本发明涉及微生物菌种保藏领域，具体涉及一种乳酸菌菌种长期保藏方法。
背景技术：
：微生物菌种的保藏是从事微生物研究工作遇到的一个重要问题，现有的一些菌种保藏方法，在菌种保藏过程中往往需要经常地活化传代，菌种保藏工作复杂而繁琐，且常常因保藏不当造成菌种丢失，给工作带来极大的不便。保藏菌种的原理主要是依据微生物的生理代谢特点，创造一种外部条件，使微生物细胞代谢处于停滞、不活跃、生长繁殖受抑制的休眠状态，但细胞并不死亡，遇到适宜的条件又可马上复活。通常采用低温冷冻、干燥缺氧、营养缺乏等方法，或几种方法并行使用，使菌种暂时处于休眠状态。理想的保藏方法除了长期保持菌种原有的优良性状不变外，保藏方法本身的简便易操作也非常重要，同时还要考虑保藏成本的经济性，以便能使保藏方法被广泛使用。菌种是从事微生物学研究及发酵工业生产的基本材料，也是国家的重要资源。菌种保藏就是采用最合适的保存方法，使菌种的变异和死亡减少到最低限度的一项经常性工作。目前，微生物菌种的保藏方法主要有以下几种：①定期移植法：就是将菌种接种于适宜的培养基中，在最适条件下培养，待生长到一定阶段后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养。此法操作简单，但保存时间短，需要经常移种，易于变异，只能作为菌种的短期保藏。②液体石蜡保藏法：该方法是首先将优质化学纯液体石蜡进行灭菌，然后把灭菌后的液体石蜡注入已长好菌的斜面上，使菌种与空气隔绝。试管直立置于冰箱(4～6℃)低温保存。保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。此方法主要用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏，保藏期1-2年。缺点是必须直立存放，占空间大，不便携带，并且某些以石蜡为碳源，或对液体石蜡保藏敏感的菌株都不能用此法保藏。③沙土管保藏法：该方法为取60～80目河沙和非耕作层贫瘠且粘性较小的土，用吸铁石吸去铁质，用10％盐酸浸泡24h后弃盐酸，分别用水洗至中性，将沙土烘干备用。将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，塞好棉塞，灭菌备用。把制备好的菌悬液分装每支沙土管0.5ml，放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。塞好棉塞放入盛有干燥剂的容器中，用真空泵抽去水分。存放于低温(4～6℃)干燥处保藏，每隔半年验证1次。本法方法简便，设备简单，适用于产孢子和有芽孢的菌种保藏，可保存2年,但对营养细胞不适用。④真空冷冻干燥保藏法：该方法分为好氧菌冷冻干燥保藏和厌氧菌冷冻干燥保藏。此方法是国际菌种保藏机构通常采用的方法之一，应用最为广泛，几乎所有的微生物均可采用此法保藏。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。方便之处在于因冷冻干燥管无需低温保藏，所以运输方便，但此法所需设备要求高，操作复杂，费用昂贵，且恢复应用时不方便。⑤冷冻保藏法：此法存活率高，稳定性强，保藏时间长，是长期保藏菌种的较好方法。适用于各种菌种的保藏，特别适用于难以用真空干燥保藏等方法保藏的菌种。但此法需定期向液氮罐中补充液氮，以保证液氮罐中的温度，要求条件高，操作复杂，保藏成本较高，且恢复应用时不方便。中国专利申请2005100903112公开了一种食用菌液体菌种的保存方法，该发明所提供的食用菌液体菌种的保存方法，是将食用菌液体菌种先经过快速冷冻降温到-40℃～-20℃后，再在-40℃～-20℃温度下进行保藏，其温度下降速率为1-6℃/min。本发明利用-40℃～-20℃的低温保存菌种，经冷冻保存的液体菌种经解冻活化，接种固体培养基后能正常萌发，可用于生产食用菌。本发明的食用菌液体菌种的低温保存方法简便易行，采用冷藏冰柜即可满足要求，成本低、效益高，对菌种的前期培养条件没有附加要求，凡是以液体培养方式得到的食用菌菌种均可以用本发明的方法保存，在实际生产中容易推广使用，但还是该保存方法只适用于食用菌液体菌种，应用范围具有局限性。针对现有技术中的缺陷与不足，开发一种操作简便，成本低廉，保藏期长的菌种保藏方法尤为重要。技术实现要素：基于上述现有技术中存在的问题，本发明旨在提供一种操作简便，成本低廉，保藏期长可达10-15年的菌种保存方法。本发明公开的保存方法不仅适用于乳酸菌，还适宜于厌氧细菌、好氧细菌、霉菌、酵母和放线菌等各类微生物的保藏，应用范围非常广泛，本发明公开的保存方法的另一突出的特点是菌种可以快速恢复应用。