本发明属于微生物技术领域，涉及一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用，具体涉及一种治理重金属汞污染农田的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
汞是全球广泛关注的污染物之一。国内外很多地方的土壤都受到不同程度的汞污染。我国汞污染主要集中于贵重、吉林、山西、湖北、辽宁和重庆等地。土壤中汞的来源十分广泛，包括土壤母质、大气汞的干湿沉降、含汞废水排放、含汞固体废弃物堆积等。汞危害极大，不仅会导致肌萎缩性脊髓侧索硬化症，老年痴呆症和帕金森症等多种疾病。甲基汞更是会对神经系统和心血管系统造成威胁。土壤中的汞污染具有潜伏性，当其浓度达到一定程度会严重阻碍植物的生长并导致死亡，还会影响食品安全。
目前场地或土壤中的汞污染治理主要有两条途径：一是改变汞在土壤中的存在形态或同土壤的结合方式，由活跃价态转变成稳定价态或者生成不溶沉淀物，从而降低其生物毒性和在环境中的可迁移性与生物可利用性；二是将汞从土壤中彻底清除，使土壤中汞的浓度接近或达到背景含量水平。汞污染土壤修复方法主要有：客土法、固化稳定化法、土壤淋洗法、硫化物沉淀法、电动修复法、热解析法、植物修复法以及微生物修复法等。
cn1326991c公开了一种高耐汞恶臭假单孢菌株chy-7及其在治理汞污染中的应用，属利用微生物实施环保治理的项目。该菌株为恶臭假单孢菌(pseudomonasputida)chy-7，已保藏“中国典型培养物保藏中心”。该菌株是从汞污染的土壤中分离得到的；适宜在中性及弱酸性或弱碱性培养介质中常温培养，也可在自来水和土壤中生长；其细菌学形态特征：为革兰氏阴性杆菌，长度为2.0-4.0×0.7-1.1μm，不产生芽孢，专性好氧；属于恶臭假单孢菌，菌落淡黄色、边缘光滑隆起，在色素生成培养基中可产生荧光。该发明从土壤中直接分离、筛选高耐汞、生长营养要求低、适应自然生态环境且生存能力强。但该菌株随施用时间延长活力下降，对汞的稳定作用差。
cn107099483a公开了一种复合生物制剂在处理含汞废水中的应用，其复合生物制剂为恶臭假单胞菌、地衣芽孢杆菌、阴沟肠杆菌、嗜热侧孢霉菌以及蜡状芽孢杆菌。但该复合生物制剂各菌株生长受抑制，后期处理污染的效率下降，且所述菌剂适合水体环境，修复土壤的效果不显著。
cn105733958a公开了一种生物修复剂，包括尖孢镰刀菌。该发明还提供一种如上所述尖孢镰刀菌或生物修复剂在植物修复重金属污染土壤中的应用。本发明提供的植物内生真菌尖孢镰刀菌对重金属耐性强，对土壤重金属污染的修复既安全又环保。
单独使用耐重金属的菌株效果不明显，菌株后期生长受抑制，生物量减少，而多种高耐受重金属的菌株组合使用常伴随不同菌种间的生长竞争，因此提供一种具有显著耐汞且生长互相促进的复合微生物菌剂用于重金属汞污染土壤的修复，具有重要意义和广阔前景。
技术实现要素：
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用，本发明的复合微生物菌剂配方合理，四种菌相互促进，有效稳定污染土壤中的汞，降低植物体内的汞含量。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种复合微生物菌剂，所述复合微生物菌剂包括酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌。
复合菌剂的使用效果会受不同菌种生长习性的影响，盲目的复合极易造成菌种间的拮抗，影响效果发挥。本发明特异性选择酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌进行组合，协同促进复合菌剂对汞的稳定效率，降低污染土壤中汞元素对植物的影响，解决土壤重金属污染，本发明所述复合微生物菌剂配方合理，各菌种间不发生拮抗，处理污染土壤的效率高。
本发明中，菌种均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)或中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)，其中，酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其保藏标号分别为
