一种高产蜜环菌的液体深层发酵工艺的制作方法

本发明主要涉及一种高产蜜环菌液体深层发酵工艺。

背景技术：

蜜环菌是既可食用又可药用的一类真菌，其子实体作为一种菌燕，味道鲜美，营养成分十分丰富，是一种低脂肪、高蛋白，富含纤维素、维生素、无机盐和多糖的保健食品。孙小卫等研究发现，有17种氨基酸可在蜜环菌菌索中测出，其中以亮氨酸含量最高，其它必需氨基酸大约占总氨基酸的35％，在非必需氨基酸中，谷氨酸和天冬氨酸占有最大份额，这两种氨基酸对脑神经有益。此外，蜜环菌菌索中有人体所需要的k、ca、p、mg等常量元素，其它元素如cu、zn、fe、mn、ge也有较高的含量。

蜜环菌营养丰富，同时具有药用价值。据报道，干的子实体含碳水化合物75.9％，粗蛋白11.4％，灰分7.5％，纤维素5.8％，脂肪5.2％，热量384千卡，除此之外还含有钾、韩、镁、铁、锌等11种矿物质元素，硒的含量在7.02mg/kg左右，锌含量丰富是一般食品3倍多。氨基酸的种类多达20多种，其还含有丰富的维生素等均属其他食品所罕见。消除人体疲劳的天门冬氨酸也达0.64mg/kg，高于其他食品。味道鲜美，属于世间稀有珍品。经常食用蜜环菌子实体，可对于用眼过度、眼炎、夜盲症、皮肤干燥、高血脂、高血压、动脉硬化、免疫力低下、消化道病等的患者人群有一定的疗效。其固体经过发酵后制成的产品，可以等同于天麻的药效作用，特别是一些引起弦晕的病症。

经过我国众多科研工作者的努力，目前已开发出多种与蜜环菌有关的药品和保健品，如:脑心舒口服液、蜜环菌浸膏、蜜环菌片、蜜环菌糖浆等，这些产品的开发，为我国的药物宝库增添了许多新的内容。蜜环菌是我国传统著名滋补防病保健中药材之一。随着研究的不断深入，人们对其滋补防病药效的认识逐渐加深。蜜环菌的需求数量也在不断扩大.生产工艺上应该向液体发酵的方向发展。继续开展蜜环菌有效成分检测、分离和纯化技术的研究.为开发新的保健品和药品奠定基础。

液体深层发酵过程受到众多因素的影响，比如培养基的营养成分，培养温度、ph、光照、通氧量、培养时间等等。为了能以最低成本，在最短的时间内获得最大量产品，迫切需要一种方法来优化发酵过程的各个控制参数，而化学计量学方法刚好能满足这些要求。它能以合理的实验设计方法，以最低的成本和最少的实验时间，从大量的发酵信息中提取有效信息，进而控制关键参数，优化发酵过程。本项研究综合利用以上主要技术研究筛选蜜环菌高产菌株及大规模发酵生产工艺，且该优良菌株具有多种生物活性，国内外未见报道。本项目实施后，将实现我国在蜜环领域研发的飞跃，产业化程度将大幅度提高，在多个关键环节会实现重大的技术突破。

技术实现要素：

本发明的目的是建立高产蜜环菌的液体深层发酵工艺，提供一种高产蜜环菌的液体深层发酵工艺，具有实现高产蜜环菌产业化生产的技术效果。一种高产蜜环菌液体深层发酵工艺，如图1所示，包括以下步骤：

步骤一：高产蜜环菌驯化选育；

步骤二：高产蜜环菌鉴定；

步骤三：高产蜜环菌种子发酵工艺建立；

步骤四：高产蜜环菌发酵罐发酵工艺建立；

步骤五：基于上述步骤一至四，高产蜜环菌200l发酵罐进行放大验证。

优选的是，在步骤一中，高产蜜环菌驯化选育方法：将蜜环菌于pda固体斜面培养基进行4℃保藏；将菌体接种至含100ml的无菌pda培养基中，26℃，150rpm摇床中活化7d；取发酵液样品，采用pda平板划线法和平板涂布法观察菌丝的生长状态；采用pda平板划线法和平板涂布法观察菌丝的生长状态，接种菌丝生长速度最快、状态最好的菌落至培养基中继续活化选育，传代10代后作为种子液，备用。

