用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂及其制备方法与应用与流程

本发明属于环境应用微生物领域，具体涉及一种用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂及其制备方法与应用。

背景技术：

近年来我国畜牧业发展迅速，随之产生的大量畜禽粪便不仅没有得到有效利用，而且造成了严重的环境污染。虽然利用畜禽粪便堆肥是资源化利用废弃有机物的理想途径，但仍存在许多问题，如堆肥过程中的氨气挥发，造成空气污染同时降低肥效；堆体升温慢，导致纤维素等有机大分子降解不充分而延长堆肥腐熟时间等等。针对这些问题，通常采用向堆肥中加入特定功能微生物的方法来控制氨挥发提高堆肥氮素含量、促使堆体快速升温、加快有机质降解，从而加速堆肥腐熟进程、提高堆肥产品品质，并有效减少环境污染。

目前普遍存在的问题是在复合微生物筛选培养过程中，缺乏基本的理论指导，导致筛选出的菌株功能性不强；而且，对复合培养的发酵过程及其各菌株之间的相互作用了解不足，导致产品活菌总数不高，使堆肥没有达到使用复合菌剂促进腐熟进程的理想效果。

技术实现要素：

针对此问题，本发明的目的在于提供一种具有使畜禽粪便堆肥快速升温、除味，减少氮素损失，提高堆肥效率和堆肥产品品质的用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂及其制备方法与应用。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

首先，本发明提供一种用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂，包括枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌和nitrobacillusharbinensisbm62，所述复合菌剂为固体菌剂。

其次，本发明提供上述用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)斜面培养活化：将枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌和nitrobacillusharbinensisbm62的菌种分别接种于相应的斜面培养基上，活化培养，使菌种活化；

(2)一级种子培养：将步骤(1)活化的菌种分别接种到液体培养基震荡培养，得到一级种子液；

(3)二级种子培养：将步骤(2)得到的一级种子液分别接种到发酵培养基中，发酵罐中发酵，得到二级种子液；

(4)菌种固体发酵培养：将步骤(3)得到的二级种子液接种到麸皮中，发酵后晾干，得到固体菌剂；

(5)复合菌剂制备：将枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌和nitrobacillusharbinensisbm62的固体菌剂混合，制成用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂。

步骤(1)所述的活化培养，枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，37℃培养2天；nitrobacillusharbinensisbm62接种于氨氧化菌斜面培养基，50℃培养3天。

步骤(2)所述液体培养基，枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌的液体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基；nitrobacillusharbinensisbm62的液体培养基为氨氧化菌液体培养基。

步骤(2)所述震荡培养，枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌在37℃、150r/min培养24-48h；nitrobacillusharbinensisbm62在50℃、120r/min培养72-96h。

步骤(3)所述发酵培养基，枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌的发酵培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基；nitrobacillusharbinensisbm62的发酵培养基为氨氧化菌液体培养基。

步骤(3)所述接种，接种的一级种子液占发酵培养基体积的10-15％；步骤(3)所述发酵，枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌在30-37℃、搅拌速度为150-200r/min，通气量为1:(1-1.5)(v/v·min)，培养2-3天；nitrobacillusharbinensisbm62在50℃、搅拌速度为120-150r/min，通气量为(0.5-1):1(v/v·min)，培养4-5天。

步骤(4)所述接种，二级种子液与麸皮的体积/质量比为1∶3(ml/g)；所述麸皮为灭菌麸皮；发酵条件为室温发酵，发酵时间为24-48h。

步骤(5)所述枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌和nitrobacillusharbinensisbm62的固体菌剂的质量比为(1-2):(1-2):(1-2):(1-2):(1-2)。

第三，本发明还提供上述用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂的应用，所述的复合菌剂用于畜禽粪便和农作物秸秆堆肥，包括如下步骤：