优选地，所述酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌的重量比为(1-3):(1-5):(1-2):(1-3)，例如可以是2:4:1:2、1:1:1:1、3:5:2:3、1:3:2:1或2:2:1:3，优选为2:4:1:2。
本发明发现，酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌在所述重量比范围内无生长抑制现象，各菌种协同增效，对汞的稳定作用较单一菌株效果明显，同时，菌株生理代谢的产物可作为营养元素，促进植物生长。
优选地，所述复合微生物菌剂的有效活菌数不低于2.0亿/g。
优选地，所述复合微生物菌剂中的任一种菌的有效活菌数不低于0.01亿/g。
本发明中，复合微生物菌剂中的有效活菌数满足《农用微生物菌剂(gb20287-2006)》的标准。
第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的复合微生物菌剂的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：分别活化酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，得到发酵用种子液；
(2)发酵罐扩大培养：将步骤(1)所得种子液分别接种至发酵罐中，通气搅拌培养，得菌悬液；
(3)将步骤(2)所得菌悬液分别加入固态发酵培养基中进行固态发酵，得四种菌的菌剂；
(4)将步骤(3)所得菌剂按比例混合均匀得复合微生物菌剂。
优选地，步骤(1)所述活化的代数为2-5代，例如可以是2代、3代、4代或5代。
本发明中，四种菌均为市售可获得的菌株，菌种以干粉形式保存，生长延迟较长，使用时先将干粉状菌株活化，需经过至少两次继代培养才能正常生长，将活化的菌种通过培养皿平板继代第三次后可作为后续工作菌种进行扩大培养。
优选地，步骤(2)所述接种的接种量为2-8％，例如可以是2％、3％、4％、5％、6％、7％或8％。
本发明中，经活化后的菌种，再经过锥形瓶液体培养基扩大培养为一级种子液，然后进一步扩大培养，得到二级种子液，最后将二级种子液接种至种子罐中扩大培养，得到发酵用种子液。菌种经过层层活化过程，菌体活力不断提高，将发酵用种子液接种至发酵罐进行发酵培养，其中种子液占发酵液的比例为2-8％，在此范围内菌种活化程度最好，菌体活力高，制备得到的复合微生物菌剂对汞的稳定效率高。
优选地，所述通气的通气量为1-3m3/h，例如可以是1m3/h、1.5m3/h、2m3/h、2.1m3/h、2.5m3/h、2.8m3/h或3m3/h，优选为2.1-2.8m3/h。
优选地，所述搅拌的转速为100-150rpm，例如可以是100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm或150rpm，优选为120rpm。
优选地，所述发酵的温度为22-27℃，例如可以是22℃、23℃、24℃、25℃、26℃或27℃，优选为25℃。
优选地，所述发酵的时间为3-7天，例如可以是3天、4天、5天、6天或7天。
本发明中，通过组合通气量、搅拌转速、发酵温度以及发酵时间，使菌体活力最佳，制备得到的复合菌剂对汞的稳定率高。
优选地，步骤(3)所述固态发酵的培养基包括玉米粉200-250份，麦麸200-250份，豆粕粉200-250份，草炭300-350份，硫酸镁5-10份。
所述玉米粉的重量份数为200-250份，例如可以是200份、210份、220份、230份、240份或250份。
所述麦麸的重量份数为200-250份，例如可以是200份、210份、220份、230份、240份或250份。
所述豆粕粉的重量份数为200-250份，例如可以是200份、210份、220份、230份、240份或250份。
所述草炭的重量份数为300-350份，例如可以是300份、310份、320份、330份、340份或350份。
所述硫酸镁的重量份数为5-10份，例如可以是5份、6份、7份、8份、9份或10份。
本发明中，通过优化固态培养基的组成和重量份数，提高菌种综合性能，提高复合微生物菌剂稳定汞的效率，其中豆粕粉也可以是菜粕粉或芝麻粉，草炭也可以是锯末，硫酸镁也可以是硫酸锌。
优选地，步骤(3)所述菌悬液与固态培养基的体积质量比为(0.3-1):1，例如可以是0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1或1:1。
本发明中，菌悬液与固态培养基的体积质量比在所述范围内，可以有效保证混合发酵时的含水率处于30-100％，适合固态发酵。