优选的是，在步骤二中，高产蜜环菌形态学特征：在pda培养基，25℃培养14d，菌落呈白色，质地丝绒状，直径15-17mm，表面微凸起，反面黄色，无渗出液产生，产生少量浅棕色可溶性色素；菌丝缠绕分支，有分隔，壁平滑透明，直径2.0-4.0μm，产生锁状联合。

优选的是，在步骤二中，所述高产蜜环菌为假蜜环菌(armillariamellea)，cgmccno.16370。

优选的是，在步骤三中，种子培养组成：蔗糖20g/l，葡萄糖10g/l，酵母浸粉10g/l，蛋白胨10g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁0.75g/l，维生素b10.01g/l，余量为去离子水。

优选的是，在步骤三中，种子培养条件及过程为：250ml摇瓶装入种子培养基100ml，接入5％的菌种活化培养液，26℃振荡转速为150rpm培养5d。

优选的是，在步骤四中，发酵培养基包括以下成分:

余量为去离子水。

优选的是，在步骤四中，所述培养基包括：30g/l食品葡萄糖，35g/l豆粕粉，1g/lkh2po4，1g/lmgso4·7h2o，1g/lnacl，0.01g/lvb1，余量为去离子水。

优选的是，在步骤四中，发酵条件为：

优选的是，在步骤四中，发酵条件为：接种量8％、温度25℃、ph4、转速150rpm、装液量60％，发酵时间3d。

本发明的有益效果体现在以下方面：

1、本发明驯化筛选获得具有较高干重的蜜环菌(armillariamellea)，通过基因序列比对鉴定其种属，证实其为蜜环菌属假蜜环菌。

2、本发明采用化学计量学方法，优化发酵工艺参数，同时对菌丝体干重和胞外多糖产量进行考察。应用单因素实验、plackett-burman实验和box-behnken实验，以及响应面分析方法对蜜环菌的发酵培养基和发酵条件进行优化，在此基础上对蜜环菌的10l和200l发酵罐的发酵工艺进行开发。最终确立该高产蜜环菌株的发酵工艺。

3、本发明所述一种高产蜜环菌的液体深层发酵工艺能够实现利用豆粕为氮源优化蜜环菌发酵工艺，实现蜜环菌产业化生产。

附图说明

图1为高产蜜环菌的液体深层发酵工艺流程图。

图2为葡萄糖浓度标准曲线。

图3为苯酚-硫酸标准曲线。

图4高产蜜环菌十代稳定性遗传考察曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

1实验材料与研究方法

1.1实验试剂

1.2实验仪器

1.3研究方法

研究内容包括高产蜜环菌株发酵工艺开发、菌粉制备工艺的开发、蜜环菌株检验方法建立。研究内容分为以下几方面：

摇瓶培养基及培养条件研发:利用sas、design-expert、origin等软件，采用p-b、b-b实验设计，结合响应面分析法对高产蜜环菌株发酵工艺进行优化。

200l发酵工艺优化研究:建立200l发酵工艺参数，进行发酵水平测定。

蜜环菌粉及发酵液质量标准建立:建立高产蜜环菌株胞外多糖检验方法，制定蜜环菌菌粉和发酵液的含量限度指标及检验方法。

1.4技术路线、研究过程与结果

技术路线见图1。

1.5研究过程与结果

1.5.1干重及胞外多糖含量检测方法的建立

菌丝体干重的测定：采用液体深层发酵获得蜜环菌丝体，通过100目滤布过滤分离，并用去离子水洗涤菌丝体，至滤液变为无色。攥干去除多余水分后，铺于平板中，于-40℃，0.075mbr条件下真空冷冻干燥，称重后研钵研磨至粉末，得到菌粉，并用于有效成分含量测定。

1.5.2发酵液中还原糖含量的测定

标准曲线的制作：选用无水葡萄糖，经烘烤至恒重作为总糖测定标准品，溶解稀释至1mg/ml备用。分别取0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5ml的葡萄糖标准品，补水至0.5ml。每个试管中加入1.5ml的dns试剂，沸水浴5分钟后立刻流动冷水冷却。每管中再加入4ml去离子水混匀，快速在540nm波长下测定吸光度值，绘制还原糖标准曲线，得回归方程，标准曲线如图2所示。

