一种芦荟多糖及其制备方法与应用与流程

本发明属于植物提取物技术领域，具体涉及一种芦荟多糖及其制备方法与应用。

背景技术：

芦荟(aloevera)为百合科芦荟属多年生常绿肉质草本植物，分布于热带和亚热带地区，目前已有品种600多种，是集食用、药用、美容、观赏为一身的广泛应用的天然植物，在民间用于解毒、治疗便秘等已有几千年的历史。现代药理实验证明，芦荟中的活性成分具有杀菌、消炎、抗癌、促进伤口愈合、增强机体免疫力等十多种药理作用。研究发现，芦荟富含多种生物活性物质，广泛应用于食品、美容、保健、医药等领域。芦荟的化学成分较为复杂，主要包含蒽醌类物质、多糖类物质、氨基酸、有机酸、维生素、矿物质及微量元素等。其中芦荟多糖是芦荟凝胶中的主要生物活性物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抑菌消炎、防治艾滋病、提高免疫力等多种功效。

目前，关于芦荟多糖的提取方法国内外已有较多报道，传统的提取芦荟多糖的方法有水提取法、酸提取法、碱提取法、酶提取法等。申请号为cn02159725.1的中国专利采用了果胶酶酶解，超滤及冻干的技术提取芦荟多糖，但该方法提取芦荟多糖得率比较低，加工时间较长，成本较高，无法规模化进行生产。申请号为cn201010505190.4的中国专利采用了果胶酶酶解加常规干燥的技术手段生产芦荟多糖，含量为15％以上，但该方法同样存在提取芦荟多糖得率低，成本高等问题。申请号为cn201410036579.7的中国专利采用了果胶酶酶提技术，但该方法虽然芦荟多糖得率较高，但是，其产品芦荟多糖的粘度较低且不稳定。由此可见目前芦荟多糖的提取方法普遍具有耗时长、产率低、粘度较低且不稳定的缺点。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的问题，提供一种芦荟多糖及其制备方法与应用。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种芦荟多糖的制备方法，为芦荟叶经预处理后打浆、过胶体磨，浆液加入纤维素酶和果胶酶进行酶解；酶解液灭酶后进行固液分离，收集液体加热后加入活性炭脱甙脱色，板框过滤，收集清液；清液浓缩、干燥得芦荟凝胶多糖。

其中，所述预处理为对新鲜采摘的芦荟鲜叶进行清洗及消毒。

作为优选，所述芦荟鲜叶为两年以上新鲜饱满的芦荟鲜叶。

作为优选，所述预处理为芦荟鲜叶经水清洗、0.1％氯酸钠溶液浸泡1小时消毒。

作为优选，所述打浆为双道打浆机打浆。

进一步，本发明所述制备方法在打浆后过胶体磨进行研磨处理。芦荟多糖存在于芦荟叶组织细胞内，难于溶出，胶体磨的机械作用可加快细胞内溶物的溶出。

本发明所述制备方法在向浆液中加入纤维素酶和果胶酶进行双酶解。纤维素酶通过破坏芦荟细胞壁，利于芦荟多糖的溶出。果胶酶通过破坏芦荟凝胶，易于后期的加工处理。

作为优选，所述纤维素酶的加入量为芦荟浆液的0.2-2.0‰，所述果胶酶的加入量为芦荟浆液的0.2-1.0‰。在一些实施例中，所述纤维素酶的加入量为芦荟浆液的0.2‰，所述果胶酶的加入量为芦荟浆液的0.3‰。

作为优选，所述酶解温度为50±5℃，酶解时间为20min-60min。在一些实施例中，所述酶解时间为30min。

本发明所述制备方法，在酶解结束后还包括灭酶的步骤。在一些实施方案中，所述灭酶具体为加热至90℃以上进行酶灭活，灭活时间为5-10min。在一些实施例中，所述灭酶为90℃灭活5min。

进一步的，本发明所述的制备方法，在酶解后对酶解液进行固液分离，收集分离的液体加入活性炭加热进行脱甙脱色处理。

在一些实施方案中，所述固液分离为经卧式离心机进行分离。

作为优选，所述活性炭的加入量为固液分离后收集液体重量的0.5-1.0％；所述加热为加热至70-80℃；所述脱甙脱色时间为20-60min。在一些实施例中，收集液体加热至70℃，加入0.63％的活性炭维持70℃，搅拌30min脱甙脱色。