1)将水稻秸秆铡成段，与鲜鸡粪混合均匀，调节水分含量；

2)接种用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂，混合均匀后堆肥发酵。

所述应用具体为：

1)堆肥原料为新鲜鸡粪和水稻秸秆，将水稻秸秆铡成3-5cm的小段，与鲜鸡粪按照1:(3-4)的质量比混合均匀，调节水分含量至60～65％(wt)；

2)边建堆边添加菌剂，所述菌剂的量为(8-9)×10⁹cfu·kg^-1堆肥原料，接种后均匀混合，堆肥发酵；当温度上升到45-65℃时翻堆，每3d翻堆1次，温度下降到35℃以下后每5d翻1次，直至堆体温度下降至环境温度结束发酵。

有益效果

本发明的复合菌剂是功能互补的多种微生物复合菌系，兼具快速发酵产热、生物除臭保氮、快速有效分解纤维素大分子等多种功效，可使畜禽粪便堆肥快速升温、明显降低不愉快气味、降低堆肥中氮素损失、降低难降解有机物含量，从而加快堆肥物料的腐熟速度，提升堆肥产品品质。

附图说明

图1：实施例1堆肥化过程中温度的变化；

图2：实施例2堆肥化过程中温度的变化；

图3：实施例3堆肥化过程中温度的变化。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了以下实施例。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施方式中，枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌、nitrobacillusharbinensisbm62的来源分别为：

枯草芽孢杆菌(1.15792)2017年9月购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)；

莫哈韦芽孢杆菌(1.3656)2017年9月购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)；

皮特不动杆菌(10526)2017年6月购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)；

蜡状芽孢杆菌(1.10559)2017年9月购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)；

nitrobacillusharbinensisbm62是一种耐热芽孢杆菌，分类命名nitrobacillusharbinensis，实验室编号bm62，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏编号cgmccno.16237，保藏日期2018年8月13日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

以下实施方式中涉及的培养基配方为：

牛肉膏蛋白胨斜面培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂20g，水1000ml；

氨氧化菌斜面培养基：(nh4)2so45g，kcl4g，mgso42.5g，cacl21.85g，nacl3g，nahco342g，蛋白胨60g，牛肉膏40g，琼脂20g，蒸馏水1000ml；

氨氧化菌液体培养基：(nh4)2so45g，kcl4g，mgso42.5g，cacl21.85g，nacl3g，nahco342g，蛋白胨60g，牛肉膏40g，蒸馏水1000ml；

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，nacl5g，水1000ml。

实施例1：用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂的制备与应用

用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂的制备：

(1)斜面培养活化：将枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌和nitrobacillusharbinensisbm62的菌种分别接种于相应的斜面培养基上，活化培养，使菌种活化；

(2)一级种子培养：将步骤(1)活化的菌种分别接种到液体培养基震荡培养，得到一级种子液；

(3)二级种子培养：将步骤(2)得到的一级种子液分别接种到发酵培养基中，发酵罐中发酵，得到二级种子液；

(4)菌种固体发酵培养：将步骤(3)得到的二级种子液接种到麸皮中，发酵后晾干，得到固体菌剂；

(5)复合菌剂制备：将枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌和nitrobacillusharbinensisbm62的固体菌剂混合，制成用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂。

步骤(1)所述的活化培养，枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基，37℃培养2天；nitrobacillusharbinensisbm62接种于氨氧化菌斜面培养基，50℃培养3天；

步骤(2)所述液体培养基，枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌的液体培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基；nitrobacillusharbinensisbm62的液体培养基为氨氧化菌液体培养基；步骤(2)所述震荡培养，枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌在37℃、150r/min培养36h；nitrobacillusharbinensisbm62在50℃、120r/min培养80h。

步骤(3)所述发酵培养基，枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌的发酵培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基；nitrobacillusharbinensisbm62的发酵培养基为氨氧化菌液体培养基；步骤(3)所述接种，接种的一级种子液占发酵培养基体积的12％；步骤(3)所述发酵，枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌在34℃、搅拌速度为175r/min，通气量为1:1(v/v·min)，培养2天；nitrobacillusharbinensisbm62在50℃、搅拌速度为130r/min，通气量为1:1(v/v·min)，培养4天。

步骤(4)所述接种，二级种子液与麸皮的体积/质量比为1∶3(ml/g)；所述麸皮为灭菌麸皮；发酵条件为室温发酵，发酵时间为24h。

步骤(5)所述枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌和nitrobacillusharbinensisbm62的固体菌剂的质量比为1:1:1:1:1:1。