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种乳酸菌菌种简便长期保藏方法，包括以下步骤：(1)首先配制γ-聚谷氨酸甘油混合溶液，灭菌后备用；(2)制作棉球，并将其置于玻璃培养皿中，并在玻璃培养皿外包裹铝箔纸或牛皮纸，灭菌后备用；(3)培养待保藏的乳酸菌菌种，得到乳酸菌菌种液；(4)用无菌镊子夹取步骤(2)中制备的无菌棉球浸入步骤(3)培养好的乳酸菌菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于离心管中，用无菌注射器注入步骤(1)中配制的γ-聚谷氨酸甘油混合液，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品低温保藏。具体的，上述保藏方法包括以下步骤：(1)首先配制γ-聚谷氨酸溶液，然后取γ-聚谷氨酸溶液加入到甘油中，混合均匀制成γ-聚谷氨酸-甘油混合溶液，灭菌备用；(2)将脱脂棉揉搓制作棉球，并将其置于玻璃培养皿中，玻璃培养皿外用铝箔纸或牛皮纸包裹，灭菌备用；(3)培养待保藏的乳酸菌菌种，得到乳酸菌菌种液；(4)用无菌镊子夹取步骤(2)中制备的无菌棉球浸入步骤(3)培养好的乳酸菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于pet离心管中，再用无菌注射器注入步骤(1)中配制的γ-聚谷氨酸-甘油混合液至装满离心管，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品低温保藏。上述步骤(1)中所述的γ-聚谷氨酸溶液中γ-聚谷氨酸的重量百分比为3-5％；优选为3％、4％或5％。上述步骤(1)中制备的γ-聚谷氨酸甘油混合溶液中γ-聚谷氨酸溶液与甘油的体积比为5-25：95-75(ml)；优选为5:95、6:94、7:93、8:92、9:91、10:90、11:89、12:88、13:87、14:86、15:85、16:84、17:83、18:82、19:81、20:80、21:79、22:78、23:77、24:76或25:75。上述步骤(1)配置的γ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中还加入稳定剂，所述的稳定剂为质量比为2-5:1的十二烷基苯磺酸钠和蛋黄卵磷脂，所述的稳定剂的加入量为每100mlγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入2-10g；优选地，所述的稳定剂为质量比为2.5-4.5:1的十二烷基苯磺酸钠和蛋黄卵磷脂，所述的稳定剂的加入量为每100mlγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入3-9g；再优选地，所述的稳定剂为质量比为3-4:1的十二烷基苯磺酸钠和蛋黄卵磷脂，所述的稳定剂的加入量为每100mlγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入4-6g；为了进一步提高本发明公开保藏方法的保藏时限，本发明还在γ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入了质量比为3:1的精氨酸和苯丙氨酸，所述的精氨酸和苯丙氨酸的加入总量为每100mlγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入5-20g；优选地，所述的精氨酸和苯丙氨酸的加入总量为每100mlγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入8-16g；再优选地，所述的精氨酸和苯丙氨酸的加入总量为每100mlγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入10-14g；进一步优选地，所述的精氨酸和苯丙氨酸的加入总量为每100mlγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入12-13g；上述步骤(2)中所述的棉球的直径为2-5mm。上述步骤(1)和步骤(2)中所述的灭菌温度为120-125℃，优选为121℃；灭菌时间为20-25min，优选为20min。上述步骤(3)中所述的乳酸菌菌种选自但不局限于干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌或嗜热链球菌中的任意一种。上述步骤(3)中所述的培养时间为5-7小时，对数生长期。在一些具体实施方案中，上述保藏方法包括以下步骤：(1)首先配制3.0-5.0％γ-聚谷氨酸(γ-pga)溶液，然后取5.0-25.0ml此溶液加入到95.0-75.0ml甘油中，混合均匀制成γ-pga甘油混合溶液；120-125℃灭菌20-25min，备用；(2)将脱脂棉揉搓制作直径为2-5mm的棉球，并将其置于玻璃培养皿中，玻璃培养皿外用铝箔纸或牛皮纸包裹；120-125℃灭菌20-25min，备用；(3)需保藏的乳酸菌菌种在适宜的条件下进行单独培养5-7小时，得到乳酸菌菌种液；(4)用无菌镊子夹取步骤(2)中制备的无菌棉球浸入步骤(3)培养好的乳酸菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于5.0-10.0mlpet离心管中，再用无菌注射器注入5.0-10.0ml步骤(1)中配制的γ-pga甘油混合液至装满离心管，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品置于-18℃—-80℃冰箱中保藏即可。