发酵液中还原糖含量的测定：精密量取胞外发酵液30ml，加入无水乙醇120ml，摇匀，4℃放置12小时，取出，离心，倾去上清液，沉淀加10ml去离子水溶解，摇匀，即得。每个试管中加入1.5ml的dns试剂，沸水浴5分钟后立刻流动冷水冷却。每管中再加入4ml去离子水混匀，快速在540nm波长下测定od值，并根据标准曲线计算样品中还原糖含量，dns标准曲线y＝0.6607x-0.0150，r2＝0.9992。

1.5.3发酵液中总糖含量的测定

应用苯酚-硫酸法测定发酵液中总糖含量。

选用无水葡萄糖，经烘烤至恒重作为总糖测定标准品，溶解稀释至1mg/ml备用。分别取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0ml的葡萄糖标准品，补充去离子水至1ml，转入试管中。每管中依次加入1ml6％苯酚和5ml硫酸，震荡混匀后静置十分钟，再水浴加热30摄氏度20分钟。迅速在490nm条件下测定其吸光度值，绘制标准曲线，得回归方程，标准曲线如图3所示。

1.5.4样品中总糖含量的测定

精密量取胞外发酵液30ml，加入无水乙醇120ml，摇匀，4℃放置12小时，取出，离心，倾去上清液，沉淀加10ml去离子水溶解，摇匀，即得。取0.5ml的上清于试管中，加去离子水至1ml，依次加入1ml6％苯酚和5ml硫酸，震荡混匀后静置十分钟，再水浴加热30摄氏度20分钟。在490nm下测定其吸光度值。根据标准曲线计算样品中总糖含量。

苯酚-硫酸标准曲线y＝9.6557x+0.0307，r2＝0.9997

发酵液胞外多糖得率的计算：

多糖含量＝总糖含量-还原糖含量

多糖得率(w/v％)＝[多糖含量(g)/发酵液体积(l)]×100

实施例1高产蜜环菌驯化选育及鉴定

1.1培养基的配制

pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，维生素b10.1g，琼脂粉2％，加去离子水煮沸30min，过滤，定容至1000ml。分装后于115℃，灭菌30min。

种子培养基(单位：g/l)：蔗糖20，葡萄糖10，酵母浸粉10，蛋白胨10，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.75，维生素b10.01，用去离子水定容至1000ml，ph自然。分装后于115℃，灭菌30min。

基础发酵培养基(单位：g/l)：食用葡萄糖20，豆粕粉20，磷酸二氢钾1，硫酸镁1，氯化钠1，维生素b10.01，用去离子水定容至1000ml，ph自然。分装后于115℃，灭菌30min。

1.2培养方法

菌种活化：100ml摇瓶装入种子培养基40ml，挑取斜面保存的高产菌株，26℃振荡(150rpm)培养7d。

种子培养：250ml摇瓶装入种子培养基100ml，接入5％的菌种活化培养液，26℃振荡(150rpm)培养5d。

发酵培养：500ml摇瓶装入发酵培养基200ml，接入5％种子培养液，26℃振荡(150rpm)培养3d。

1.3蜜环菌的驯化及选育

蜜环菌于pda固体斜面培养基进行4℃保藏。将菌体接种至含100ml的无菌pda培养基中，26℃，150rpm摇床中活化7d。取发酵液样品，采用pda平板划线法和平板涂布法观察菌丝的生长状态。接种菌丝生长速度最快、状态最好的菌落至培养基中继续活化选育，传代10代后作为种子液，备用。

实施例2高产蜜环菌株的鉴定

将筛选到的蜜环菌株委托中国食品发酵工业研究院微生物检测中心进行鉴定，通过观察形态特征、itsrdna和β-tubulin基因区段的dna序列分析方法进行鉴定，证明通过驯化选育获得的菌株为蜜环菌属假蜜环菌(armillariamellea)，将该菌株(分类名称：armillariamellea)保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc16370，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏于2018年9月25日。

实施例3高产蜜环菌生长曲线的绘制

采用摇瓶培养高产蜜环菌株，取16个规格为500ml的锥形瓶，编号为1、2、3、4、5、6.......16。用量筒准确量取200ml去离子水于称量好的锥形瓶中，搅拌均匀，加热后，高压蒸汽锅115℃灭菌。培养条件为温度26℃、接种量5％、转速150rpm、发酵时间120h。本实验摇瓶生长曲线初步探索是由0h开始，每隔24h测定其菌丝体干重、胞内多糖及胞外多糖含量，其生长曲线培养基配方如表1所示。

