一种高效分离脐带胎盘间充质干细胞的方法及应用与流程

本发明涉及干细胞领域，尤其是分离培养人脐带、胎盘间充质干细胞的方法，在培养中我们添加了胎盘组织液，最大程度上模拟了细胞原本生长环境，使得细胞起步更平稳、增殖更快。

背景技术：

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞的发育阶段分为两类:胚胎干细胞和成体干细胞。间充质干细胞（msc），是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够发育成骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。最初msc提取大多数来自骨髓，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓msc移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性大，直接影响了骨髓msc的临床应用，替代骨髓msc的间充质干细胞来源迫在眉睫。

脐带、胎盘是产妇生产后的“废弃物”。脐带包括一条静脉和两条动脉，周围是wharton’sjelly，外层由羊膜来源的上皮包裹。胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，由羊膜层、蜕膜层等组成。脐带的wharton’sjelly、胎盘的羊膜层和蜕膜层中有着丰富的间充质干细胞，而且相对骨髓间充质干细胞具有更高的增殖能力，更低的免疫原性以及更高的分化潜能，而且采集过程简单，无任何危害损伤及伦理学困扰。以上原因使脐带、胎盘间充质干细胞更适合临床的应用。但是，脐带、胎盘组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，传统的方法不仅对脐带、胎盘来源细胞伤害大，回收效率低，杂细胞多，细胞增殖速率慢，而且污染风险大，本发明恰恰从来源上保证安全无污染，而且提供了一个简单和高效的脐带、胎盘组织分离、培养、冻存间充质干细胞的方法，足以满足医药、科研、临床等领域的需求。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有获取脐带、胎盘间充质干细胞方法的缺陷，提供一种实用简单的从脐带、胎盘中大量分离间充质干细胞的方法。本发明采用方法回收率和纯度，增殖能力比传统方法都有显著提高，而且无污染确保在临床中的安全应用。

1.来源上，我们选取经过严格身体筛查的产妇及胎儿的脐带、胎盘，确保健康，确保没有遗传病、确保没有感染性疾病及病原体携带，确保无污染，并且会留有产妇及胎儿信息留档以便查证；

2.脐带、胎盘取出后经由专业有资质的人员处理，用含有青链霉素和咪康唑的生理盐水将脐带、胎盘表面的血渍初步清洗干净，避免红细胞裂解，造成细胞内物质污染脐带、胎盘组织，将脐带、胎盘放入保存液中，低温冷链2-8℃全程监控快速运输到实验室，即到即处理（72h内）；

3.脐带、胎盘组织进入实验室必须遵守严格制度，登记相应表格，交由专业人员快速用含有青链霉素和咪康唑的pbs溶液冲洗胎盘组织，洗去残留的保存液和血渍，选取质量较好部分，用经过121℃，103.4kpa灭菌的手术器械，剥离组织块；

4.将组织块进一步切割成1-3mm³大小浸润在pbs溶液中，组织消化液37℃，摇床处理10-30min，室温静置20-40min，2-8℃静置冷消化12-24h；

5.根据方法4，组织消化液包含胰蛋白酶、胶原酶ⅱ、ⅳ、分散酶、edta、脂肪酶中的一种或多种酶，0.25%胰酶、0.05-0.2%的edta、0.1-1%胶原酶ⅱ、ⅳ、0.1mg/ml分散酶、0.1-0.2%脂肪酶，相对单一酶消化效率显著提高；

6.根据方法4，37℃，摇床处理10-30min，室温静置20-40min，2-8℃静置冷消化12-24h，方法多元，更加适合大量样本处理；

7.消化结束后，经200目筛网过滤，细胞滤液1200-1600rpm离心10分钟，再用pbs冲洗一次，然后经羟乙基淀粉或ficoll分离液2000rpm无升降离心20min，纯化所需单细胞，滤网内的组织块经消化后比较松散，研磨会造成细胞损伤，所以采用pbs冲洗一次，1000rpm离心10min；

8.将细胞和组织块分别接种到t75细胞培养瓶，细胞密度在0.5-1*10⁶/ml,每瓶10mlmsc培养基，37℃，5%co2，培养3-4天后，如果出现大克隆，胰酶消化，添加新鲜培养基及20-50%经过2000rpm离心原液重贴，掉落的组织块重新再贴，采用这样的换液方法对细胞环境影响较小，对数期会延长；

9.根据方法8，在msc培养基中添加胎盘组织液、egf因子、胰岛素等因子，更好的模拟胎盘环境，让细胞快速增殖；

10.8-10天左右，细胞融合会达到90%,0.01%胰酶消化传代，每t75瓶接种1*10⁶/ml,每瓶10ml,2-3天融合率会达到90%，传代不超过7代；

11.细胞冻存1*10⁶/支，每支1ml，冻存液采用10%dmso、10%人白、30%羟乙基淀粉、50%msc培养基，程序降温，最后液氮保存，严格记录，随用随取；