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)本发明提供的乳酸菌菌种保藏方法，操作简单，成本低廉，保藏期可达10-15年，菌种存活率高可达90以上；(2)本发明通过控制γ-聚谷氨酸与甘油的体积比，使制备的保护液更适于乳酸菌菌种的生存，从而可以更好的保证乳酸菌菌种的存活率，使乳酸菌菌种保存15年，存活率依然在90％以上，并且保藏后的菌种稳定性好，活性高；(3)本发明通过严格控制菌液吸附棉球的直径，从而控制乳酸菌菌种的数目，从而保证保藏过程中菌种的存活率；(5)本发明为了提高保藏时限和菌种存活率在保藏液中加入了一定含量和质量比的十二烷基苯磺酸钠和蛋黄卵磷脂及精氨酸和苯丙氨酸，意外的发现其加入可以明显提高菌种保藏的存活率可高达96％，并且明显延长菌种保藏的时限至15年；(4)本发明公开的保藏方法稳定性强，保藏的菌种恢复应用方便，恢复后菌种活性高。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1一种乳酸菌菌种简便长期保藏方法包括以下步骤：(1)首先配制3.0％γ-聚谷氨酸(γ-pga)溶液，然后取5.0ml此溶液加入到95.0ml甘油中，混合均匀制成γ-pga甘油混合溶液；121℃灭菌20min，备用；(2)将脱脂棉揉搓制作直径为2mm的棉球，并将其置于玻璃培养皿中，玻璃培养皿外用铝箔纸或牛皮纸包裹；120℃灭菌20min，备用；(3)需保藏的乳酸菌菌种在适宜的条件下进行单独培养5小时，得到乳酸菌菌种液；(4)用无菌镊子夹取步骤(2)中制备的无菌棉球浸入步骤(3)培养好的乳酸菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于5.0mlpet离心管中，再用无菌注射器注入5.0步骤(1)中配制的γ-pga甘油混合液，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品置于-18℃冰箱中保藏即可。该实施例的保藏期限为15年，菌种存活率为90％左右，恢复后菌种活性与原始菌种几乎没有改变，活性可达93％以上，培养5小时即可进入对数生长期。实施例2一种乳酸菌菌种简便长期保藏方法包括以下步骤：(1)首先配制4.0％γ-聚谷氨酸(γ-pga)溶液，然后取25.0ml此溶液加入到75.0ml甘油中，然后加入质量比为2:1的十二烷基苯磺酸钠和蛋黄卵磷脂3g，混合均匀制成γ-pga甘油混合溶液；125℃灭菌25min，备用；(2)将脱脂棉揉搓制作直径为4mm的棉球，并将其置于玻璃培养皿中，玻璃培养皿外用铝箔纸或牛皮纸包裹；125℃灭菌25min，备用；(3)需保藏的乳酸菌菌种在适宜的条件下进行单独培养6个小时，得到乳酸菌菌种液；(4)用无菌镊子夹取步骤(2)中制备的无菌棉球浸入步骤(3)培养好的乳酸菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于10.0mlpet离心管中，再用无菌注射器注入10.0ml步骤(1)中配制的γ-pga甘油混合液，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品置于-40℃冰箱中保藏即可。该实施例的保藏期限为15年，菌种存活率为93％左右，恢复后菌种活性与原始菌种几乎没有改变，活性恢复可达90％以上，培养5个小时即可进入对数生长期。实施例3一种乳酸菌菌种简便长期保藏方法包括以下步骤：(1)首先配制5.0％γ-聚谷氨酸(γ-pga)溶液，然后取15ml此溶液加入到85ml甘油中，然后加入质量比为3:1的精氨酸和苯丙氨酸6g，混合均匀制成γ-pga甘油混合溶液；122℃灭菌22min，备用；(2)将脱脂棉揉搓制作直径为5mm的棉球，并将其置于玻璃培养皿中，玻璃培养皿外用铝箔纸或牛皮纸包裹；122℃灭菌22min，备用；(3)需保藏的乳酸菌菌种在适宜的条件下进行单独培养6个小时，得到乳酸菌菌种液；(4)用无菌镊子夹取步骤(2)中制备的无菌棉球浸入步骤(3)培养好的乳酸菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于6mlpet离心管中，再用无菌注射器注入6ml步骤(1)中配制的γ-pga甘油混合液，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品置于-80℃冰箱中保藏即可。