表1蜜环菌生长曲线培养基的配制

由表2中可以看出，在72h之前，随着培养时间的增加，其菌丝体干重、胞内多糖及胞外多糖含量显著升高。当培养时间超过72h，此时随着培养时间的增加，菌丝体和胞外多糖产量逐渐降低，推测可能是由于培养基中营养成分过度消耗，菌株代谢产物增加，发生菌丝体自溶现象导致的，因此，蜜环菌最佳培养时间为72h。

表2不同天数蜜环菌干重胞内外多糖含量测定结果

实施例4十代稳定性遗传考察

采用摇瓶培养高产蜜环菌株，培养条件为温度26℃、接种量5％、转速150rpm、发酵时间72h。发酵周期结束后取出一部分用于继续传代，其余的发酵液收集，检测菌粉干重及胞外多糖含量。考察菌株稳定性。连续十代。结果如图4所示。

根据图4所示。通过传代并检测蜜环菌在10代之内的菌丝体干重和多糖含量，发现并无明显减少情况。结果表明，在10代之内蜜环菌生长及发酵稳定。

实施例5蜜环菌摇瓶发酵培养基的优化

5.1单因素实验

5.11碳源种类及浓度筛选

在真菌液体培养中，碳源是培养基的主要成分，因为碳源是细胞骨架的主要成分，也是高等真菌生长和发育过程重要的营养物质，供给菌体生命活力所需的能量。碳源过多，则容易形成较低的ph值；碳源不足，菌体衰老和自溶。

本实验对葡萄糖、蔗糖、食品葡萄糖的种类进行筛选。每种碳源培养基平行两次实验，实验中测定菌丝体干重及多糖含量，以选择合适的碳源种类及浓度，结果如表3、表4所示。

表3摇瓶培养基碳源筛选方案

表4摇瓶培养基碳源筛选结果

经过碳源种类筛选得到，蔗糖为较好的碳源，考虑到工业生产成本因素，实验中采用食品葡萄糖作为摇瓶培养基碳源。

5.12氮源种类及浓度筛选

在真菌的生长过程中，氮源是合成氨基酸、蛋白质、核酸和细胞质的主要成分。有机氮源除含有丰富的蛋白质、肽类、游离氨基酸外，还含有大量的糖类、脂肪、无机盐、生长因子等，是微生物发酵的理想培养物质，它能被微生物缓慢利用，不易产生氮分解代谢物抑制现象。由于微生物生理特性、次级代谢产物合成途径的不同，因而有机氮源对不同菌种的生长以及代谢产物合成的影响也是不同的。而无机氮源的成分单一，质量稳定，能被微生物快速利用。

本实验对酵母浸粉、蛋白胨、豆粕粉的种类进行筛选。每种氮源培养基平行两次实验，实验中测定菌丝体干重及多糖含量，以选择合适的氮源种类，结果如表5、表6所示。

表5摇瓶培养基氮源筛选方案

表6摇瓶培养基氮源筛选结果

5.13无机元素浓度筛选

无机元素时微生物生长和代谢不可缺少的营养物质，其主要作用包括构成细胞的组织成分、调节渗透压、调节氢离子浓度等。因此，对真菌的生长发育具有重要的意义。

无机元素分为主要无机元素和微量无机元素。主要无机元素包括磷、硫、钾、镁等，因此通常向培养基加入kh2po4和mgso4。微量无机元素包括氯、铜、锌、锰、铝等，虽然含量极微、但能够强烈刺激微生物生长发育和代谢。通过单因素试验考察无机盐对蜜环菌发酵的影响，即在基础培养基添加k2hpo4，kh2po4，mgso4·7h2o，kcl，zncl2，znso4，nacl，各无机盐分别选取三个浓度0.1g/l，1g/l，5g/l。各无机盐培养基标号如表7所示。通过优化得到有助于蜜环菌生长的无机盐及其浓度。每种无机盐培养基平行两次实验，实验中测定菌丝体干重及多糖含量，以选择合适的无机盐的种类和浓度。实验结果如表8所示。

