雌激素受体α基因与女性眼病发生时间相关的制作方法

本发明属于医学技术领域，涉及雌激素受体α基因xbal位点多态性与女性graves眼病发生时间相关。

背景技术：

graves眼病(gravesophthalmopathy,go)是一种以内分泌和眼眶病理表现为主的器官特异性自身免疫性疾病，是最常见的眼眶病。由于性激素对免疫系统的作用及性别的差异，女性更易发生免疫性疾病。go常发生于毒性弥漫性甲状腺肿(graves,disease,gd)导致的甲亢的病人，女性gd患者是男性的7-10倍，约40％～75％的甲亢病人会发展成go，go患者男女比为3:16，且发生的时间不一。已有研究证实，雌激素受体-α(estrogenreceptor-α,er-α)基因两个单核苷酸多态性位点xbaⅰ(g变a)和pvuⅱ(t变c)与女性易患疾病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、1型糖尿病等显著相关。er-α基因的xbaⅰ和pvuⅱ多态性是否影响女性go患者的发生发展，目前尚未见报道。本课题即研究女性gd和go患者该两个多态性的分布情况，以了解其基因频率和部分发病的分子学基础。

技术实现要素：

本发明设立4组观察对象，分别为正常女性组，共126人；gd组，确诊为gd18个月以上，未出现眼征患者，共67人；go-s组，诊断为gd后，18个月内出现眼征患者，共56人；go-l组，诊断为gd后，18个月以上出现眼征患者，共40人；应用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(pcr-rflp)的方法，检测受试对象erα基因pvuⅱ和xbaⅰ位多态性分布的情况；分析erα基因多态性与女性go发病之间的相关关系。

go-s组aa基因型频率为80.4％，而正常对照组、gd组、go-l组aa基因型频率分别为46.8％、59.1％和57.5％，差异有统计学意义(p＝0.005)。并且，go-s组与正常对照组、gd组、go-l组差异具均有统计学意义(p值分别为0.000，0.04，0.042)；将gd组、go-s和go-l合并与正常对照组相比较，aa基因型频率差异分为为66％和46.8％，差异具有统计学意义(p＝0.004)；go-s组与gd组、go-l组a等位基因频率分别为88.4％、75.4％和59.4％，计算暴露于a等位基因与go-s的联系强度or得出，go-s组与gd组相比，暴露于a等位基因的or(95％ci)为2.11(1.203-3.699),与go-l相比，暴露于a等位基因的or(95％ci)为2.45(1.312-4.575)；正常对照组、gd组、go-s组和go-l组在pvuⅱ多态性的分布差异不具有统计学意义(p＝0.698)。

结论：雌激素受体α基因与女性眼病发生时间相关。具体的，雌激素受体α基因xbal位点多态性与女性graves眼病发生时间相关。在erα基因xbaⅰ位点多态性方面，aa基因型与gd的发生有关，是gd的易感基因型，并且与go的发生时间有着密切关系，是go早发的危险因素；erα基因pvuⅱ酶切位点多态性与go的发生发展无关。

附图说明

图1erα的pcr扩增产物，产物长度为278bp；

图2雌激素受体αpcr扩增产物pvuⅱ酶切的电泳结果；

图3雌激素受体αpcr扩增产物xbaⅰ酶切的电泳结果；

图4雌激素受体α的pvuii酶切位点测序结果；

图5雌激素受体α的xbaⅰ酶切位点测序结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

1对象与方法

1.1对象

对照组：正常女性，年龄匹配，来源为滨州医学院附属医院眼科病房女性眼外伤、眼科屈光门诊女性患者及体检中心查体的女性。

病例组：于2011年5月-2012年5月，在滨州医学院附属医院、滨州市人民医院、滨州市中心医院的眼科、内分泌科住院的女性gd患者，分为病例组1(gd组)、病例组2(go-s组)、病例组3(go-l组)。

