途。利用该重组大肠杆菌工程菌株合成甘氨酸的方法在工业生产中能够以多种廉价的脂肪酸为原料进行发酵、转化；同时以脂肪酸为底物较葡萄糖具有更高的转化率，使甘氨酸的生产成本得到进一步降低。

附图说明

图1为以脂肪酸为原料的重组大肠杆菌工程菌株的甘氨酸产量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的大肠杆菌bw25113记载于文献：datsenkoka,wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.proc.natl.acad.sci.u.s.a.2000；97(12):6640-6645.中，是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

本发明具体包括如下实施例：

实施例1、重组大肠杆菌工程菌株fg11、fg12、fg13、fg14、fg15、fg16、fg17的构建

7个重组大肠杆菌工程菌株fg11、fg12、fg13、fg14、fg15、fg16、fg17的构建，包括以下二十六个步骤：

(1)脂肪酸降解转录因子fadr的敲除。

(1-a)首先制备含有大肠杆菌基因片段的p1噬菌体，所含有的基因片段具有fadr敲除性状。含有fadr敲除性状的大肠杆菌基因片段来自大肠杆菌菌株jw1176，该菌株为含有fadr敲除性状的w3110系列菌株，购自日本国立遗传学研究所(nig，japan)，其中的编码脂肪酸降解转录因子的基因fadr替换为两端带有frt位点的卡那霉素抗性基因(约1300bp)从而将fadr基因敲除(babat,arat,etal.constructionofescherichiacolik-12in-frame,single-geneknockoutmutants:thekeiocollection.mol.syst.biol.2006；2:2006.0008.)。p1噬菌体制备过程如下：将jw1176菌株37℃过夜培养后转接于含5mmol/lcacl2和0.1％葡萄糖的lb培养基中，37℃培养1h，然后加入野生型p1噬菌体继续培养1-3h。加几滴氯仿再培养几分钟，离心取上清即得到含有fadr敲除性状的大肠杆菌基因片段的噬菌体p1vir△fadr。

(1-b)利用p1噬菌体转导技术构建大肠杆菌菌株fg01-kan，具体步骤如下：过夜培养bw25113(受体菌)，1.5ml菌液10000g离心2min后，用0.75ml的p1盐溶液(溶剂为水，溶质为10mmcacl2和5mmmgso4)重悬bw25113菌体细胞，将100μl噬菌体p1vir△fadr与100μlbw25113细胞悬浮液混和，37℃孵育30min，然后加入1ml的lb培养基和200μl的1mol/l柠檬酸钠，37℃继续培养1h，离心收集菌体，用100μl的lb培养基重悬后，涂布含卡那霉素的lb平板(卡那霉素的浓度为50μg/ml)上，37℃培养过夜后，挑选克隆，用fadr-if/fadr-ir引物pcr扩增鉴定(扩增出1700bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为fg01-kan。

(1-c)抗性的消除：将pcp20质粒(购自clontech公司)通过氯化钙转化法转化至fg01-kan，在含有氨苄青霉素的lb平板30℃过夜培养后挑选克隆，得到含有质粒pcp20的重组大肠杆菌fg01-kan/pcp20。在含有氨苄青霉素抗性的lb培养基30℃培养后，涂布于无抗性lb平板上42℃培养过夜，挑选克隆，用fadr-if/fadr-ir引物pcr扩增鉴定(扩增出400bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为重组大肠杆菌fg01。

(2)通过启动子替换增强fadl基因的表达。

(2-a)含有pkd46质粒宿主菌的制备：将pkd46质粒(购自clontech公司)通过氯化钙转化法转化至上一步获得的fg01菌株中，在含有氨苄青霉素的lb平板30℃过夜培养后挑选克隆，得到含有质粒pkd46的重组大肠杆菌fg01/pkd46。重组大肠杆菌fg01/pkd46在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。然后通过10％甘油洗涤制备成fg01/pkd46感受态细胞。

