环状RNA作为结直肠癌分子标志物的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，特别涉及环状rna作为结直肠癌分子标志物的应用。
背景技术：
：由于胃肠道肿瘤早期症状不明显，筛查指标特异性不高，因此，早期发现、早期诊断成为一大难题，并且术后复发检测指标精确性及敏感性尚不理想，环状rna的研究为胃肠道肿瘤早期诊断带来了曙光。环状rna属于非编码rna，由外显子和或内含子经非共价连接形成的闭合rna(guarnerio,j.,etal.,oncogenicroleoffusion-circrnasderivedfromcancer-associatedchromosomaltranslocations.cell,2016.166(4):p.1055-1056.)。环状rna特征主要有以下几点：①环状rna广泛存在于真核生物体内，丰度高，具有时空特异性的特点；②不具有5’端帽子及3’端尾巴(ploya)结构，因而不被rna核糖核酸酶剪切，在真核生物体内具有结构稳定性的特点；③多具有高度保守序列，在生物进化过程中多数不发生变异；④可在人类血清外泌体中广泛存在，且在肿瘤组织中具有特异性表达。研究表明，环状rna在肿瘤的恶性进程具有重要的作用，其调控途径主要通过吸附微小rna，起到微小rna海绵体的作用，解除微小rna对靶基因的抑制作用，进而调控靶基因表达(holdt,l.m.,etal.,circularnon-codingrnaanrilmodulatesribosomalrnamaturationandatherosclerosisinhumans.natcommun,2016.7:p.12429.)。因此，在未来的临床诊断中，监测血浆环状rna的表达水平能够给疾病的临床诊断提供参考，成为早期诊断和疾病病程相关的标志物；通过调控环状rna的表达，能够为肿瘤的诊治提供新策略。虽然如今对环状rna的研究越来越多，已成为新一代肿瘤早期诊断的潜在生物标志物，但到目前为止，尚未有可用于结直肠癌早期诊断及筛查的血浆环状rna标志物的相关报道。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供环状rna作为结直肠癌分子标志物的应用。本发明的另一目的在于提供环状rna在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：环状rna作为结直肠癌分子标志物的应用。所述的环状rna为hsa_circ_0005758，其核苷酸序列如下所示(seqidno.1)：tcaccccaaaccagaaggcctggctgctgccaagaagctttgtgagaatcttttgcaaacagttcatgctgaatactctagatttgtgaatcagattaatactgctgtacctttaccaggctatacacaaccctctgctataagtagtgtccctcctcaaccaccatattatccatccaatggctatcagtctggttaccctgttgttccccctcctcagcagccagttcaacctccctacggagtaccaagcatagtgccaccagctgtttcattagcacctggagtcttgccggcattacctactggagtcccacctgtgccaacacaatacccgataacacaagtgcagcctccagctagcactggacag；所述的hsa_circ_0005758在circbase(circbase数据库)中的环化位点序列如下(seqidno.2)：agctagcactggacagtcaccccaaaccagaagg；其通过可变剪切形成，呈封闭环状结构，不易被核糖核酸外切酶降解，比线性rna更稳定；部分环状rna分子含微小rna应答元件，可充当竞争性内源rna，与微小rna结合，在细胞中起到微小rna海绵的作用，进而解除微小rna对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平。所述的hsa_circ_0005758可以是天然或人工合成的hsa_circ_0005758，或者使用可以表达hsa_circ_0005758的dna片段的载体转染细胞获得。所述的载体包括病毒载体和真核载体。所述的病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体等。所述的疱疹病毒包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒、eb病毒等。所述的真核表达载体可以是任何适当的载体，包括但不限于pcmt-myc表达载体、pcdna3.0表达载体、pcdna6.0表达载体、pegfp表达载体、pefbos表达载体、ptet表达载体、ptre表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，如pbin438、pcambia1301等。环状rna在制备用于诊断结直肠癌的试剂盒、试纸、芯片、高通量测序平台、外泌体、或脂质体中的应用，所述的环状rna为hsa_circ_0005758。所述的试剂盒包括用于诊断hsa_circ_0005758的引物或探针。所述的用于诊断hsa_circ_0005758的引物的核苷酸序列为：上游引物：5'-gcatagtgccaccagctgtt-3'；下游引物：5'-tctggtttggggtgactgtc-3'。进一步，所述的试剂盒中用于诊断hsa_circ_0005758的引物或探针还可包括现有技术中已经报道的可以用于检测所述环状rna表达水平的引物或探针。所述的芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针。进一步，所述的固相载体可采用基于芯片领域的各种常规材料，包括但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。