病例组1(gd组)：依据临床症状、体征结合血甲状腺激素测定明确诊断为gd，且无眼征已经18个月以上的女性gd患者。gd诊断依据参照《中国甲状腺疾病诊治指南》(中华医学会内分泌学会2008)。具备下列情况之一者排除：突眼(hertel突眼计测量值＞18mm，双眼差值＞2mm)；②眼睑退缩(向前注视上睑缘位于角膜缘及角膜缘以上)；③上睑迟落(向下注视时上睑不能下移或下落缓慢)；④限制性眼外肌病(ct证实的眼外肌肥大)；⑤视神经病变(无其他可考虑原因导致的异常视力、瞳孔反应、色觉、视野)。

病例组2(go-s组)：明确诊断为gd,初诊时即有眼征,或诊断后18个月内出现眼征的女性gd患者。

病例组3(go-l组)：明确确诊为gd,诊断后18个月以上出现眼征的女性gd患者。眼征参照tao诊断标准：

(1)有眼睑退缩，只要合并下列体征或检查证据之一即可做出诊断确诊：

①甲状腺功能异常或调节异常；

②眼球突出，其突出度大于或等于20mm；

③视神经功能障碍，包括视力下降，瞳孔反射、色觉、视野异常，无法用其他病解释；

④眼外肌受累，眼球活动受限，影像学发现眼外肌增粗。

(2)无眼睑退缩，则必须有甲状腺功能异常或调节异常并合并以下临床体征之一：

①眼球突出；

②视神经功能障碍；

③眼外肌受累。并排除其他原因引起类似的眼部体征。

剔除标准：其他原因引起的甲状腺功能亢进、骨质疏松、子宫肌瘤、子宫内膜异位症、类风湿关节炎及系统性红斑狼疮等可能与雌激素受体多态性相关的疾病以及系统免疫性疾病。有其他眼病，近三个月来应用激素或免疫抑制剂等患者。

1.2实验方法

1.2.1全血基因组dna提取全部研究对象均于月经周期第3～7天上午8～10时采集空腹肘前静脉血5ml，置于一次性真空采血管中(edta抗凝剂)。全血经3000rpm/min离心10分钟，取血清,置于不同的ep管中，并将ep管按照病人编号和相应编号，然后将分装有血浆和血细胞的ep管放于-70度冰箱中保存。取血前嘱研究对象安静休息15-30分钟。如连续60天以上无月经来潮的妇女在任意日上午取血，取血方法同前。

1.2.2聚合酶链反应(polymerasechainreaction，pcr)扩增erα基因查询genebank，由primer5.0设计引物。由生工生物工程(上海)有限公司合成，上游引物:

agggttatgtggcaatgacg，下游引物:cctgcaccatatgttacct，产物为278bp的片段，包含erα基因内含子1及部分外显子2。反应体系为50μl，含引物20pmol，模板dna1μg，2×dna聚合酶混合物25μl(美国fermentas公司)，无核酸酶水补充至50μl。置于热循环仪(eppendorf公司)中，95℃预变性5min；并按以下条件扩增36个循环:95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃充分延伸10min。pcr产物上样于15g/l琼脂糖凝胶电泳15min，紫外灯下成像并检测。

1.2.3pcr产物提纯pcr产物用普通dna产物纯化试剂盒(北京天根生化科技有限公司)纯化回收。溶解于30μl灭菌蒸馏水中，4℃保存备用。

1.2.4酶切酶切体系20μl，含1uxbaⅰ(或pvuⅱ)内切酶(生工生物工程(上海)有限公司)、10μlpcr产物、10mol/l缓冲液2μl，灭菌水补充至20μl。37℃水浴恒温酶切4h。分别取酶切产物10μl，在30g/l琼脂糖凝胶中电泳15～20min，紫外灯下成像检测，凝胶成像分析仪摄片保存。试验中设立阳性和阴性对照，抽样对部分样本重复酶切，以保证酶切结果的可靠性。

1.2.5dna序列测定pcr产物50μl经dna凝胶纯化试剂盒(axygen公司)纯化回收，连同上游引物送至北京天根生化科技有限公司，在abi377测序仪上使用bigdyeterminator(bigdye测序专用试剂盒)进行单向测序，观察pvuⅱ和xbaⅰ多态性位点的基因突变。