本发明所述制备方法酶解液经活性炭脱甙脱色后进行板框过滤然后收集清液浓缩、干燥。

作为优选，所述浓缩具体为用真空浓缩机进行第一浓缩后用100000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集截留液后再用真空浓缩机进行第二浓缩。其中所述第一浓缩后的超滤可保证芦荟多糖的分子量及粘度。

在一些实施方案中，所述第一浓缩温度为70℃以下，浓缩至料液bx值为20°-30°；所述第二浓缩温度为70℃以下，浓缩至bx值为40°以上。

在一些实施方案中，所述干燥为真空带式干燥机干燥，干燥温度为60℃，干燥时间为60min。

在一些实施方案中，所述制备方法在干燥后还包括粉碎后过筛的步骤。在一些实施例中，所述粉碎后过筛为粉碎后过100-140目筛网，

本发明还提供了上述制备方法制得的芦荟多糖。

在一个实施方案中，本发明采用免疫低下模型检测本发明所述芦荟多糖对器官重量、单核巨噬细胞吞噬功能的影响，结果显示本发明所述芦荟多糖可增强其免疫功能，并具有提高小鼠网状内皮系统的非特异性吞噬功能的作用。因此本发明提供了所述芦荟多糖在制备增强免疫力的药物中的应用。

在一个实施方案中，本发明考察了本发明所述芦荟多糖对小鼠si180a的影响，结果显示芦荟多糖具有显著的对抗小鼠si180a的作用，无论是对实体瘤si180a还是对腹水型si180a都具有强大的对抗作用。因此本发明提供了所述芦荟多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种芦荟多糖及其制备方法与应用。本发明所述芦荟多糖以芦荟鲜叶为原料，经预处理、打浆、过胶体磨、双酶水解、固液分离，浓缩、干燥等工艺制得。本发明所述制备方法制得的芦荟多糖提取得率、多糖含量及粘度均明显高于现有技术。实验表明本发明所述芦荟多糖可增强其免疫功能，并具有提高小鼠网状内皮系统的非特异性吞噬功能的作用，同时具有显著的对抗小鼠si180a的作用，无论是对实体瘤si180a还是对腹水型si180a都具有强大的对抗作用。因此本发明所述芦荟多糖可用于制备抗肿瘤、增强免疫力的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示乌氏毛细管黏度计结构图，图中1.主管；2.宽管；3.侧管；4.弯管；

a.测定球；b.储器；c.缓冲球；d.悬挂水平储器；e.毛细管；m1、m2.环形测定线。

具体实施方式

本发明公开了一种芦荟多糖及其制备方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的所用原料或辅料均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：

采摘两年以上新鲜饱满的芦荟鲜叶1吨，用自来水经清洗，0.1％氯酸钠溶液浸泡1小时，晾干氯酸钠溶液，备用；

芦荟鲜叶用双道打浆机打浆，过胶体磨，浆液加热至50℃，加入200g纤维素酶和300g果胶酶进行酶解，酶解温度50±5℃，酶解时间30min，酶解结束后，90℃以上进行酶灭活，灭活时间为5min；

酶解液经过卧式离心机进行固液分离，得液体820kg；

液体加热至70℃，加入5.2kg的活性炭，维持70℃，搅拌30min，板框过滤，得清液650kg(bx＝1.0°，ph为4.42)；

清液用真空浓缩机组进行第一浓缩，得第一浓缩液22kg(bx＝26°，ph为4.31)；

第一浓缩液过100000道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液13kg(bx＝23°，ph为4.28)，真空浓缩机组进行第二浓缩，得第二浓缩液5.4kg(bx＝45°，ph为4.25)；

第二浓缩液用真空带式干燥机组进行干燥，干燥温度60℃，干燥时间60min，粉碎过100-140目筛网，得芦荟多糖2.4kg。

实施例2：

采摘两年以上新鲜饱满的芦荟鲜叶1吨，用自来水经清洗，0.1％氯酸钠溶液浸泡1小时，晾干氯酸钠溶液，备用；

芦荟鲜叶用双道打浆机打浆，过胶体磨，浆液加热至55℃，加入180g纤维素酶和180g果胶酶进行酶解，酶解温度55℃，酶解时间20min，酶解结束后，90℃以上进行酶灭活，灭活时间为8min；