所述的试纸包括用于诊断hsa_circ_0005758的引物或探针。所述的用于诊断hsa_circ_0005758的引物的核苷酸序列为：上游引物：5'-gcatagtgccaccagctgtt-3'；下游引物：5'-tctggtttggggtgactgtc-3'。所述的高通量测序平台包括用于诊断hsa_circ_0005758的引物或探针。所述的用于诊断hsa_circ_0005758的引物的核苷酸序列为：上游引物：5'-gcatagtgccaccagctgtt-3'；下游引物：5'-gcctggtaaaggtacagcagta-3'。环状rna在制备用于检测hsa_circ_0005758表达水平的试剂中的应用，所述的环状rna为hsa_circ_0005758。环状rna作为结直肠癌分子标志物在筛选治疗结直肠癌药物中的应用，在得知了全面所述的hsa_circ_0005758与结直肠癌的密切相关性后，可以基于该特征来筛选促进hsa_circ_0005758表达的物质；进而可从所述的物质中找到对于治疗结直肠癌真正有用的药物。因此，本发明还提供了一种筛选治疗结直肠癌的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理结直肠癌相关细胞体系，若所述候选物质可促进前面所述的hsa_circ_0005758表达或活性，则表明该候选物质是治疗结直肠癌的潜在物质。所的述细胞体系可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等；优选的，对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以进一步选择和确定对于治疗结直肠癌真正有用的物质。环状rna在制备抗肿瘤药物中的应用，其中所述的环状rna为hsa_circ_0005758。所述的肿瘤为消化道肿瘤，包括结直肠癌等。所述的抗肿瘤药物为抑制结直肠癌细胞增殖的药物。所述的抗肿瘤药物包括有效剂量的促进剂；所述促进剂能够促进hsa_circ_0005758的表达、或能够促进hsa_circ_0005758的活性、或能够促进hsa_circ_0005758的有效作用时间、或能促进hsa_circ_0005758的稳定性。所述的促进剂的靶标不限于hsa_circ_0005758本身，还包括hsa_circ_0005758的上下游，例如：编码hsa_circ_0005758的基因组序列，hsa_circ_0005758的靶基因、调控hsa_circ_0005758的蛋白或基因。进一步，所述的促进剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体等；促进剂还可以是慢病毒液、表达质粒和/或小干扰rna。所述的抗肿瘤药物还包括药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体等。所述的抗肿瘤药物可按照药物学领域的常规方法制成各种剂型，包括但不限于适于显微注射技术、适于转染的剂型，如注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂等。所述的抗肿瘤药物可以单独施用，或者与其他能够治疗结直肠癌的药物进行组合施用；受试者可以是人类或者其他哺乳动物；更具体的，受试者是器官、组织、细胞。所述的抗肿瘤药物可以离体施用，具体为：将环状rna的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞(或异种细胞)，经体外细胞扩增后，输回人体。所述的抗肿瘤药物可以体内施用，具体为：将环状rna的表达载体直接导入体内；所述表达载体可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸dna或rna。所述的环状rna为hsa_circ_0005758。本发明使用的“有效剂量”是指可对人体和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述的hsa_circ_0005758有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效剂量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述hsa_circ_0005758促进剂的药代动力学参数例数生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病严重程度、患者的体重、患者的免疫状态、给药途径等。本发明中分析环状rna表达谱的方式包括但不限于以下几种：反转录聚合酶链式反应方法(rt-pct)、实时荧光定量聚合酶链式反应方法(real-timepcr)、原位杂交方法(insituhybridization)、northern印迹杂交方法(northernblotting)、核糖核酸酶保护测定方法(rnaseprotectionassay)、solexa测序技术(solexasequencingtechnology)和生物芯片。在本发明的具体实施方式中，采用了实时荧光定量聚合酶链式反应方法和原位杂交方法。本发明中使用的“环状rna”与“circularrna”、“circrna”通用。本发明中使用的“诊断结直肠癌”包括对结直肠癌病变的预判、即判断受试者是否存在患有结直肠癌的风险，也包括对结直肠癌的诊断，即判断受试者是否存在复发的可能性或者判断受试者已经复发。本发明中使用的“治疗结直肠癌”包括疾病的好转、缓解、治愈。本发明使用体外培养的结直肠癌细胞来研究hsa_circ_0005758对结直肠癌的治疗作用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本发明首次发现了hsa_circ_0005758与结直肠癌相关，通过检测受试者hsa_circ_0005758的表达，可以判断受试者是否患有结直肠癌、或判断受试者是否存在患有结直肠癌的风险，从而知道临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。