12.根据方法10、11，每一次的传代和冻存都做留样处理，并做安全监测；

细胞培养前后、冻存、复苏；细胞数目、活率及表型检测；安全性检测包括以下一项或多项：细菌、真菌、支原体、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、人白残留、抗生素残留等；生物学效力包括其免疫抑制力检测，客户资料、培养时间、各项数据统一归档

附图说明：

图1是底蜕膜、羊膜、脐带三种间充质干细胞光镜观察图（200×）。

图2是底蜕膜、羊膜、脐带三种间充质干细胞成脂、成骨分化能力图（200×）。（成脂分化：箭头所指为脂滴；成骨份化：箭头所指为钙化结节）

图3是底蜕膜、羊膜、脐带三种间充质干细胞流式检测表面标志图。

具体实施方式

实施例1、

一、试剂

胰蛋白酶、胶原酶ⅱ、ⅳ、分散酶、edta、脂肪酶，胎盘组织液、egf因子，胰岛素，羟乙基淀粉，dmso购自sigma公司。无血清的msc培养基为公司自制。保护液配制：为公司自制

消化液配制：胰蛋白酶浓度：0.25%，胶原酶ⅱ：0.5mg/ml,胶原酶ⅳ：1mg/ml分散酶浓度：0.1mg/ml。

二、取材、运输、分离，扩增和冻存

材料取自健康孕妇分娩或剖腹产后废弃的脐带、胎盘，要求孕妇有完整的健康体检报告，不能有遗传疾病，感染性疾病及携带，在取材过程中严格按照无菌操作。所用的脐带、胎盘是必须在分娩或剖腹产后2小时之内。然后由专业人员用含有青链霉素和咪康唑的生理盐水清洗血污，放入无菌包装袋内。

无菌包装袋放入冷链运输箱中保持2-8℃，72小时之内运到实验室分离。

再次用含有青/链霉素（100u/ml/100μg/ml）和酮康唑（0.1mg/l）的生理盐水冲洗，选取活性好的部位，剥离组织块，并用无菌剪刀剪成1-3mm³的小块，每个50ml离心管内加入10ml小组织块和20ml消化液。先置于37℃恒温摇床中按照60-240rpm，摇动15-50分钟。

消化结束后，经100-200目筛网过滤，细胞滤液收集到新的50ml离心管，离心1200-1600转/分，离心10分钟，弃上清，pbs重悬，离心1200-1600转/分，离心10分钟弃上清，加10mlpbs重悬。进一步提纯采用羟乙基淀粉离心法，6%的羟乙基淀粉溶液与重悬细胞按1:5混合，2000rpm，10℃，20min离心，离心完毕后吸取上层到新的离心管中。按1：3比例加入pbs,1200rpm5min，离心清洗两次，弃上清，用含有胎盘组织液的msc培养基重悬，接种于t75细胞培养瓶内。过滤时剩余的组织块也接种到t75细胞培养瓶中。培养瓶放置在5%co2，37℃的培养箱内进行培养。

待细胞形成克隆后，胰酶消化，稀释后重新接种，组织块在消化后也重新接种到瓶中。

冻存：细胞冻存1×106/支，每支1ml，冻存液采用10%dmso、10%人血清白蛋白、30%羟乙基淀粉、50%msc培养基，程序降温，最后液氮保存，严格记录，随用随取。

三、鉴定

1.细胞污染源检测在分离操作过程中留取样品，进行常见细菌，厌氧菌，支原体检测内毒素检测。

a．吸取1ml样品加入2×yt固体培养基，分别设阳性，阴性对照，放37℃培养箱培养。一周后长出克隆判定为阳性，未长出克隆判定为阴性。

b．吸取1ml样品加入硫乙醇酸盐液体培养基，分别设阳性，阴性对照，放37℃培养箱培养。一周后培养基浑浊判定为阳性

2.流式细胞仪检测脐带、胎盘间充质干细胞的表面标记物。细胞用异硫氰酸荧光素(fitc)或藻红蛋白(pe)标记的小鼠抗人cd44、cd90、cd34、cd73和hla-dr抗体（上述抗体均购自bd公司）标记后进行流式检测，流式细胞仪为bdfacscan(bectondickinson)。

表型结果显示，来源于脐带、羊膜、底蜕膜的梭形细胞的cd44、cd73和cd90均为阳性，cd34、cd45和hla-dr类分子均为阴性。