酶解液经过卧式离心机进行固液分离，得液体800kg；

液体加热至70℃，加4.4kg的活性炭，维持70℃，搅拌20min，板框过滤，得清液620kg(bx＝0.8°，ph为4.51)；

清液用真空浓缩机组进行第一浓缩，得第一浓缩液21.5kg(bx＝25°，ph为4.46)；

第一浓缩液过100000道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液12.2kg(bx＝22.6°，ph为4.42)，真空浓缩机组进行第二浓缩，得第二浓缩液4.8kg(bx＝50°，ph为4.38)；

第二浓缩液用真空带式干燥机组进行干燥，干燥温度60℃，干燥时间60min，粉碎过100-140目筛网，得芦荟多糖2.1kg。

实施例3：

采摘两年以上新鲜饱满的芦荟鲜叶1吨，用自来水经清洗，0.1％氯酸钠溶液浸泡1小时，晾干氯酸钠溶液，备用；

芦荟鲜叶用双道打浆机打浆，过胶体磨，浆液加热至55℃，加入1800g纤维素酶和900g果胶酶进行酶解，酶解温度55℃，酶解时间60min，酶解结束后，90℃以上进行酶灭活，灭活时间为5min；

酶解液经过卧式离心机进行固液分离，得液体830kg；

液体加热至70℃，加入8.3kg的活性炭，维持70℃，搅拌60min，板框过滤，得清液630kg(bx＝1.2°，ph为4.38)；

清液用真空浓缩机组进行第一浓缩，得第一浓缩液24kg(bx＝27°，ph为4.32)；

第一浓缩液过100000道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液18kg(bx＝25°，ph为4.29)，真空浓缩机组进行第二浓缩，得第二浓缩液6.8kg(bx＝55°，ph为4.26)；

第二浓缩液用真空带式干燥机组进行干燥，干燥温度60℃，干燥时间60min，粉碎过100-140目筛网，得芦荟多糖3.2kg。

实施例4：

采摘两年以上新鲜饱满的芦荟鲜叶1吨，用自来水经清洗，0.1％氯酸钠溶液浸泡1小时，晾干氯酸钠溶液，备用；

芦荟鲜叶用双道打浆机打浆，过胶体磨，浆液加热至50℃，加入900g纤维素酶和450g果胶酶进行酶解，酶解温度50℃，酶解时间30min，酶解结束后，90℃以上进行酶灭活，灭活时间为5min；

酶解液经过卧式离心机进行固液分离，得液体840kg；

液体加热至70℃，加入6.3kg的活性炭，维持70℃，搅拌30min，板框过滤，得清液680kg(bx＝1.0°，ph为4.56)；

清液用真空浓缩机组进行第一浓缩，得第一浓缩液23.5kg(bx＝25°，ph为4.52)；

第一浓缩液过100000道尔顿的超滤膜进行超滤，得截留液20.4kg(bx＝23°，ph为4.49)，真空浓缩机组进行第二浓缩，得第二浓缩液8.5kg(bx＝45°，ph为4.45)；

第二浓缩液用真空带式干燥机组进行干燥，干燥温度60℃，干燥时间60min，粉碎过100-140目筛网，得芦荟多糖3.1kg。

检测例：

分别检测实施例1及申请号为cn02159725.1实施例1、cn201010505190.4实施例1和cn201410036579.7实施例制得的芦荟多糖，提取率、多糖含量及粘度，结果见表1。

其中芦荟多糖提取率的计算公式为：

芦荟多糖提取率＝实际提取出来的芦荟多糖总量/芦荟多糖总量(用苯酚硫酸法检测芦荟去皮后的多糖含量而得)。

多糖含量的检测方法如下：

照紫外-可见分光光度法(中国药典2015年版四部通则＜通则0401＞)测定。

对照品溶液的制备：精密称取105℃干燥至恒质量的甘露糖20mg至100ml量瓶，并用水定容备用，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取供试品10g，加水30ml溶解，加入90％乙醇45ml，将析出物过滤后取清液，再加95％乙醇230ml，过滤得析出物并在105℃干燥至恒重m0g。精密量取恒重后析出物0.06g，加水溶解，转移入100ml量瓶中，定容至刻度，作为供试品溶液。