1.3统计学方法所有统计分析均用spss16.0完成。应用拟合优度χ2检验来判断两组基因型分布是否符合hardy-weinberg平衡，用χ2检验比较两组基因型频率分布，并以比值比(or)及其95％可信区间(ci)计算等位基因频率的相对风险度。取p＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

1.2.1对照组及实验组人群基本情况

(一)对照组共招募126人，平均年龄39.35±13.37岁(16～65岁)

(二)实验1组(gd组)67人，平均年龄38.06±13.65岁(20～63岁)，gd病史2～21年

(三)实验2组(go-s组)56人，平均年龄37.18±11.36岁(22～64岁)，gd病史6个月～17年

(四)实验3组(go-l组)40人，平均年龄41.16±11.87岁(23～70岁)，gd病史3年～27年

以上四组年龄经方差分析检验，差异无统计学意义(f＝0.680，p＝0.566)

1.2.2pcr扩增erα产物检测

erα的pcr扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后结果如图1所示，产物为278bp。

1.2.3erα酶切产物检测

(一)erα的pcr扩增产物经pvuii内切酶酶切后，3％琼脂糖凝胶电泳后分出三种基因型，图2：雌激素受体αpcr扩增产物pvuⅱ酶切的电泳结果。m：分子量标志2、6、9为pp基因型；1、3、4、5、8为pp基因型；7、10为pp基因型

a：pp型(cc型，纯合突变型):终产物为278bp1条带。t突变为c，酶切位点消失，erα不能被pvuii切开。

b：pp型(tc型，杂合突变型)：终产物为278bp、179bp、99bp3条带。一条链由t突变为c，酶切位点消失，一条链未发生突变，酶切位点存在，erα被pvuii切开。

c：pp型(tt型，纯合野生型)：终产物为179bp、99bp2条带.未发生突变，酶切位点存在，erα被pvuii切开。

(二)erα的pcr扩增产物经xbai内切酶酶切后，3％琼脂糖凝胶电泳后分出三种基因型，如图3所示。图3：雌激素受体αpcr扩增产物xbaⅰ酶切的电泳结果。m为分子量标志；2为xx基因型；3、9为xx基因型；1、、4、5、6、7、8、10为xx基因型

a：xx型(gg型，纯合突变型):终产物为278bp1条带。a突变为g，酶切位点消失，erα不能被xbai切开。

b：xx型(ag型，杂合突变型)：终产物为278bp、144bp、134bp3条带。一条链由a突变为g，酶切位点消失，一条链未发生突变，酶切位点存在，erα被xbai切开。

c：xx型(aa型，纯合野生型)：终产物为144bp、134bp2条带.未发生突变，酶切位点存在，erα被xbai切开。

1.2.4经基因测序检测突变点：

(一)erαpvuii位点测序结果见图4。图4：雌激素受体α的pvuii酶切位点测序结果.从上至下依次为：pp型(纯和突变型)、pp(杂合突变型)、pp(野生型)

由上至下依次为：

pp型(cc型，纯合突变型)两条链均由t突变为c。

pp型(tc型，杂合突变型)一条链由t突变为c，一条链仍为t，双峰。

pp型(cc型，纯合野生型)两条链均为发生突变。

(二)erαxbai位点测序结果见图5。图5：雌激素受体α的xbaⅰ酶切位点测序结果。从上至下依次为：xx型(纯和突变型)、xx(杂合突变型)、xx(野生型)。由上至下依次为：

xx型(gg型，纯合突变型)两条链均由a突变为g。

xx型(ag型，杂合突变型)一条链由a突变为g，一条链仍为a，双峰。

xx型(aa型，纯合野生型)两条链均为发生突变。

1.2.5各组基因多态性位点的分布

(一)erα基因pvuii位点多态性的分布

对照组(controls)、实验1组(go)、实验2组(go-s)和实验3组(go-l)erα基因pvuⅱ多态性分布应用拟合优度χ2检验，χ2分别为3.46、0.45、0.63和0.15，p值分别为0.062、0.50、0.42和0.69，均大于0.05，符合hrady-weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性。