(2-b)用于扩增替换启动子打靶基因片段的质粒的制备：cpa1-lox66-kan-lox71片段的核苷酸序列如seqidno.1，其中，组成型启动子pcpa1的核苷酸序列是seqidno.1的第1443-1622位，含有loxp侧翼的卡那霉素抗性基因(loxp-kan-loxp)的核苷酸序列是seqidno.1的第21-1433位。序列通过全基因合成(南京金士瑞生物科技有限公司)，连接在puc57载体上，获得载体puc57-9k。

(2-c)打靶片段fadlup-kan-cpa1-fadldown的制备：以puc57-9k为模板，采用引物fadl-pf/fadlfr扩增出fadlup-kan-cpa1-fadldown片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段(天根生化科技有限公司，产品目录为dp209)。

(2-d)同源重组：将上述fadlup-kan-cpa1-fadldown片段电转入(2-a)所制备的fg01/pkd46感受态细胞中，于含有卡那霉素(浓度为50μg/ml)的lb平板37℃过夜，挑选克隆，用fadl-pif/fadl-pir引物pcr扩增鉴定(扩增出2000bp目的带为阳性)，挑选阳性克隆命名为fg02-kan。

(2-e)抗性的消除：将pcp20质粒(购自clontech公司)通过氯化钙转化法转化至fg01-kan，在含有氨苄青霉素的lb平板30℃过夜培养后挑选克隆，得到含有质粒pcp20的重组大肠杆菌fg01-kan/pcp20。在含有氨苄青霉素抗性的lb培养基30℃培养后，涂布于无抗性lb平板上43℃培养过夜，挑选克隆，用fadl-pif/fadl-pir引物pcr扩增鉴定(扩增出600bp目的带为阳性)，同时用相应引物确定菌株是否保持了之前改造所获得的性状，挑选阳性克隆命名为重组大肠杆菌fg02。

(3)通过启动子替换增强fadd基因的表达。

从重组菌fg02出发，使用上文(2)部分的相同方法，将编码脂酰辅酶a合酶的基因fadd的启动子替换为cpa1启动子。获得重组大肠杆菌fg03。相关引物见表1，与(2)中对应引物的名称区别仅在于fadl变为fadd。

(4)通过启动子替换增强stha基因的表达。

从重组菌fg03出发，使用上文(2)部分的相同方法，将编码脂酰辅酶a合酶的基因stha的启动子替换为cpa1启动子。获得重组大肠杆菌fg04。相关引物见表1，与(2)中对应引物的名称区别仅在于fadl变为stha。

(5)吡啶核苷酸转氢酶α亚基pnta的敲除

从重组菌fg04出发，使用上文(1)部分的相同方法，将吡啶核苷酸转氢酶阿尔法亚基pnta敲除。获得重组大肠杆菌fg05。其中与(1)部分中使用菌株、引物名称区别在于：含有pnta敲除性状的大肠杆菌菌株变为jw1595(该菌株购自日本国立遗传学研究所)；对应引物的名称中由fadr变为pnta。

(6)通过启动子替换增强atos基因和atoc基因的表达。

从重组菌fg05出发，使用上文(2)部分的相同方法，将短链脂肪酸降解调控基因簇atosc的启动子替换为cpa1启动子。获得重组大肠杆菌fg06。相关引物见表1，与(2)中对应引物的名称区别仅在于fadl变为atosc。

(7)通过启动子替换增强谷氨酸脱氢酶gdha基因的表达。

从重组菌fg06出发，使用上文(2)部分的相同方法，将谷氨酸脱氢酶的启动子替换为cpa1启动子。获得重组大肠杆菌fg07。相关引物见表1，与(2)中对应引物的名称区别仅在于fadl变为gdha。

(8)乙醛酸途径转录抑制因子基因iclr的敲除。

从重组菌fg07出发，使用上文(1)部分的相同方法，将乙醛酸途径转录抑制因子基因iclr敲除。获得重组大肠杆菌fg08。其中与(1)部分中使用菌株、引物名称区别在于：含有iclr敲除性状的大肠杆菌菌株变为jw3978(该菌株购自日本国立遗传学研究所)；对应引物的名称中由fadr变为iclr。

