本发明涉及微生物医药技术领域，具体的说是一种从绿木霉(trichodermavirens)的发酵产物中得到杜松烷型倍半萜类化合物及其分离纯化方法与应用。
背景技术：
微生物次级代谢产物具有丰富的结构多样性和显著的生物活性，是药物先导化合物的重要来源。杜松烷型倍半萜类化合物是一类主要由真菌产生的具有生物活性的化合物，是含有双环结构的倍半萜，具有显著的抗菌活性。
根据文献调研，本发明涉及的两个倍半萜化合物是新化合物，之前没有文献报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从真菌绿木霉(trichodermavirens)的发酵产物中得到杜松烷型倍半萜类化合物及其分离纯化方法与应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种杜松烷型倍半萜化合物，如式i所示，分子式分别为c15h16o3(化合物1)和c15h22o2(化合物2)；
一种杜松烷型倍半萜化合物的制备方法：
1)取生长于pda平板培养基中的绿木霉trichodermavirens(大小2.0厘米×2.0厘米)接种于已灭过菌的固体培养基中，室温下静置培养30天，发酵产物使用乙酸乙酯浸泡萃取3次，合并萃取液进行浓缩，获得发酵粗提物；
2)粗提物进行减压硅胶柱层析，并用梯度为20:1至1:1(v/v，下同)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至1:1二氯甲烷-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯10:1洗脱得到的组分，进行rp-18反相硅胶柱层析，以10:90至100:0的甲醇-水洗脱；
3)收集上述步骤2)甲醇-水50:50的组分，进行正相硅胶柱层析，以50:1至10:1的石油醚-丙酮洗脱，收集石油醚-丙酮20:1的组分，再用lh-20甲醇凝胶纯化，得到目标化合物1；收集上述步骤2)甲醇-水70:30的组分，进行正相硅胶柱层析，以20:1的石油醚-丙酮洗脱，再用lh-20甲醇凝胶纯化，得到目标化合物2；
按权利要求2所述的杜松烷型倍半萜化合物的制备方法，其特征在于：所述固体培养基配方为：每100毫升蒸馏水中含大米70克，玉米浆0.2克，蛋白胨0.3克。
一种杜松烷型倍半萜化合物的应用，所述式i中所示倍半萜化合物在抑制水产病害细菌和农业病害真菌中的应用。
所述式i中所示杜松烷型倍半萜化合物在制备由细菌或真菌引起感染的抑制药物中的应用。
本发明所具有的优点：
本发明将木霉属真菌绿木霉(trichodermavirens)进行发酵培养，由发酵产物中发现两个新的具有显著抗菌活性的杜松烷型倍半萜化合物，目前尚未见对该化合物的化学结构及水产病害菌抑制活性的报道，市场上也尚未见有与此相关的药物。
经抑菌活性试验，化合物1和2有较好且广谱的抗菌活性，在抗细菌活性实验中化合物1和2对大肠杆菌(escherichiacoli)，嗜水气单胞菌(aeromonashydrophilia)，藤黄微球菌(micrococcusluteus)，铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，哈氏弧菌(vibrioharveyi)，副溶血性弧菌(v.parahemolyticus)，创伤弧菌(v.vulnificus)具有较强的抑制活性，mic值为2–64μg/ml；在抗真菌活性实验中，化合物1对13株真菌均有一定的抑制活性，其中对番茄早疫病菌(alternariasolani)，小麦根腐病菌(bipolarissorokiniana)，苹果炭疽病菌(colletottichumgloeosporioides)，辣椒根腐病菌(fusariumsolani)，黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporum.sp.cucumebriumowen)，苦瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.momordicaenov.f.)，苹果轮纹病菌(physalosporapiricolanose)的mic值为1–4μg/ml，而化合物2则对苹果炭疽病菌(colletottichumgloeosporioides)，番茄枯萎病菌(fusariumoxysporum)，黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporum.sp.cucumebriumowen)，苹果轮纹病菌(physalosporapiricolanose)和苹果腐烂病菌(valsamali)有抑制活性，其中对苹果炭疽病菌(colletottichumgloeosporioides)的mic值为1μg/ml。可用于制备治疗多种细菌和真菌感染的药物。
具体实施方式
以下具体实施例用来进一步说明本发明，但本发明绝非限于这些例子。
本发明通过木霉属真菌绿木霉(trichodermavirens)中分离获得如下的实施例中所指的化合物，化合物化学结构如下(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中的碳原子的标位)：