表7培养基无机盐种类及浓度

表8培养基金属离子种类及浓度优化结果

由实验结果可以看出，在原有培养基的基础上添加无机盐kh2po4，mgso4·7h2o，nacl，菌丝体干重、多糖含量都很高，有助于蜜环菌的生长，考虑到工业生产成本因素，因此选择1g/l的kh2po4，mgso4·7h2o，nacl添加到培养基中。

5.2plackett-burman设计实验

plackett-burman实验设计简称pb设计，是一种从多个因素中选取对实验指标有显著影响的因素的方法，因此pb设计是筛选设计的一种设计方法。

基于单因素实验的结果，我们进行plackett-burman实验设计筛选培养基中影响显著的成分。plackett-burman实验因子水平及编码值如表9所示。以菌丝体干重为考察指标，对蜜环菌液体发酵培养基组分进行影响显著性筛选，实验设计方案及结果如表10及表11所示；以胞外多糖含量为考察指标(响应值)，对蜜环菌液体发酵培养基组分进行影响显著性筛选，实验设计方案及结果如表12及表13所示。

表9plackett-burman试验因素水平及编码值

表10n＝9plackett-burman试验设计与结果

表11plackett–burman试验各因素参数的分析结果

经过二次多项回归拟合后，得到回归方程：

y1＝16.03167+1.8925x1+4.175x2-0.5525x3-0.616667x4+0.725x5-0.645x6-0.819167x7+0.615x8-0.611667x9

采用sasv8.02对实验结果进行线性回归分析。回归方程中各变量对响应值影响的显著性由f检验来判定,p>f的值越小,则相应变量的显著程度越高。由表11可以看出,回归方程也是高度显著的,相关系数r2为98.90％。方程中x1、x2影响显著。对豆粕粉、食品葡萄糖及氯化钠为因素，进行响应面法进一步优化。

表12n＝9plackett-burman试验设计与结果

表13plackett–burman试验各因素参数的分析结果

经过二次多项回归拟合后，得到回归方程：

y1＝0.480833+0.0675x1+0.165833x2+0.040833x3+0.005833x4+0.004167x5+0.004167x6-0.054167x7+0.0275x8-0.0025x9

采用sasv8.02对实验结果进行线性回归分析。回归方程中各变量对响应值影响的显著性由f检验来判定,p>f的值越小,则相应变量的显著程度越高。由表13可以看出,回归方程也是高度显著的,相关系数r2为97.48％。模型p值为0.108388，模型不显著。

box-behnken设计实验

根据plackett-burman设计实验的结果分析，逼近最大响应区采用中心旋转组合设计法，对影响蜜环菌发酵生产干重的关键因素进行研究和探索。中心旋转组合设计实验的因素和水平见表14，实验设计表见表15。以考察因子的编码值作为变量，菌丝体干重得率为响应值，采用sasv8.0的实验设计工具箱对实验数据进行回归拟合，并对拟合方程和相关的因素进行方差分析，可以得到多元二次回归方程和最佳菌丝体干重的发酵培养基配方。

表14中心旋转组合设计实验因素水平表

表15响应面实验设计和结果

表16回归模型方差分析

采用sasv8对实验结果进行线性回归分析，得到线性回归模型如下式

y1＝12.04375-1.739375*x1+7.075625*x2-0.32875*x3+4.41875*x1*x1

-3.92875*x1*x2-0.0575*x1*x3+4.01125*x2*x2-0.345*x2*x3

其中响应值y为菌丝体干重得率，x1、x2和x3分别为工业葡萄糖、豆粕粉和nacl浓度的编码值。回归方程中各变量对响应值影响的显著性由f检验来判定，p值越小，则相应变量的显著程度越高。

回归分析结果如表16所示，由表16可以看出，本实验所选用的模型不显著(p>0.05)，拟合度一般，预测值和实测值之间的相关性(r2＝0.8967)。方程中x2对响应值的影响最为显著。在各影响因素中，豆粕粉(p<0.05)对蜜环菌干重得率的影响最大。

首先通过单因素实验筛蜜环菌摇瓶培养基最优碳、氮源和无机盐的种类，优化出有利于蜜环菌发酵的碳源—食品葡萄糖、氮源—豆粕粉、无机盐—1g/lkh2po4，1g/lmgso4·7h2o，1g/lnacl。