卡方检验显示，对照组(controls)、实验1组(gd)、实验2组(go-s)和实验3组(go-l)的erα基因pvuⅱ酶切位点多态性分布差异无统计学意义(χ²＝3.834，p＝0.698)，其等位基因分布差异频率亦无统计学意义(χ²＝0.339，p＝0.953)。(见表1)

表1对照组(controls)、实验1组(gd)、实验2组(go-s)和实验3组(go-l)erα基因pvuii位点位点多态性的分布[n％]

(二)erα基因xbaⅰ位点多态性的分布(见表2)

对照组(controls)、实验1组(gd)、实验2组(go-s)和实验3组(go-l)erα基因xbaⅰ位点多态性分布应用拟合优度χ2检验，χ2分别为0.16、1.51、2.63和2.45，p值分别为0.68、0.21、0.10和0.11，均大于0.05，符合hrady-weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性。

对照组(controls)、实验1组(gd)、实验2组(go-s)和实验3组(go-l)erα基因xbaⅰ位点多态性分布总体差异有统计学意义(χ²＝18.574，p＝0.005),其等位基因频率分布总体差异也具有统计学意义(χ²＝17.307,p＝0.001)。组间具体差异情况见表2

表2对照组(controls)、实验1组(go)、实验2组(gd-o)和实验3组(go-l)erα基因xbaⅰ位点多态性的分布[n％]

从表2可以看出，go-s组等位基因a出现的频率明显增多，与gd组、go-l组差异具有统计学意义。通过两两比较发现，gd组和go-l组等位基因a出现的频率差异无统计学意义，见表3。

计算暴露于a等位基因与go-s的联系强度or得出，go-s组与gd组相比，暴露于a等位基因的or(95％ci)为2.11(1.203-3.699),与go-l相比，暴露于a等位基因的or(95％ci)为2.45(1.312-4.575)。说明暴露于a等位基因与go-s之间显著正相关，即暴露于a等位基因是go-s的危险因素。

表3对照组(controls)、实验1组(gd)、实验2组(go-s)和实验3组(go-l)erα基因xbaⅰ位点多态性分布组间差异

通过比较gd组(gd+go-s+go-l)和对照组(controls)erα基因xbaⅰ位点多态性分布发现，gd组(gd+go-s+go-l)和对照组(controls)研究对象的erα基因xbaⅰ位点多态性分布其基因型及等位基因频率组间差异具有统计学意义。计算暴露于a等位基因与gd的联系强度得出，与正常对照组相比，暴露于a等位基因的or(95％ci)为1.78(1.226-2.584)。(详见表4)

表4gd患者(gd+go-s+go-l)和对照组(controls)erα基因xbaⅰ位点多态性分布组间差异[n％]

讨论：

流行病学资料显示，go患者以女性为主，并且多发生于青春期至绝经期之间，考虑与女性关系密切的雌激素可能对go的发病有一定的影响。所以，本研究将女性独立起来研究，这样可以排除由于性别带来的激素相关的混杂因素，更好的探讨这种雌激素相关性疾病的发病机制和易感因素。

约有25％～50％的gd患者会发展到go，多数go发生在甲状腺功能亢进阶段，但两者之间的关系尚不明确。85％的go发生在甲亢诊断后18个月内，或出现go表现18个月内出现gd的症状，但也不少gd患者会在数年甚至数十年后出现go，是什么原因导致go易感的不同和症状出现时间的不同，目前尚未有明确的原因说明。已有多项研究报道了有关基因多态性对go发生的影响，候选基因包括hla、ctla-4、、tshr、cd90、il-13等，但结果却不一致，各家报道不一。究其原因，基因多态性的种族差异可能会影响结果，但各研究者对研究对象的分组存在不合理现象也是重要原因。上述研究的无眼征gd患者和go患者没有特别界定发病时间，仅以患者当时的眼部情况作为纳入标准，很可能将一部分即将发生眼症的患者归为无眼症的gd患者，造成选择偏倚，出现统计结果的偏差，使结论可信度下降，在一定程度上出现结果不一致的现象。本研究根据流行病学的结论，严格按照眼征出现的时间分组，客观上避免了将即将出现眼征的gd患者归入无眼征gd组，使纳入标准更加完善，有助于结果的可信度。本研究通过研究er-α多态性的分布，探讨go的易感及发生的部分机制。