优选地，步骤(3)所述固态发酵的温度为25-27℃。
优选地，步骤(3)所述发酵的时间为25-35天，优选为30天。
优选地，步骤(3)所述发酵还包括翻拌过程。
优选地，所述翻拌为每7-10天对固态发酵培养基进行翻拌。
本发明中，发明人发现，每7-10天翻拌一次固态培养基可使得菌体生长状态最好，同时可以有效控制发酵温度。
优选地，所述方法具体包括如下步骤：
(1)菌种活化：分别活化酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，活化2-5代，扩大培养至二级种子液，接种至种子罐中进一步扩打培养，得到发酵用种子液；
(2)发酵罐扩大培养：将步骤(1)所得种子液分别接种至发酵罐中，接种量为2-8％，通气搅拌培养，通气量1-3m3/h，搅拌的转速为100-150rpm，发酵3-7天，发酵温度为22-27℃，得菌悬液；
(3)将步骤(2)所得菌悬液分别加入固态发酵培养基中进行固态发酵，得四种菌的菌剂，固态发酵的培养基包括玉米粉200-250份，麦麸200-250份，豆粕粉200-250份，草炭300-350份，硫酸镁5-10份，菌悬液与固态培养基的体积质量比为(0.3-1):1，固态发酵的温度为25-27℃，发酵25-35天，每7-10天翻拌一次；
(4)将步骤(3)所得菌剂按比例混合均匀得复合微生物菌剂。
第三方面，本发明提供一种包括如第一方面所述的复合微生物菌剂的组合物，所述组合物还包括腐殖质。
优选地，所述复合微生物菌剂和腐殖质的质量比为1:(1-3)，例如可以是1:1、1:2或1:3。
本发明中，腐殖质可有效提高菌体活力，直接或间接改善土壤温度、水分及透气状况，调节土壤ph，促进土壤微生物的生长和繁殖。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的复合微生物菌剂或如第三方面所述的组合物用于汞污染土壤治理的用途。
优选地，所述复合微生物菌剂的添加量为污染土壤的3-8％，例如可以是3％、4％、5％、6％、7％或8％，优选为5％。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明组合配比酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，使四株菌协同增效，调节菌体之间的代谢平衡，使复合菌剂高效稳定污染土壤中的汞，降低植物体内的汞含量；
(2)本发明通过优化酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌的培养条件，提高菌体活力，提高菌体对汞的稳定效率；
(3)本发明将复合微生物菌剂与腐殖质组合配比，进一步提高菌剂对污染土壤中汞的稳定效率，降低了作物对汞的可利用性，也可以促进植物生长，提高作物产量。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
一种复合微生物菌剂，包括酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，其制备方法如下：
(1)菌种活化：分别活化酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，活化3代，扩大培养至二级种子液，接种至种子罐中进一步扩大培养，得到发酵用种子液；
(2)发酵罐扩大培养：将步骤(1)所得种子液分别接种至发酵罐中，接种比例为发酵用种子液占发酵液的5％，通气搅拌培养，通气量2.8m3/h，搅拌的转速为120rpm，发酵5天，发酵温度为25℃，得菌悬液；
(3)将步骤(2)所得菌悬液按比例加入固态发酵培养基中进行固态发酵，得四种菌的菌剂，固态发酵的培养基包括玉米粉250份，麦麸250份，豆粕粉200份，草炭300份，硫酸镁8份，菌悬液与固态培养基的体积质量比为0.5:1，固态发酵的温度为25℃，发酵30天，每7天翻拌一次；
(4)将步骤(3)所得菌剂按酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌质量比为2:4:1:2混合均匀得复合微生物菌剂。
实施例2
一种复合微生物菌剂，包括酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，其制备方法如下：
(1)菌种活化：分别活化酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，活化4代，扩大培养至二级种子液，接种至种子罐中进一步扩大培养，得到发酵用种子液；