测定法：分别取供试品溶液和对照品溶液各2ml置于有塞的试管中，然后加入5％苯酚1.0ml，摇匀后加入浓硫酸5.0ml，剧烈振摇混匀后，立即置沸水浴中加热，自振摇起计时，准确反应20min，将试管移至冰浴中冷却后，放至室温。依法于490nm测定吸光度(a)，以水同样显色操作为空白，计算其多糖含量，经换算后本品的多糖含量以甘露糖计不得低于8.5％。

粘度的检测方法如下：

照(中国药典2015年版四部＜通则0633＞，黏度测定法)检查。

特性黏数应在20ml/g以上。

取供试品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水100ml，振摇使溶解，作为供试品溶液；用3号垂熔玻璃漏斗滤过，弃去初滤液(1ml)，取续滤液(不得少于7ml)沿洁净、干燥的乌氏毛细管黏度计(图1)的管2内壁注人b中，将黏度计垂直固定于恒温水浴槽中，并使水浴的液面高于球c的中部，放置15分钟后，将管口1、3各接一乳胶管，夹住管口3的胶管，自管口1处抽气，使供试品溶液的液面缓缓升高至球c的中部，先开放管口3，再开放管口1，使供试品溶液在管内自然下落，用秒表准确记录液面自测定线m1处下降至测定线m2处的流出时间。不重装试样，重复测定2次，两次测量的流动时间之差不得超过平均值的±0.5％。取两次的平均值为供试液的流出时间(t)。取经3号垂熔玻璃漏斗滤过的溶剂同法操作，重复测定2次，两次测定值应相同，取平均值为溶剂的流出时间(t0)。

按下式计算特性黏数：

特性黏数

式中ηr为t/t0；c为供试品溶液的浓度，g/ml。

表1：各方法制得的芦荟多糖的检测结果

表1结果显示，本发明实施例1-4制得的芦荟多糖产品无论在提取得率、多糖含量及粘度均高于现有3个专利方法的实施例制备的产品，其中多糖含量高达38.3％，比目前的专利产品高1倍以上。

试验例1：芦荟活性多糖增强免疫力功能试验

1.试验材料

1.1受试样品

取本发明实施例1和对比例(申请号为cn02159725.1、cn201010505190.4和cn201410036579.7)工艺制备的芦荟多糖作为试验样品。

1.2试验剂量

实施例1和对比例试样用量为2.4g/d，以成人体重60kg计，平均用量为40mg/(kg·d)，即试验样品用量为40mg/(kg·d)。

本实施例1设试验样品低、中、高3个剂量组，分别设为40、80、160mg/(kg·d)。

1.3实验动物

昆明小鼠，18～22g，广州中医药大学实验动物中心提供，正常饲养3天后供试。

1.4主要仪器及试剂

uv-2501紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；bs110s电子天平(sartorius公司)；xzc-5a型小鼠跳台仪(江苏赛昂斯生物科技有限公司)；d-半乳糖；sod试剂；mda试剂；考马斯亮兰试剂；注射用环磷酰胺。

2.试验方法

2.1免疫低下模型的建立及分组给药

取昆明小鼠108只，雌雄各半，随机分成空白对照组、阴性对照组、实施例1高、中、低剂量组、对比例1组(申请号为cn02159725.1专利)、对比例2组(申请号为cn201010505190.4专利)、对比例3组(申请号为cn201410036579.7专利)，每组12只。除空白对照组外，其余各组小鼠于第1、3、5天按50.0mg/kg腹腔注射环磷酰胺注射液。造模同时按相应剂量灌胃给予试验样品，空白对照组及阴性对照组每天灌胃相应体积蒸馏水，每天灌胃给药1次，连续14d。

2.2观察指标

于末次给药后1h，小鼠称重，尾静脉注射25％中华墨汁生理盐水液10.0ml/kg，于注射墨汁后2分钟及12分钟，用毛细玻管从小鼠眼眶后静脉丛取血2-3滴，吸20.0μl溶于2.0ml0.1％na2co3溶液中，摇匀，于721型分光光度下680nm处测吸光度，按下列公式计算吞噬指数k。同时剖取脾脏和胸腺，计算胸腺、脾脏系数。