er是配体依赖转录活性因子超家族成员之一，包括erα和erβ两种亚型，其编码基因具有遗传多态性且可导致不同个体对某些疾病具有不同易感性和临床特征。erα基因位于人染色体6q24-27区带，野生型erα基因由8个外显子和7个内含子组成，全长140kb。1号内含子有两处常发生点突变，也是目前的研究热点，分别在内切酶xbaⅰ和pvuⅱ的识别位点上。其中pvuⅱ多态性是内含子1中t变c点突变所致，xbaⅰ多态性则是发生在距pvuⅱ下游50bp处g变a置换。由于点突变会影响erα基因表达与功能，进而影响雌激素在体内的最终生物学效应。经pvuⅱ酶和xbaⅰ酶消化及琼脂糖凝胶电泳后可分别获得erα的pp、pp、pp和xx、xx、xx基因型。已有大量研究表明erα基因多态性与雌激素相关疾病有着密切联系。一项韩国的研究结果显示，韩国妇女绝经后骨质疏松者pvuⅱ多态性pp型明显高于pp型，推测px单倍型是其妇女骨质疏松的一个危险标志，印度学者研究表明xbaⅰ多态性xx基因与本国绝经后妇女骨质疏松有关；在子宫内膜移位症、冠心病、子宫肌瘤、乳腺癌、类风湿关节炎及系统性红斑狼疮疾病中，erα基因多态性的特点具有表达。

男性gd患者可以出现乳房发育，但催乳素正常，可能与男性激素向女性激素转变增多有关，gd缓解后，上述症状缓解。未治疗的女性gd患者血清雌二醇(estradiol，e2)浓度较正常人升高，gd患者存在着性激素水平的变化以及th1/th2平衡的紊乱，并认为雌激素能增强th1细胞因子的产生，抑制th2细胞因子的产生，在th1/th2漂移方面起着重要作用。病例报道接受雌激素替代治疗的绝经女性数年后发生了gd及go，提示雌激素在go的形成应有一定的关系。

本研究显示，在erα基因xbaⅰ位点多态性方面，go-s组aa基因型比例明显增高，等位基因a出现的频率明显增多，与gd组、go-l组差异具有统计学意义(p＜0.05)。与gd组相比，暴露于a等位基因的or(95％ci)为2.11(1.203-3.699),与go-l相比，暴露于a等位基因的or(95％ci)为2.45(1.312-4.575)，gd组和go-l组间基因型及等位基因频率无明显差异(p＞0.05)。说明aa基因型与gd的发生有关，是gd的易感基因型，并且与go的发生时间有着密切关系，是go早发的危险因素。正常对照组、gd组、go-s组和go-l组在pvuⅱ多态性的分布差异不具有统计学意义(p＝0.698)。

由于雌激素是免疫系统中重要的调节因子之一，它可以调节细胞因子的表达、抗原的提提呈和b淋巴细胞的增值。go形成过程中需要多种类的细胞因子及抗原提呈，b淋巴细胞可以有效的提呈抗原，产生重要的细胞因子。b细胞活化因子受体可以介导早期的浆细胞，并且是产生自身抗体的关键因素。自身抗体的产生也依赖与t细胞和b细胞之间的相互作用。erβ在免疫系统中的作用目前尚不清楚，但有研究表明通过erβ的产生的生物信号对免疫系统有抑制作用，如敲出erβ受体基因的小鼠可以出现慢性的淋巴细胞增殖。所以，雌激素受体基因多态性为go发生发展的研究提供了极为重要的理论依据。本部分研究证实erα基因xbaⅰ位点多态性在无眼征gd患者、早发go患者和迟发go患者之间存在差异，下一步将重点研究erα基因xbaⅰ位点多态性对gd和go患者免疫指标的影响，以期发现其导致go早发的免疫学因素。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。