(2)发酵罐扩大培养：将步骤(1)所得种子液分别接种至发酵罐中，接种比例为发酵用种子液占发酵液的4％，通气搅拌培养，通气量2.1m3/h，搅拌的转速为150rpm，发酵6天，发酵温度为25℃，得菌悬液；
(3)将步骤(2)所得菌悬液按比例加入固态发酵培养基中进行固态发酵，得四种菌的菌剂，固态发酵的培养基包括玉米粉200份，麦麸250份，豆粕粉250份，草炭300份，硫酸镁6份，菌悬液与固态培养基的体积质量比为0.7:1，固态发酵的温度为27℃，发酵28天，每8天翻拌一次；
(4)将步骤(3)所得菌剂按酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌质量比为3:5:2:3混合均匀得复合微生物菌剂。
实施例3
一种复合微生物菌剂，包括酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，其制备方法如下：
(1)菌种活化：分别活化酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，活化5代，扩大培养至二级种子液，接种至种子罐中进一步扩大培养，得到发酵用种子液；
(2)发酵罐扩大培养：将步骤(1)所得种子液分别接种至发酵罐中，接种比例为发酵用种子液占发酵液的2％，通气搅拌培养，通气量1m3/h，搅拌的转速为100rpm，发酵3天，发酵温度为27℃，得菌悬液；
(3)将步骤(2)所得菌悬液按比例加入固态发酵培养基中进行固态发酵，得四种菌的菌剂，固态发酵的培养基包括玉米粉250份，麦麸200份，豆粕粉200份，草炭350份，硫酸镁10份，菌悬液与固态培养基的体积质量比为0.3:1，固态发酵的温度为22℃，发酵35天，每9天翻拌一次；
(4)将步骤(3)所得菌剂按酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌质量比为1:1:1:1混合均匀得复合微生物菌剂。
实施例4
一种复合微生物菌剂，包括酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，其制备方法如下：
(1)菌种活化：分别活化酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，活化2代，扩大培养至二级种子液，接种至种子罐中进一步扩大培养，得到发酵用种子液；
(2)发酵罐扩大培养：将步骤(1)所得种子液分别接种至发酵罐中，接种比例为发酵用种子液占发酵液的8％，通气搅拌培养，通气量3m3/h，搅拌的转速为120rpm，发酵7天，发酵温度为22℃，得菌悬液；
(3)将步骤(2)所得菌悬液按比例加入固态发酵培养基中进行固态发酵，得四种菌的菌剂，固态发酵的培养基包括玉米粉220份，麦麸230份，豆粕粉230份，草炭320份，硫酸镁5份，菌悬液与固态培养基的体积质量比为1:1，固态发酵的温度为25℃，发酵25天，每10天翻拌一次；
(4)将步骤(3)所得菌剂按酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌质量比为1:3:2:1混合均匀得复合微生物菌剂。
实施例5
与实施例1相比，除了酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌质量比为4:1:1:1之外，其他条件同实施例1。
实施例6
与实施例1相比，除了酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌质量比为1:6:1:1之外，其他条件同实施例1。
实施例7
与实施例1相比，除了酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌质量比为1:1:3:1之外，其他条件同实施例1。
实施例8
与实施例1相比，除了酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌质量比为1:1:1:4之外，其他条件同实施例1。
对比例1
与实施例1相比，除了不添加酿酒酵母，但复合微生物菌剂的总添加量相同之外，其他条件同实施例1。
对比例2
与实施例1相比，除了不添加尖孢镰刀菌，但复合微生物菌剂的总添加量相同之外，其他条件同实施例1。
对比例3