木霉属真菌绿木霉(trichodermavirens)的生长特征是，在马铃薯蔗糖琼脂(pda)培养基上长有深绿色孢子。绿木霉已有文献记载，同时可由公众流通渠道获得，如文献：elianegaro等：trichodermamidesaandb,cytotoxicmodifieddipeptidesfromthemarine-derivedfungustrichodermavirens,journalofnaturalproducts,2003,vol.66,423-426)和wei-huajiao等：trichodermidesa-e:newpeptaibolsisolatedfromtheaustraliantermitenest-derivedfungustrichodermavirenscmb-tn16,journalofnaturalproducts,2018,vol.81,976-984)等。
绿木霉在室温，自然光照，富营养条件下，菌落生长迅速，呈不定型棉絮状或致密丛束状，其表面的颜色呈绿色。
实施例1.式i所示化合物1和2的制备方法
将按照上述文献或公众流通渠道所得绿木霉trichodermavirens，取生长于pda平板培养基中的绿木霉trichodermavirens(大小2.0厘米×2.0厘米)接种于已灭过菌的大米固体培养基中，室温下静置培养30天，发酵产物使用乙酸乙酯浸泡萃取3次，合并萃取液进行浓缩，获得发酵粗提物；
所述大米固体培养基配方为：每100毫升蒸馏水中含大米70克，玉米浆0.2克，蛋白胨0.3克；
粗提物进行减压硅胶柱层析，并用梯度为20:1至1:1(v/v，下同)的石油醚-乙酸乙酯和梯度为20:1至1:1二氯甲烷-甲醇作为溶剂依次进行梯度洗脱；
收集石油醚-乙酸乙酯10:1洗脱得到的组分，进行rp-18反相硅胶柱层析，以10:90至100:0的甲醇-水洗脱；收集上述步骤甲醇-水50:50的组分，进行正相硅胶柱层析，以50:1至10:1的石油醚-丙酮洗脱，收集石油醚-丙酮20:1的组分，再用lh-20甲醇凝胶纯化，得到纯化目标化合物1；
收集上述步骤甲醇-水70:30的组分，进行正相硅胶柱层析，以20:1的石油醚-丙酮洗脱，再用lh-20甲醇凝胶纯化，得到纯化目标化合物2。其结构鉴定为如式i所示，
两个化合物具有以下理化和波谱特性：
化合物1：无色晶体，
化合物2：无色晶体，
233.1547[m–h]–，c15h21o2计算值为233.1547。
表i化合物1、化合物2的核磁共振氢谱(500mhz，dmso-d6)和碳谱(125mhz，dmso-d6)数据
a)本表信号归属基于dept、1h-1hcosy、hsqc及hmbc图谱解析结果，碳信号的多重度利用dept方法确定
实施例2.抑菌活性
用最小抑菌浓度法检测式i所示化合物1和2的抗菌活性。选择以下菌株进行抗菌活性测试：人类致病菌(1株)：大肠杆菌(escherichiacoli)；水产病原细菌(10株)：嗜水气单胞菌(aeromonashydrophilia)，鲇鱼爱德华氏菌(edwardmegi)，迟缓爱德华氏菌(edwardsiellatarda)，藤黄微球菌(micrococcusluteus)，铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)，鳗弧菌(v.anguillarum)，哈氏弧菌(vibrioharveyi)，副溶血性弧菌(v.parahemolyticus)，创伤弧菌(v.vulnificus)；农业病害真菌(15株)：番茄早疫病菌(alternariasolani)，小麦根腐病菌(bipolarissorokiniana)，小麦纹枯病菌(ceratobasidiumcornigerum)，葡萄白腐病菌(coniothyriumdiplodiella)，苹果炭疽病菌(colletottichumgloeosporioides)，柑橘炭疽病菌(colletottichumgloeosporioidespenz)，小麦赤霉病菌(fusariumgraminearum)，辣椒根腐病菌(fusariumsolani)，番茄枯萎病菌(fusariumoxysporum)，黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporum.sp.cucumebriumowen)，苦瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.momordicaenov.f.)，玉米小斑病菌(helminthosporiummaydis)，柑橘绿霉病菌(penicilliumdigitatum)，苹果轮纹病菌(physalosporapiricolanose)，苹果腐烂病菌(valsamali)。
1)抗菌活性测试(mic法)：
最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration，mic)，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。在96微孔板中，通过将不同浓度的药物加入到待测菌的菌悬液中，培养后观察，如果指示菌在某孔内生长，表示该孔的药物浓度不能抑制该菌的生长，该孔内液体浑浊，透光度明显下降。反之，该孔内液体澄清，透光度下降不显著。小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的mic。