(9)苹果酸合酶a基因aceb的敲除及通过启动子替换增强acea基因的表达。

从重组菌fg08出发，使用上文(2)部分的相同方法，将编码异柠檬酸裂解酶的基因acea的启动子替换为cpa1的同时将苹果酸合酶a基因aceb敲除，获得重组大肠杆菌fg09。其中与(2)部分中使用引物名称区别在于：对应引物的名称中由fadl变为acea。

(10)苹果酸合酶g基因glcb的敲除。

从重组菌fg09出发，使用上文(1)部分的相同方法，将苹果酸合酶g基因glcb敲除，获得大肠杆菌fg10。其中与(1)部分中使用菌株、引物名称区别在于：含有glcb敲除性状的大肠杆菌菌株变为jw3179(该菌株购自日本国立遗传学研究所)；对应引物的名称中由fadr变为glcb。

(11)过表达甜菜(betavulgaris)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat的质粒的构建。

(11-a)loc104897276基因的pcr扩增。经过改造的甜菜(betavulgaris)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat的核苷酸序列如seqidno.2。序列通过全基因合成，连接在puc57载体上，获得载体puc57-cgat(bvu)。以cgat(bvu)-f和cgat(bvu)-r为引物，载体puc57-cgat(bvu)质粒为模板，用高保真transstartfastpfudna聚合酶(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为ap221)pcr扩增出cgat(bvu)基因片段。

(11-b)构建含有cgat(bvu)基因的重组表达载体。将上述(11-a)得到的pcr扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段；同时用ncoi和xhoi酶切载体psb1s(载体psb1s核苷酸序列如seqidno.3)，回收载体大片段sb1s-nx。用gibson组装方法(gibsondg,youngl,etal.enzymaticassemblyofdnamoleculesuptoseveralhundredkilobases.nat.methods.2009；6(5):343-345)将上述cgat(bvu)片段与sb1s-nx片段进行连接反应。用cacl2法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为cd201)。涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑选克隆，用引物f105-f/cgat(bvu)-r鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，挑选阳性克隆提取质粒，并将获得阳性质粒命名为psb1s-cgat(bvu)。

(12)过表达除烃海杆菌外源烷烃摄入外膜蛋白基因mhalkl的质粒的构建。

使用上文(11)部分的相同方法，从除烃海杆菌(marinobacterhydrocarbonoclasticus)中提取dna，用引物mhalkl-f/mhalkl-r扩增mhalkl基因片段，同时将rbs序列引入在引物中。用xhoi和spei酶切载体psb1s-cgat(bvu)获得大片段sb1s-cgat(bvu)-hs。将mhalkl片段与sb1s-cgat(bvu)-hs片段进行连接反应。转化大肠杆菌dh5α，用引物mhalkl-f/t58鉴定能够扩增出目的片段的克隆并测序，筛选阳性克隆，并将获得的阳性质粒命名为psb1s-cgat(bvu)-mhalkl。含有rbs的mhalkl的核苷酸序列如seqidno.4，其中rbs序列如seqidno.4第2-7位所示，mhalkl的核苷酸序列如seqidno.4第15-686位所示。

(13)重组大肠杆菌fg11的构建。

将菌株fg10制备感受态细胞，将质粒psb1s-cgat(bvu)-mhalkl用cacl2法转化fg10。涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑选阳性克隆命名为重组大肠杆菌fg11。

(14)过表达大豆(glycinemax)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat和外源烷烃摄入外膜蛋白基因mhalkl的质粒的构建。

使用上文(11)部分的相同方法，经过改造的大豆(betavulgaris)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(gma)的核苷酸序列如seqidno.5，构建质粒psb1s-cgat(gma)-mhalkl。相关引物见表1，与(2)中对应引物的名称区别仅在于cgat(bvu)变为cgat(gma)。