然后分别以菌丝体干重和多糖含量为响应值，采用9因素2水平的plackett-burman设计实验方案和线性回归模型筛选出培养基成分中影响显著的因素为食品葡萄糖、豆粕粉。在此基础上，采用中心组合设计实验结合多元线性回归模型对培养基中对菌丝体干重影响显著的成分进行了进一步的优化，模型并不显著。因此，在plackett-burman实验基础上，综合考察菌丝体干重，胞内胞外多糖含量，最终确定高产菌株蜜环菌最佳培养基配方为：30g/l食品葡萄糖，35g/l豆粕粉，1g/lkh2po4，1g/lmgso4·7h2o，1g/lnacl，0.01g/lvb1。

验证试验

采用高产菌株蜜环菌最佳培养基配方：30g/l食品葡萄糖，35g/l豆粕粉，1g/lkh2po4，1g/lmgso4·7h2o，1g/lnacl，0.01g/lvb1，进行3次平行的验证实验。发酵条件为：种龄3d，接种量5％，发酵温度25℃，摇床转速150rpm。如表17所示，验证发酵结果表明，优化后的培养基满足蜜环菌株的发酵要求。

表17验证试验结果

实施例6蜜环菌发酵条件的优化

plackett-burman设计法是一种两水平的实验设计方法，它试图用最少的试验次数达到因子的主效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最为重要的几个因子，供进一步优化。

本研究首先通过plackett-burman设计实验初步筛选培养条件中对于菌丝体干重影响显著的因素。以接种量、温度、ph、转速和装液量为试验因子，进行8因子2水平的pb试验。因素水平表和实验结果见表18。

表18plackett-burman实验方案和结果

利用sas软件对实验结果进行回归分析，回归分析见表19。

表19回归分析结果

对plackett-burman实验结果进行回归分析得到的方程为：

y＝16.69217+0.035667*x1-1.477833*x2-0.212833*x3+0.855*x4+0.6935*x5+0.912833*x6+1.1005*x7+0.903167*x8

如之前的实验，结果表明，在各项培养条件中，仅有温度对蜜环菌株的发酵存在显著影响，而其余因素的变化均无明显差异。因此，根据干重，选取蜜环菌株的最佳培养条件为：接种量8％、温度25℃、ph4、转速150rpm、装液量60％，发酵时间3d。

实施例7蜜环菌10l、200l发酵工艺建立

根据之前的研究结果，采用10l和200l发酵罐进行放大，以模拟和验证蜜环菌在生产过程中的状态。前期条件及准备工作如下：

菌种活化：100ml摇瓶装入种子培养基40ml，挑取斜面保存的高产菌株，26℃振荡(150rpm)培养7d。

种子培养基(单位：g/l)：蔗糖20，葡萄糖10，酵母浸粉10，蛋白胨10，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁0.75，维生素b10.01，用去离子水定容至1000ml，ph自然。分装后于115℃，灭菌30min。

种子培养条件：250ml摇瓶装入种子培养基100ml，接入5％的菌种活化培养液，26℃振荡(150rpm)培养5d。

发酵培养基(单位：g/l)：食用葡萄糖30，豆粕粉35，磷酸二氢钾1，硫酸镁1，维生素b10.01，氯化钠1；

发酵培养条件：接种量5％、温度25℃、ph4、转速150rpm、发酵罐装液量60％，发酵时间3d。

活化一株蜜环菌株，待完全长满后，接种至种子培养基中，培养7d，传代使种子液体积足够用于接种至发酵罐中。发酵前一天，将发酵罐洗刷干净，之后倒入约总体积的60％的去离子水，在121℃，30min条件下灭菌，保证内部无杂菌污染。

发酵当天，将预称好的培养基从投料口倒入发酵罐中，调节好各个阀门后进行灭菌操作。待罐内温度冷却至培养温度时，在投料口周围布置火圈，从火圈中倒入种子液进行接种，完毕后迅速关闭投料口，并调节发酵参数进行发酵。

发酵结束后，下罐，将发酵液通过滤布使菌丝体和发酵液分离，并攥干留存，菌丝体用于冻干制备菌粉；量取胞外发酵液体积，取适量用于检测胞外多糖含量。下罐完毕清理发酵罐，并同发酵之前的操作进行灭菌，保证罐内清理干净无杂质。

获得的菌粉称重，并参照之前的方法检测菌粉干重及发酵液中胞外多糖含量，以进行产量验证。发酵罐产量如表20所示。

表20蜜环菌发酵罐产量验证

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。