本发明涉及植物有效成份提取纯化领域，特别是提供一种从罗汉果中分离罗汉果甜苷v的方法。
背景技术：
罗汉果，被人们誉为“神仙果”，是我国特有的珍贵葫芦科植物，素有良药佳果之称。具有清热润肺、止咳、利咽等症。罗汉果提取物的主要成分为罗汉果甜苷。罗汉果甜苷中的有效成分主要是萜类化合物，包括苷ⅲ、苷ⅳ、苷ⅴ等，其中罗汉果甜苷ⅴ是其甜味的主要成分，甜度是蔗糖的256～344倍，由于其结合有糖基而易溶于水、乙醇等极性溶剂，难溶于丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，为白色无定型粉末。可广泛应用于营养保健品、食品、药品等行业中。
目前，关于罗汉果提取物的提取方法主要有水提、醇提法，后续采用大孔吸附树脂及离子交换树脂进行纯化，但是提取过程中温度过高会增加浸出的杂质，提取液的颜色加深，而不利于后续的脱色提纯处理，并且所得到的提取物色泽深并具有浓烈的中药味和强烈的后苦味、有效成分含量低、能源消耗大、生产成本高的缺点。
技术实现要素：
为了解决上述现有技术的不足之处，提供了一种从罗汉果中分离罗汉果甜苷v的方法，该方法操作简便、工艺经济环保、适合推广，所得罗汉果甜苷v纯度高、外观品相良好、味道纯正无苦味。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种分离罗汉果甜苷v的方法，所述方法是将罗汉果加水打浆之后依次进行植物酶酶解、生物酶酶解，收集酶解液，灭酶之后进行酵母发酵，复合阴阳离子交换树脂纯化、浓缩干燥制得罗汉果甜苷v；
所述的植物酶为纤维素酶、半纤维素酶、β-葡聚糖酶、果胶酶或纤维素水解酶中至少一种；
所述的生物酶为果胶裂解酶、木瓜酶、酸性蛋白酶、淀粉酶或β-半乳聚糖酶中的至少一种。
优选的是，以kg/ml计，所述罗汉果与植物酶质量体积比为1∶0.5～3。
优选的是，所述植物酶酶解是在ph为4.0～4.8、温度为40～45℃条件下酶解1～5小时。
优选的是，以kg/ml计，所述罗汉果与生物酶质量体积比为1∶0.5～15。
优选的是，所述生物酶酶解温度为45～50℃，酶解时间为1～3小时。
优选的是，所述灭酶温度为80～85℃，灭酶时间为5～10分钟。
优选的是，以kg/g计，所述罗汉果与酵母质量比为1∶0.5～5；所述酵母发酵温度为25～30℃，发酵时间为3～5小时。
优选的是，所述复合阴阳离子交换树脂纯化步骤之前还包括有机膜过滤步骤，所述有机膜过滤步骤包括第一次过滤和第二次过滤，所述第一次过滤使用截留5000分子量的有机膜，过滤压力为0.45～0.5mpa；所述第二次过滤使用截留400分子量的有机膜，过滤压力为1.8～2.0mpa。
优选的是，所述复合阴阳离子交换树脂中阴离子树脂和阳离子树脂质量比为1～3:1～1.5；所述复合阴阳离子交换树脂纯化所用的洗脱液为水。
优选的是，所述浓缩步骤中浓缩液浓度为15～18波美度。
本发明有益效果如下：
1、本发明利用采用酶解法提取替代传统的热水提取，通过破坏罗汉果细胞壁的结构，使罗汉果甜苷v能从罗汉果中充分的游离出来，提取出来的提取液杂质少。
2、本发明发酵之前利用活性酶将罗汉果的中多糖、蛋白等物质分解为小分子单糖、氨基酸等有机物，酵母可以直接使用这些小分子物质，使发酵环节所需时间大大缩短。本发明酵母发酵是在有氧条件进行的，酵母有氧发酵的产物是二氧化碳和水，不会引入新的杂质，本发明在酵母发酵之前进行灭酶处理，避免酶的作用使酵母细胞壁受到损害而破裂，进而保证罗汉果甜苷v的提取率及纯度。
3、酶解结合发酵，加上膜脱色替代传统的大孔树脂纯化，并且比其(大孔树脂)纯化的罗汉果甜苷v含量高10％以上。
4、有机膜过滤液经过复合阴阳离子树脂吸附洗脱，流出液清澈干净，无杂色，经过喷雾干燥之后，一次性就可以得到雪白、均匀，口味纯正的产品。
5、本方法全程只用到水溶剂，环保，没有用到有毒有机试剂，操作简单，很适合工业大生产。
6、本制作方法来的产品产品雪白，无苦味，溶剂残留少，无农药残留，产品品质稳定，所得罗汉果甜苷v含量大于60％，总苷(罗汉果中所含苷类成分)含量大于90％。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