(15)重组大肠杆菌fg12的构建。

将菌株fg10制备感受态细胞，将质粒psb1s-cgat(gma)-mhalkl用cacl2法转化fg10。涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑选阳性克隆命名为重组大肠杆菌fg12。

(16)过表达菠菜(spinaciaoleracea)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat和外源烷烃摄入外膜蛋白基因mhalkl的质粒的构建。

使用上文(11)部分的相同方法，经过改造的菠菜(spinaciaoleracea)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(sol)的核苷酸序列如seqidno.6所示，构建质粒psb1s-cgat(sol)-mhalkl。相关引物见表1，与(2)中对应引物的名称区别仅在于cgat(bvu)变为cgat(sol)。

(17)重组大肠杆菌fg13的构建。

将菌株fg10制备感受态细胞，将质粒psb1s-cgat(sol)-mhalkl用cacl2法转化fg10。涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑选阳性克隆命名为重组大肠杆菌fg13。

(18)过表达番薯(ipomoeanil)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat和外源烷烃摄入外膜蛋白基因mhalkl的质粒的构建。

使用上文(11)部分的相同方法，经过改造的番薯(ipomoeanil)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(ini)的核苷酸序列如seqidno.7所示，构建质粒psb1s-cgat(ini)-mhalkl。相关引物见表1，与(2)中对应引物的名称区别仅在于cgat(bvu)变为cgat(ini)。

(19)重组大肠杆菌fg14的构建。

将菌株fg10制备感受态细胞，将质粒psb1s-cgat(ini)-mhalkl用cacl2法转化fg10。涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑选阳性克隆命名为重组大肠杆菌fg14。

(20)过表达藜麦(chenopodiumquinoa)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat和外源烷烃摄入外膜蛋白基因mhalkl的质粒的构建。

使用上文(11)部分的相同方法，经过改造的藜麦(chenopodiumquinoa)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(cqu)的核苷酸序列如seqidno.8所示，构建质粒psb1s-cgat(cqu)-mhalkl。相关引物见表1，与(2)中对应引物的名称区别仅在于cgat(bvu)变为cgat(cqu)。

(21)重组大肠杆菌fg15的构建。

将菌株fg10制备感受态细胞，将质粒psb1s-cgat(cqu)-mhalkl用cacl2法转化fg10。涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑选阳性克隆命名为重组大肠杆菌fg15。

(22)过表达烟草(nicotianaattenuata)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat和外源烷烃摄入外膜蛋白基因mhalkl的质粒的构建。

使用上文(11)部分的相同方法，经过改造的烟草(nicotianaattenuata)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(nat)的核苷酸序列如seqidno.9所示，构建质粒psb1s-cgat(nat)-mhalkl。相关引物见表1，与(2)中对应引物的名称区别仅在于cgat(bvu)变为cgat(nat)。

(23)重组大肠杆菌fg16的构建。

将菌株fg10制备感受态细胞，将质粒psb1s-cgat(nat)-mhalkl用cacl2法转化fg10。涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑选阳性克隆命名为重组大肠杆菌fg16。

(24)过表达玉米(zeamays)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat和外源烷烃摄入外膜蛋白基因mhalkl的质粒的构建。

使用上文(11)部分的相同方法，经过改造的玉米(zeamays)外源谷氨酸乙醛酸转氨酶ii基因cgat(zma)的核苷酸序列如seqidno.10所示，构建质粒psb1s-cgat(zma)-mhalkl。相关引物见表1，与(2)中对应引物的名称区别仅在于cgat(bvu)变为cgat(zma)。

(25)重组大肠杆菌fg17的构建。

将菌株fg10制备感受态细胞，将质粒psb1s-cgat(zma)-mhalkl用cacl2法转化fg10。涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑选阳性克隆命名为重组大肠杆菌fg17。