该实施例的保藏期限为15年，菌种存活率为92％左右，恢复后菌种活性与原始菌种几乎没有区别，活性恢复可达95％，培养6个小时即可进入对数生长期。实施例4一种乳酸菌菌种简便长期保藏方法包括以下步骤：(1)首先配制3.5％γ-聚谷氨酸(γ-pga)溶液，然后取20ml此溶液加入到80ml甘油中，质量比为3:1的十二烷基苯磺酸钠和蛋黄卵磷脂4g和质量比为3:1的精氨酸和苯丙氨酸4g，混合均匀制成γ-pga甘油混合溶液；120℃灭菌24min，备用；(2)将脱脂棉揉搓制作直径为5mm的棉球，并将其置于玻璃培养皿中，玻璃培养皿外用铝箔纸或牛皮纸包裹；120℃灭菌24min，备用；(3)需保藏的乳酸菌菌种在适宜的条件下进行单独培养5个小时，得到乳酸菌菌种液；(4)用无菌镊子夹取步骤(2)中制备的无菌棉球浸入步骤(3)培养好的乳酸菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于8mlpet离心管中，再用无菌注射器注入8ml步骤(1)中配制的γ-pga甘油混合液，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品置于-60℃冰箱中保藏即可。该实施例的保藏期限为15年，菌种存活率为96％左右，恢复后菌种活性与原始菌种几乎没有改变，活性恢复可达97％以上，培养4小时即可进入对数生长期。对比例1与实施例1的区别在于：步骤(1)中取2ml的γ-聚谷氨酸溶液加入到98ml的甘油中，其他操作与步骤与实施例1相同。该实施例的保藏期限为15年，菌种存活率为86％左右，恢复后菌种活性85％。对比例2与实施例1的区别在于：步骤(1)中取35ml的γ-聚谷氨酸溶液加入到65ml的甘油中，其他操作与步骤与实施例1相同。该实施例的保藏期限为15年，菌种存活率为88％左右，恢复后菌种活性82％。对比例3与实施例2的区别在于：步骤(2)中制成的棉球的直径为1mm，其他操作与步骤与实施例2相同。该实施例的保藏期限为15年，菌种存活率为84％左右，恢复后菌种活性86％。对比例4与实施例2的区别在于：步骤(2)中制成的棉球的直径为8mm，其他操作与步骤与实施例2相同。该实施例的保藏期限为15年，菌种存活率为85％左右，恢复后菌种活性82％。保藏菌种快速恢复的实施例菌种恢复方法：将低温保藏15年的菌种取出一管，30℃温度下放置30分钟，然后取1ml接入灭菌的mrs液体培养基中，置于37℃培养箱，培养5-7小时。以此培养液为菌种，再在mrs固体平板培养基上进行划线法分离，37℃培养箱中培养72小时。待长出菌落后，再接入mrs试管斜面培养基中，37℃培养72小时。4℃冰箱保藏备用。存活率检测：将低温保藏15年的菌种取出一管，30℃温度下放置30分钟，然后将整管菌液全部倒入100ml无菌水中，再进行系列稀释。然后，再按微生物计数法，在mrs固体平板培养基上37℃培养72小时，进行微生物计数。菌种活性恢复检测：将低温保藏15年的菌种取出一管，30℃温度下放置30分钟，然后取1ml接入灭菌的mrs液体培养基中，置于37℃培养箱，培养6小时。然后，再按微生物计数法，在mrs固体平板培养基上37℃培养72小时，进行微生物计数。检测培养6小时后培养液中活菌的数量。此活菌数与未经长期保藏的菌种活菌数之比，即为菌种恢复活性。结果测试实例保藏时间/年存活率/％恢复后菌种的活性/％实施例1159092实施例2159390实施例3159295实施例4159698对比例1158685对比例2158882对比例3158486对比例4158582根据上表数据可以看出使用本发明公开的技术方案进行乳酸菌的培养可以将保藏时间延长至15年，乳酸菌的存活率可高达90％以上，恢复后菌种的活性可高达93％以上，与原始菌种的活性几乎没有改变，实施例1的保藏液中没有加入稳定剂及精氨酸和苯丙氨酸的混合溶液，其保藏15年后乳酸菌的存活率为90％，恢复后活性为93％；实施例2的保藏液中加入了稳定剂，保藏15年后乳酸菌的存活率为93％，恢复后活性为95％，相对于实施例1出现了一定程度的提高；实施例3的保藏液中加入了精氨酸和苯丙氨酸的混合溶液，保藏15年后乳酸菌的存活率为92％，恢复后活性为94％，相对于实施例1出现了一定程度的提高；实施例4的保藏液中加入了稳定剂以及精氨酸和苯丙氨酸的混合溶液，保藏15年后乳酸菌的存活率为96％，恢复后活性为97％，相对于实施例1出现了明显的提高。而对比例1和对比例2对保藏液中γ-聚谷氨酸溶液和甘油体积进行了调整，不在本发明限定范围内，其保藏15年后乳酸菌的存活率以及活性出现了明显降低，对比例3和对比例4对棉球的大小进行了调整，不在本发明限定范围内，其保藏15年后乳酸菌的存活率以及活性也出现了明显降低，综上可知，只有使用本发明公开的保藏液进行保藏得到的乳酸菌的存活率以及活性才会明显提高。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但是本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12