2、本发明的hsa_circ_0005758还可以作为筛选结直肠癌诊治的有效靶点，将其制成诊断试剂盒、试纸、芯片等诊断工具，可用于结直肠癌的早期筛查、诊断。3、本发明通过实验证明hsa_circ_0005758可以抑制肠癌细胞增殖的生物学过程，因此认为hsa_circ_0005758是治疗肠癌的药物靶标。作为一种新的结直肠癌相关性诊治分子标志物，相比传统的检测手段，环状诊断更具及时性、更具特异性、更具灵敏性，能够实现结直肠癌的早期诊断，从而降低结直肠癌的死亡率。该分子标志物为临床医师制定个性化治疗方案提供理论基础，可用于临床消化道肿瘤的早期筛查、诊断及治疗，在临床上具有广泛的应用前景。附图说明图1是利用real-timepcr检测hsa_circ_0005758在肠癌组与非肠癌组患者血浆中的表达情况结果图。图2是hsa_circ_0005758的表达对肠癌细胞增殖的影响图。图3是干扰hsa_circ_0005758表达对肠癌细胞增殖的影响图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用于与本领域熟练人员所熟悉的用意相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料均可应用于本发明中。实施例1：real-timepcr检测hsa_circ_0005758在结直肠癌组织中的表达情况1.样本收集及制备收集10例结直肠癌患者、10例结肠息肉患者和10例健康志愿者，各抽取全血4ml，分别于4℃12,000×g离心10分钟，去除可能存在的杂质，收集血浆标本。分别将所收集的血浆标本于-80℃冰箱储存待用。2.rna提取将上述血浆标本于冰上溶解，分别加入750μl的trizollsreagent试剂和20μl冰醋酸，手动剧烈振荡管体至混匀。匀浆后样品于室温孵育5分钟，使核酸蛋白复合体完全解离，加入0.2ml的氯仿，手动剧烈振荡管体15秒后，室温孵育2～3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后留取上层的无色水相，加入500μl异丙醇，混匀以沉淀其中的rna。室温孵育10分钟后，于4℃12,000×g离心10分钟，rna沉淀在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。移去上清液，加入1ml的75％(v/v)乙醇，清洗rna沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。去除乙醇溶液，空气中干燥rna沉淀5～10分钟。加入无rna酶的水溶解rna，60℃孵育10分钟。获得的rna溶液保存于-80℃。3.cdna合成①配制退火混合物，包括rna模板、引物mix(randomn9primers，10um)、dntpsmix(2.5mm)、无rna酶的h2o，将混合液在65℃水浴5分钟,冰上放置2分钟。体系配置如下：反应成分体系配比rna模板600ng引物mix(10um)1μldntpsmix(2.5mm)1.6μl加无rna酶的h2o至总体积13.5μl②将溶液轻柔混匀，短暂离心后，在离心管中依次加入rt反应液，包括5xfirst-strandbuffer、0.1mdtt、rnaseihibitor和superscriptiiirt。混合均匀后，37℃恒温1分钟。50℃温育60分钟。70℃温育15分钟使酶失活。cdna置冰浴待用或-20℃保存。体系配置如下：反应成分体系配比5xfirst-strandbuffer4μl0.1mdtt1μlrnaseihibitor0.5μlsuperscriptiiirt1μl退火混合物13.5μl总体积20μl4.real-timepcr①将cdna样品分别配置realtimepcr反应体系，轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。其中：pcr特异引物f(上游引物)：5'-gcatagtgccaccagctgtt-3'；pcr特异引物r(下游引物)：5'-tctggtttggggtgactgtc-3'。体系配置如下：反应成分体系配比2×mastermix5μl10um的pcr特异引物f0.5μl10um的pcr特异引物r0.5μl加水至总体积8μl②将8μl混合液加到384孔-pcr板对应的每个孔中。再加入对应的2μlcdna。小心粘上sealingfilm封口膜，并短暂离心混合后，置于realtimepcr仪上进行pcr反应。所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个pcr循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光)。为了建立pcr产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-ramprate为0.05℃/秒)。5.结果如图1所示，与结直肠息肉患者(非肠癌组)相比，结直肠癌患者(肠癌组)的血浆中hsa_circ_0005758表达降低。实施例2：结直肠癌细胞增殖实验检测hsa_circ_0005758表达对结直肠癌细胞的影响1.肠癌细胞培养肠癌细胞株hct116、ht29(购买于atcc)为贴壁型细胞，均用含10％(v/v)胎牛血清的培养液(mccoy's5a(modified)medium，购买于thermofisherscientific)培养。调整细胞浓度为3～5×106/l，接种于培养盘中，培养条件为37℃，5％(v/v)co2，95％湿度。每天观察细胞生长状况、更换培养液，细胞呈单层贴壁生长。2.hsa_circ_0005758转染将肠癌细胞以1×105/孔铺到24孔板中，培养18～24小时后，使细胞数量约为2×105/孔，以hsa_circ_0005758慢病毒(购买于广州吉赛生物科技有限公司)进行转染。