(26)重组大肠杆菌fg00的构建。

将菌株fg10制备感受态细胞，将质粒psb1s用cacl2法转化fg10。涂布于含链霉素的lb平板上，37℃培养过夜。挑选阳性克隆命名为重组大肠杆菌fg00。

表1、引物序列列表

实施例2、利用重组大肠杆菌菌株fg11、fg12、fg13、fg14、fg15、fg16、fg17以脂肪酸为原料生产甘氨酸

(27)a培养基成分。

a培养基的溶剂为水，溶质及其终浓度分别如下：

nahpo4：25mm

kh2po4：25mm

nh4cl：50mm

na2so4：5mm

mgso4：2mm

甘油：0.5％

酵母粉：0.5％

微量元素：50μmfecl3，20μmcacl2，10μmmncl2，10μmznso4，2μmcocl2，2μmnicl2，2μmna2mo4，2μmna2seo3和2μmh3bo3。

(28)b培养基成分。

b培养基成分是在a培养基成分基础上，还含有棕榈酸0.5％，聚氧乙烯醚brij58乳化剂0.2％。

(29)c培养基成分。

c培养基成分是在a培养基成分基础上，还含有棕榈酸0.5％，聚氧乙烯醚brij58乳化剂0.2％，nh4cl10g/l。

(29)菌体的培养和酶的诱导。

将过夜培养的工程菌株fg00、fg11、fg12、fg13、fg14、fg15、fg16、fg17按1％接种量分别接种于含20mla培养基的摇瓶中，培养基添加链霉素，37℃培养12h后收集菌体。转接于含20mlb培养基的摇瓶中，37℃培养6h后，加入终浓度为0.2％的阿拉伯糖诱导24h。收集菌体。

(30)甘氨酸的全细胞催化。

将上述收集的菌体重悬于含20mlc培养基的摇瓶中，37℃培养24h后，取300μl样品离心取上清过滤。于hplc检测甘氨酸含量。高效液相色谱检测仪器及检测条件如下：

检测仪器：shimadzulc-20at

检测条件：流动相a：10mmkh2po4；流动相b：乙腈-甲醇-水溶液(体积比45:45:10)；检测波长360nm；检测时间：35min；检测温度：40℃；流速：1ml/min；色谱柱：extnd-c18(5μm，4.6mmi.d.×250mm)；梯度洗脱：1min12％b；2.5min12％b；2.51min16％b；13min36％b；13.01min38％b；25min100％b；28min100％b；28.01min10％b；35min控制器停止。

结果如图1所示。fg11、fg12、fg13、fg14、fg15、fg16、fg17的甘氨酸产量分别为1.96g/l、1.54g/l、1.64g/l、1.67g/l、3.17g/l、2.34g/l、1.41g/l。

将300μl样品的沉淀加入10％硫酸-甲醇溶液200μl，置于水浴锅中进行甲酯化反应，反应温度为70℃，反应时间为20min，反应结束后冷却至室温，加入500μl正己烷，进行抽提、过滤，滤过液用于气相色谱分析，检测棕榈酸含量，并计算质量转化率＝(甘氨酸的净产量÷棕榈酸的净消耗量)×100％。气相色谱检测仪器及检测条件如下：

检测仪器：agilenthp-innowax

检测条件：气相毛细管柱：(30m×0.32mm×0.25μm，19081n-113)；载气：氮气；fid检测器；柱温:起始温度150℃，保持5min；以3℃/min升温至170℃，保持5分钟，以3℃/min升温至210℃，保持5min；氮气流速：45ml/min；氢气流速：40ml/min；分流比：10:1，进样量1μl。

结果表明：fg11、fg12、fg13、fg14、fg15、fg16、fg17棕榈酸的残余量均为0g/l，棕榈酸的净消耗量为5g/l，所以该7株菌的最高质量转化率为fg15菌株，达到了63.4％，占理论质量转化率的27.06％。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>高效利用脂肪酸合成甘氨酸的大肠杆菌重组菌的构建及应用

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1622

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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cttttgaagctggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggaggatcatc120

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<210>2

<211>1443

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>4792

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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cgtcaattgtctgattcgttaccaattatgacaacttgacggctacatcattcacttttt120

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