取成熟、新鲜的罗汉果1kg，破碎，加3kg纯水用打浆机打浆。用3％柠檬酸调节ph到4.0，先加入纤维素酶0.5ml，在40℃酶解1小时。通过100目滤布再继续加入果胶裂解酶3ml、木瓜酶3ml、酸性蛋白酶3ml、淀粉酶3ml、β-半乳聚糖酶3ml共五种酶，在45℃温度下酶解1小时，得到酶解液，酶解液加热到80℃，保持5分钟进行灭酶，放冷到25℃，加入高活性酵母粉0.5g(购于安琪酵母(崇左)有限公司)，在有氧条件下发酵3小时。将发酵液过有机膜，先过5000分子量的有机膜，进膜压力0.45mpa，再过400分子量的有机膜，进膜压力1.8mpa，得脱色过膜液；过膜液直接进树脂填充量为200g的复合阴阳离子树脂柱，其中型号d301r(弱碱阴离子树脂)和d152(弱酸阳离子树脂)质量比例为1:1(阴、阳离子树脂均购于天津南开树脂厂)，进样完后用800ml纯水溶液洗脱分离，从流出液有罗汉果甜苷v>1％开始收集。收集流出液，减压浓缩到15波美度，喷雾干燥，得到雪白的罗汉果甜苷v。
实施例2
取成熟、新鲜的罗汉果1kg，破碎，加4kg纯水用打浆机打浆。用4％柠檬酸调节ph到4.5，先加入半纤维素酶0.5ml、β-葡聚糖酶0.5ml、果胶酶0.5ml共三种酶，在42℃酶解3小时。通过200目滤布再继续加入果胶裂解酶0.5ml，在48℃温度下酶解2小时，得到酶解液，酶解液加热到83℃，保持8分钟进行灭酶，放冷到27℃，加入高活性酵母粉1g(购于安琪酵母(崇左)有限公司)，在有氧条件下发酵4小时。将发酵液过有机膜，先过5000分子量的有机膜，进膜压力0.48mpa，再过400分子量的有机膜，进膜压力1.9mpa，得脱色过膜液；过膜液直接进树脂填充量为200g的复合阴阳离子树脂柱，其中型号d301r(弱碱阴离子树脂)和d152(弱酸阳离子树脂)质量比例为2:1.2(阴、阳离子树脂均购于天津南开树脂厂)，进样完后用800ml纯水溶液洗脱分离，从流出液有罗汉果甜苷v>1％开始收集。收集流出液，减压浓缩到16波美度，喷雾干燥，得到雪白的罗汉果甜苷v。
实施例3
取成熟、新鲜的罗汉果1kg，破碎，加5kg纯水用打浆机打浆。用5％柠檬酸调节ph到4.8，先加入纤维素酶0.6ml、半纤维素酶0.6ml、β-葡聚糖酶0.6ml、果胶酶0.6ml、纤维素水解酶0.6ml共五种酶，加入总量为3ml，在45℃酶解5小时。通过200目滤布再继续加入木瓜酶1ml、酸性蛋白酶1ml、淀粉酶1ml共三种酶，在50℃温度下酶解3小时，得到酶解液，酶解液加热到85℃，保持10分钟进行灭酶，放冷到30℃，加入高活性酵母粉5g(购于安琪酵母(崇左)有限公司)，在有氧条件下发酵5小时。将发酵液过有机膜，先过5000分子量的有机膜，进膜压力0.5mpa，再过400分子量的有机膜，进膜压力2.0mpa，得脱色过膜液；过膜液直接进树脂填充量为200g的复合阴阳离子树脂柱，其中型号d301r(弱碱阴离子树脂)和d152(弱酸阳离子树脂)质量比例为3:1.5(阴、阳离子树脂均购于天津南开树脂厂)，进样完后用800ml纯水溶液洗脱分离，从流出液有罗汉果甜苷v>1％开始收集。收集流出液，减压浓缩到18波美度，喷雾干燥，得到雪白的罗汉果甜苷v。
对比例1
本案例制备方法是在实施例1制备方法基础上取消酶解液加热到80℃，保持5分钟进行灭酶的步骤，即将收集到酶解液直接进行酵母发酵，其他工艺及参数均保持不变。
对比例2
本案例制备方法是在实施例2制备方法基础上取消酶解液加热到83℃，保持8分钟进行灭酶的步骤，即将收集到酶解液直接进行酵母发酵，其他工艺及参数均保持不变。
对比例3
本案例制备方法是在实施例3制备方法基础上取消酶解液加热到85℃，保持10分钟进行灭酶的步骤，即将收集到酶解液直接进行酵母发酵，其他工艺及参数均保持不变。
对比例4
本案例制备方法是在实施例1制备方法基础上用填充量为200g型号d301r树脂柱(弱碱阴离子树脂)代替复合阴阳离子树脂柱进行层析，其他工艺及参数均保持不变。
对比例5
本案例制备方法是在实施例1制备方法基础上用填充量为200g型号d152(弱酸阳离子树脂)代替复合阴阳离子树脂柱进行层析，其他工艺及参数均保持不变。
实施例1～3所制得的罗汉果甜苷v含量高、外观雪白，味道纯正，无苦味，溶剂残留少，无农药残留，产品品质稳定，对比例1～5将相应的工艺参数改变之后，实施例1～3以及对比例1～5检测方法一样，实施例及对比例所得产品对比情况见表1。
表1产品含量及性状