2)菌悬液的制备
细菌：上述供试细菌分别接种于培养基(铜绿假单胞菌，溶藻弧菌，创伤弧菌，鳗弧菌，迟缓爱德华氏菌用tsb培养基，大肠杆菌，藤黄微球菌，嗜水气单胞菌，哈氏弧菌，副溶血性弧菌，鲇鱼爱德华氏菌分别用lb培养基)上于28℃或37℃培养24小时后，吸取4ml无菌的0.85％nacl溶液(8.5g氯化钠定容到1000ml水中)洗涤培养物，并用玻璃刮刀将菌轻轻刮下。用移液枪吸取适量菌悬液于无菌试管中，然后用0.85％nacl溶液将菌悬液调至0.5麦氏浊度(相当于1.5×108cfu/ml)，并进一步用0.85％nacl溶液稀释至5×105cfu/ml；
真菌：供试真菌接种于pda培养基上于28℃培养72h后，吸取4ml无菌0.85％nacl溶液(含0.25％tween20)洗涤培养物，采用与细菌同样的方法，将菌悬液稀释至5×105cfu/ml。
0.5麦氏浊度标准：
将0.5ml0.048mol/l的bacl2(1.175％w/vbacl2·2h2o)加到99.5ml0.18mol/l(0.36n)的h2so4(1％v/v)中并不断搅动以维持混悬状态。
配制好的菌悬液于4℃冰箱中保存备用，最长可保存15天。
3)样品的配制
分别取2mg左右待测样品(上述所得化合物1或化合物2)和和阳性对照(细菌用氯霉素，真菌用两性霉素b)，溶解于200μl左右dmso中，充分混匀后，使其最终浓度为1280μg/ml，吸取100μl样品溶液到另一只离心管中，接着加入100μldmso，得到浓度减半的样品溶液。按照此方法，总共得到11组浓度依次减半的样品溶液(1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/ml)。
4)空白对照：选择溶解待测样品的纯溶剂(dmso)作为空白对照。
5)mic测定流程
5.1)采用无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔板中，第1至第10孔加样品溶液，每孔5μl，第11孔加5μldmso作为空白对照，第12孔不加样品作为生长对照。
5.2)将相当于0.5麦氏比浊度的指示菌悬液，经液体培养基(铜绿假单胞菌，溶藻弧菌，创伤弧菌，鳗弧菌，迟缓爱德华氏菌用tsb培养基，大肠杆菌，藤黄微球菌，嗜水气单胞菌，哈氏弧菌，副溶血性弧菌，鲇鱼爱德华氏菌用lb培养基，真菌用沙氏培养基)稀释1000倍后，取95μl依次加入到96孔板中，使得第1至第11孔的样品终浓度依次为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。轻轻震荡混匀后，将96孔板密封置于37℃(细菌)和28℃(真菌)培养箱中，细菌培养24h，真菌培养72h。
5.3)在600nm波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值，以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的mic。
表ii化合物1和化合物2的抗菌活性数据(mic,μg/ml)a
实验结果表明化合物1和2有较好且广谱的抗菌活性，如表ii所示，在抗细菌活性实验中化合物1和2对大肠杆菌(escherichiacoli)，嗜水气单胞菌(aeromonashydrophilia)，藤黄微球菌(micrococcusluteus)，铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，哈氏弧菌(vibrioharveyi)，副溶血性弧菌(v.parahemolyticus)，创伤弧菌(v.vulnificus)具有较强的抑制活性，mic值为2–64μg/ml；在抗真菌活性实验中，化合物1对13株真菌均有一定的抑制活性，其中对番茄早疫病菌(alternariasolani)，小麦根腐病菌(bipolarissorokiniana)，苹果炭疽病菌(colletottichumgloeosporioides)，辣椒根腐病菌(fusariumsolani)，黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporum.sp.cucumebriumowen)，苦瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.momordicaenov.f.)，苹果轮纹病菌(physalosporapiricolanose)的mic值为1–4μg/ml，而化合物2则对苹果炭疽病菌(colletottichumgloeosporioides)，番茄枯萎病菌(fusariumoxysporum)，黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporum.sp.cucumebriumowen)，苹果轮纹病菌(physalosporapiricolanose)和苹果腐烂病菌(valsamali)有抑制活性，其中对苹果炭疽病菌(colletottichumgloeosporioides)的mic值为1μg/ml。
上述实验结果证明本发明所涉及的化合物对所试菌株具有较强抑制作用，它们可用于制备新型的由多种细菌或真菌引起感染的抑制药物。