试验数据采用多组间比较采用单因素方差分析，实验数据采用t检验分析法，比较组间差异，数据均用x±s表示。

3.结果

比较分析各组芦荟多糖对器官重量、单核巨噬细胞吞噬功能的影响，结果见表2。

表2芦荟多糖对免疫低下小鼠的影响(x±s)

注：与空白对照组比较，^*p<0.01；与阴性对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05。

结果显示，与空白组相比，阴性对照组小鼠的胸腺系数、脾脏系数及碳粒廓清指数k显著降低(p<0.01)；且实施例1制得的芦荟多糖试验样品各剂量组均能明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠的脾脏系数及碳粒廓清指数(p<0.01或0.05)，同时高、中剂量组能显著提高免疫低下小鼠的胸腺系数(p<0.01或0.05)，提示实施例1制得的芦荟多糖试验样品可增强其免疫功能，并具有提高小鼠网状内皮系统的非特异性吞噬功能的作用。

在环磷酰胺对小鼠形成免疫抑制的实验条件下，实施例1制得的芦荟多糖试验样品各剂量组小鼠的碳粒廓清指数显著高于阴性对照组，即单核吞噬细胞功能明显增强，说明其能增强机体的非特异性免疫功能。同时，芦荟多糖试验样品能使小鼠胸腺系数和脾脏系数增加。

本实施例从免疫调节评价了芦荟多糖的功能，证明其可通过提高免疫系统功能等方面发挥作用。

按照上述方法对本发明实施例2-4制得的芦荟多糖的增强免疫力功能进行检测，结果与实施例1制得的芦荟多糖相似，实施例2-4制得的芦荟多糖均能明显提高环磷酰胺所致免疫低下小鼠的脾脏系数及碳粒廓清指数、胸腺系数(p<0.01或0.05)，提示实施例2-4制得的芦荟多糖试验样品可增强其免疫功能，并具有提高小鼠网状内皮系统的非特异性吞噬功能的作用。

试验例2：芦荟活性多糖抗肿瘤功能试验

1.试验药品：

样品：取本发明实施例1和对比例(申请号为cn02159725.1、cn201010505190.4和cn201410036579.7)工艺制备的芦荟多糖作为试验样品。

对照品：环磷酰胺。

2.动物

nih615纯系小鼠。

3.瘤株

si180a小鼠由中国医学科学院血液研究所提供。

4.实验方法与结果

芦荟多糖对小鼠s180的影响

取nih纯系小鼠，体重20±2g，雌雄兼用，按《全国抗肿瘤药物体内筛选规程》的方法接种，瘤源为接种6天-9天肿瘤生长良好的si180a，取出腹水，用灭菌的生理盐水按l:4比例稀释制成肿瘤细胞混悬液(5×10⁶细胞/ml)。分别以0.2ml/r接种于小鼠右侧腋窝皮下或者接种于小鼠腹腔内。

24h后随机分组分成空白对照组、环磷酰胺对照组、本发明实施例1样品组、对比例1组样品组(cn02159725.1专利实施例1样品)、对比例2组样品组(cn201010505190.4专利实施例1样品)、对比例3样品组(cn201410036579.7专利实施例样品)，每组10只，分别每天腹腔或者皮下注射给药一次，芦荟多糖的剂量为60mg/kg，环磷酰胺的剂量为60mg/kg，对照组给同体积的生理盐水，连续给药10d，停药后次日将接种皮下的小鼠处死，取出瘤块称重，计算抑瘤率。接种腹腔的小鼠停药后观察寿命天数，计算生命延长率。结果见下表3和表4。

表3：芦荟多糖对接种皮下的小鼠si180a的影响

注：与空白对照组比较，^*p<0.01。

表4：芦荟多糖对接种腹腔的小鼠si180a的影响

注：与空白对照组比较，^*p<0.01。

从上述试验结果可以看出，芦荟多糖具有显著的对抗小鼠si180a的作用，无论是对实体瘤si180a还是对腹水型si180a都具有强大的对抗作用，效果好于对比例产品。

按照上述方法对本发明实施例2-4制得的芦荟多糖的抗肿瘤功能进行检测，结果与实施例1制得的芦荟多糖相似，实施例2-4制得的芦荟多糖均具有显著的对抗小鼠si180a的作用，无论是对实体瘤si180a还是对腹水型si180a都具有强大的对抗作用，效果好于对比例产品。