转染24小时后，用含有6μg/ml聚凝胺(polybrene)的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量hsa_circ_0005758慢病毒悬液。37℃孵育。4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释聚凝。继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基培养72小时。3.细胞增殖实验在96孔板中接种上述hsa_circ_0005758肠癌细胞及其对照组细胞悬液，于37℃5％(v/v)co2的培养箱预培养24小时。向每孔加入10ml的cck-8溶液孵育1～4小时后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。4.结果如图2所示，hsa_circ_0005758可抑制肠癌细胞增殖。实施例3：结直肠癌细胞增殖实验检测干扰hsa_circ_0005758表达对结直肠癌细胞的影响1.肠癌细胞培养肠癌细胞株hct116、ht29(购买于atcc)为贴壁型细胞，均用含10％(v/v)胎牛血清的培养液(mccoy's5a(modified)medium，购买于thermofisherscientific)培养。调整细胞浓度为3～5×106/l，接种于培养盘中，培养条件为37℃，5％(v/v)co2，95％湿度。每天观察细胞生长状况、跟换培养液，细胞呈单层贴壁生长。2.干扰hsa_circ_0005758转染干扰hsa_circ_0005758的靶序列为：gctagcactggacagtcac。合成干扰hsa_circ_0005758的rna(si-hsa_circ_0005758，sirna)。以六孔板为例，转染前一天，5×105个肠癌细胞接种在6孔板上，2ml完全培养基，转染前细胞汇合达到70～90％。在100μl无血清培养基加入2.5μlsirna(终浓度50nm)，柔和混匀。混匀lipofectamine试剂，用100μl无血清培养基稀释4μllipofectamine试剂，轻轻混匀，室温放置5min。将稀释好的sirna和lipofectamine试剂混合，轻柔混匀，室温放置20min，以便形成sirna-lipofectamine复合物。将200μlsirna-lipofectamine复合物加到已更换800μl无血清培养基的细胞孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板。细胞在37℃，5％(v/v)co2培养箱中，培养5～6h后吸去转染培养基，更换完全培养基，继续培养24小时。3.细胞增殖实验在96孔板中接种上述干扰hsa_circ_0005758的肠癌细胞及其对照组(对照组不加入sirna)细胞悬液，于37℃5％(v/v)co2的培养箱预培养24小时。向每孔加入10ml的cck-8溶液孵育1～4小时后，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。4.结果如图3所示，干扰hsa_circ_0005758可促进肠癌细胞增殖。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>暨南大学<120>环状rna作为结直肠癌分子标志物的应用<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>373<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>hsa_circ_0005758<400>1tcaccccaaaccagaaggcctggctgctgccaagaagctttgtgagaatcttttgcaaac60agttcatgctgaatactctagatttgtgaatcagattaatactgctgtacctttaccagg120ctatacacaaccctctgctataagtagtgtccctcctcaaccaccatattatccatccaa180tggctatcagtctggttaccctgttgttccccctcctcagcagccagttcaacctcccta240cggagtaccaagcatagtgccaccagctgtttcattagcacctggagtcttgccggcatt300acctactggagtcccacctgtgccaacacaatacccgataacacaagtgcagcctccagc360tagcactggacag373<210>2<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>环化位点序列<400>2agctagcactggacagtcaccccaaaccagaagg34<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>上游引物<400>3gcatagtgccaccagctgtt20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>下游引物<400>4tctggtttggggtgactgtc20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>上游引物2<400>5gcatagtgccaccagctgtt20<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>下游引物2<400>6gcctggtaaaggtacagcagta22<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>干扰hsa_circ_0005758的靶序列<400>7gctagcactggacagtcac19当前第1页12