与实施例1相比，除了不添加细极链格孢菌，但复合微生物菌剂的总添加量相同之外，其他条件同实施例1。
对比例4
与实施例1相比，除了不添加恶臭假单胞菌，但复合微生物菌剂的总添加量相同之外，其他条件同实施例1。
对比例5
与实施例1相比，除了只添加酿酒酵母，但复合微生物菌剂的总添加量相同之外，其他条件同实施例1。
对比例6
与实施例1相比，除了只添加尖孢镰刀菌，但复合微生物菌剂的总添加量相同之外，其他条件同实施例1。
对比例7
与实施例1相比，除了只添加细极链格孢菌，但复合微生物菌剂的总添加量相同之外，其他条件同实施例1。
对比例8
与实施例1相比，除了只添加恶臭假单胞菌，但复合微生物菌剂的总添加量相同之外，其他条件同实施例1。
汞污染土壤修复实验
采用实施例1-8和对比例1-8所述复合微生物菌剂进行汞污染土壤的盆栽修复试验，土壤样品取自贵州铜仁某汞污染农田，汞浓度为5mg/kg，浸出毒性超出《土壤环境质量标准》ⅱ级标准10倍。分别准备三组汞污染农田土壤(三个平行组实验，每组17份、每份5kg)，装入种植箱内。
每组实验设置如下：分别向16个箱体中添加实施例1-8和对比例1-8所述的微生物菌剂，添加量为污染土壤的5％，第17个箱体作为空白对照不加菌剂。将菌剂加入后与污染土壤均匀混合，控制含水率20-50％，每隔10天搅拌一次，30天后取样进行汞浸出浓度的检测，检测方法参见《中华人民共和国环境保护行业标准》hj/t300-2007，结果见表1。
表1微生物菌剂对汞的稳定效果
由表1可知，比较实施例1与实施例5-8可知，在本发明所述酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌的质量比范围内，土壤浸出浓度低，复合微生物菌剂对汞的稳定效率高，四种菌协同增效，任一种菌过量均会影响四种菌的生长代谢平衡，降低复合微生物菌剂对汞的稳定作用；比较实施例1与对比例1-8可知，酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌四种菌缺一不可，不同菌种之间互相促进，有效提高菌剂对污染土壤中汞的稳定效率，浸提液的浓度低至0.006mg/l，达到《污水综合利用排放标准》。
小白菜种植实验
将测定汞浸出浓度后的土壤样本进行小白菜种植实验，将小白菜籽施放于所述污染土壤中，控制盆栽箱体在同样温度、湿度及其光照条件，28天后收获小白菜地上部分进行称重对比，检测小白菜体内汞含量，结果见表2。
表2小白菜鲜重及体内汞含量
由表2可知，比较实施例1与实施例5-8与对比例1-8可知，复合微生物菌剂在本发明所述的配比范围内效果最佳，且菌剂对小白菜的生长有促进作用，不同菌剂处理后的小白菜鲜重有所提高，但涨幅不大，说明菌剂不影响植物的正常生长反而会促进生物量积累。同时，复合微生物菌剂显著降低小白菜体内汞含量，实施例1的菌剂效率最高，可从对照组的0.084mg/kg降低至0.019mg/kg。
用于修复土壤的组合物
实施例9
选择实施例1为最优实施例，制备用于修复土壤的组合物，所述组合物包括如实施例1的复合微生物菌剂和腐殖质，其中复合微生物菌剂和腐殖质的质量比为1:2。
将上述组合物用于污染土壤重金属汞的稳定实验以及小白菜种植实验，通过复合微生物菌剂与腐殖质的配合，可进一步降低污染土壤中汞浸出浓度至0.004mg/l，小白菜体内汞含量降低至0.015mg/kg，小白菜鲜重97.89g与其他实施例无明显差异，说明通过添加腐殖质，可以促进复合微生物菌剂对汞的稳定效率，降低植物体内汞的含量。
实施例10
与实施例9相比，除了复合微生物菌剂和腐殖质的质量比为2:1外，其他条件同实施例9。
汞浸出浓度为0.07mg/l，白菜体内汞含量降低至0.021mg/kg，小白菜鲜重97.92g，比较实施例9和实施例10可知，本发明所述复合微生物菌剂与腐殖质的质量比范围内能进一步促进菌剂对汞的稳定效率，但过多的腐殖质反而使菌剂效率略有下降。
综上，本发明组合配比酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌，使四株菌协同增效，调节菌体之间的代谢平衡，使复合菌剂高效稳定污染土壤中的汞，降低植物体内的汞含量；优化酿酒酵母、尖孢镰刀菌、细极链格孢菌和恶臭假单胞菌的培养条件，提高菌体活力，提高菌体对汞的稳定效率；通过添加腐殖质并特异性选择复合微生物菌剂与腐殖质的质量比，进一步提高复合微生物菌剂的效果，稳定污染土壤中的重金属汞。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。