用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂的应用：

堆肥原料为新鲜鸡粪和水稻秸秆(调理剂)。将水稻秸秆铡成4cm左右的小段，与鲜鸡粪按照1:3-4的质量比混合均匀，调节水分含量至65％(wt)。该堆料有机质含量约为59.5％(wt)，c/n(质量比)约为30:1。

堆肥与采样方法：

堆料分a、b组，a组为对照样，进行自然堆肥；b组添加此实施例制备的复合菌剂。采用固态接种体，浓度为8-9×10⁹cfu·kg^-1，接种量为20g·kg^-1，接种后均匀混合堆体材料，置于30cm×40cm×50cm的发酵容器内。当温度上升到45℃开始翻堆，每3d翻堆1次，温度下降到35℃后每5d翻1次，直至堆体温度下降至环境温度结束发酵，以确保堆料获得充足的氧气。每间隔24小时测定纤维素含量、nh3挥发量、总n和含量，所有分析取样均采集3个平行样。

实验结果

堆肥过程中温度的变化

接种菌剂的堆肥在堆制后第2天就进入高温分解阶段(>45℃)(见图1)，并持续到第12天，之后温度逐渐下降，20天时降至35℃以下。整个堆肥过程中，高温期(2～12d)维持11天；自然堆肥的堆体温度虽然高于室温，但在整个实验周期内未能进入高温期。可见接种菌剂可明显提高堆肥化过程中，尤其是堆肥前期的微生物代谢活性，从而提高堆体温度，为有机物大分子的降解提供温度保证，加快堆肥腐熟进程。

堆肥过程中纤维素降解率、总n、含量及nh3挥发量变化

由表1可知，堆肥结束时，与对照堆肥相比，添加菌剂的堆肥中纤维素降解率提高19.83％，总氮损失率降低10％，含量增加46.6％，nh3挥发率降低35.5％，表明此复合功能菌剂可有效促进堆肥中纤维素类物质降解，减少nh3挥发，增加含量，从而减少氮素损失，有效降低难闻气味。

表1堆肥过程中纤维素降解率、总n、nh3挥发量变化

实施例2：用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂的制备与应用

与实施例1不同之处在于复合菌剂制备时的混合比例为：枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌和nitrobacillusharbinensisbm62固体菌剂按照2:2:1:1:1的质量比例混合。

堆肥原料和方法、采样与测定方法均与实施例1相同。

实验结果

堆肥过程中温度的变化

接种菌剂的堆肥同样也是在堆制后第2天就进入高温分解阶段(>45℃)(见图2)，高温期持续了14天，比实施例1延长了3天。

堆肥过程中纤维素降解率、总n、含量及nh3挥发量变化

由表2可知，堆肥结束时，与对照堆肥相比，添加菌剂的堆肥中纤维素降解率提高了21.73％，总氮损失率减少8.1％，含量增加39.7％，nh3挥发减少23.1％。

表2堆肥过程中纤维素降解率、总n、nh3挥发量变化

实施例3：用于畜禽粪便堆肥快速升温除味的多功能发酵复合菌剂的制备与应用

与实施例1不同之处在于复合菌剂制备时的混合比例为：枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、皮特不动杆菌、蜡状芽孢杆菌和nitrobacillusharbinensisbm62固体菌剂按照1:2:1:2:1的质量比例混合。

堆肥原料和方法、采样与测定方法均与实施例1相同。

实验结果

堆肥过程中温度的变化

接种菌剂的堆肥同样也是在堆制后第2天就进入高温分解阶段(>45℃)(见图3)，高温期持续了14天，比实施例1延长了3天。

堆肥过程中纤维素降解率、总n、含量及nh3挥发量变化

表3堆肥过程中纤维素降解率、总n、nh3挥发量变化

由表3可知，堆肥结束时，与对照堆肥相比，添加菌剂的堆肥中纤维素降解率提高了18.86％，总氮损失率减少了11.2％，含量增加了49.1％，nh3挥发减少42.6％。