陆地棉转化事件18C006-10-13及其特异性鉴定方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及陆地棉转化事件18c006-10-13及其特异性鉴定方法。
背景技术：
：转化事件是由外源基因在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。通常，外源基因转化植物可以得到一个转化体群体，这个转化体群体包含大量独立的事件，其中每个事件都是独特的。外源基因在植物中的表达受到外源基因所插入的染色体位置的影响。这可能源自染色质结构或者整合位点附近转录调控元件的影响。相同基因在不同转化事件中的表达水平具有很大的差异，在表达的空间或时间模式上也可能存在差异。而且外源基因的插入也可能会影响内源基因的表达。因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。获得能有效表达外源基因，同时不影响植株本身农艺性状的植物转化事件在培育转基因作物新品种中具有重要的应用价值。我国是世界上最大的棉花生产国和消费国，也是最大的纺织品和服装生产国与出口国。棉花总产量占世界棉花产量的25％左右。棉花生产的兴衰，对我国国民经济的发展，乃至人民生活水平的提高都产生着一定的影响。棉花是受害虫危害最为严重的农作物之一，我国棉花害虫至少有300种。在转基因抗虫棉(即抗棉铃虫)培育之前，以棉蚜、棉铃虫、棉叶螨和棉红铃虫四大害虫危害棉花最为严重，每年因虫害造成的棉花产量损失达15％～20％，每年为防治害虫投入的农药费用每公顷高达1200-1800元。随着bt抗虫棉的广泛种植与田间农药用量的大幅度减少，从根本上有效控制了棉铃虫等鳞翅目害虫，但棉田的生态系统随之发生了一系列变化，在棉铃虫的危害得到了有效的防治的同时，棉蚜、盲蝽象、烟粉虱等非靶标害虫数量大幅增加，逐渐上升为棉田的主要害虫，尤其是盲蝽象，对棉花的生产造成了巨大的损失。2007年，黄大昉将bt菌株f14-1中分离到的cry51aa1蛋白及编码该蛋白的cry51aa1基因序列提交至ncbigenbank，检录号为dq836184，cry51aa1蛋白是一类由苏云金芽孢杆菌产生的伴胞晶体之一，在生物防治领域具有重要的应用前景。本发明的发明人对cry51aa1基因进行了定点突变及体外毒力试验研究，筛选获得了具有较强抗盲蝽象特性的cry51aa1.c006-1基因。技术实现要素：本发明的目的是提供一种具有抗盲蝽象特性的转基因棉花培育方法。本发明首先保护一种转基因棉花的培育方法，为将外源dna片段插入目的棉花基因组第d12号染色体的第63328845-63329028位间，替换掉第d12号染色体的第63328845-63329028位间182bp的碱基序列，得到转基因棉花；所述转基因棉花的盲蝽象抗性和/或株高和/或第一果枝长度和/或果枝数和/或结铃数和/或衣分均高于所述目的棉花；所述转基因棉花的单铃重低于所述目的棉花；所述外源dna片段可为含有cry51aa1.c006-1基因的dna分子。所述cry51aa1.c006-1基因的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第2614-3534位核苷酸所示。上述培育方法中，所述外源dna片段可通过含有外源dna片段的重组载体导入所述目的棉花。所述含有外源dna片段的重组载体可为将表达盒a插入pcambia2301载体的ecori和hindiii酶切位点间，且保持pcambia2301载体的其他序列不变，得到重组载体；表达盒a的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第2186-3822位所示。所述含有外源dna片段的重组载体的核苷酸序列可如序列表中序列4所示。上述培育方法中，所述外源dna片段的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。所述培育方法具体可为将序列表中序列1所示的外源dna分子插入目的棉花基因组第d12号染色体的第63328845-63329028位间(序列表中序列1所示的外源dna分子的5’末端紧邻第d12号染色体的第63329028位，序列表中序列1所示的外源dna分子的3’末端紧邻第d12号染色体的第63328845位)，替换掉第d12号染色体的第63328845-63329028位间182bp的碱基序列，得到转基因棉花。上述任一所述转基因棉花的种子在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctccno:p201822。本发明还保护用于鉴定植物样品是否来源于所述转基因棉花或其后代的方法，包括如下步骤：检测所述待测植物样品的基因组dna中是否含有dna片段a；所述dna片段a由上述任一所述外源dna片段在所述转基因棉花的上游侧翼片段、所述外源dna片段和所述外源dna片段在所述转基因棉花的上游侧翼片段组成；若所述待测植物样品的基因组dna含有所述dna片段a，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；若所述待测植物样品的基因组dna不含有所述dna片段a，则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代。上述任一所述外源dna片段在所述转基因棉花的上游侧翼片段可为所述目的棉花基因组第d12号染色体自第63329028位核苷酸起向其3’方向延伸得到的长度为0-5kb的任意一个dna片段。上述任一所述外源dna片段在所述转基因棉花的下游侧翼片段可为所述目的棉花基因组第d12号染色体自第63328845位核苷酸起向其5’方向延伸得到的长度为0-5kb的任意一个dna片段。上述任一所述上游侧翼序列的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。上述任一所述下游侧翼序列的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。上文中，所述转基因棉花对盲蝽象的抗性高于所述目的棉花可体现为：与目的棉花相比，转基因棉花的株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数和衣分均显著提高。因此，转基因棉花抗盲蝽象特性显著增加，生产中可用于培育抗盲蝽象棉花。上述方法中，所述“检测所述待测植物样品的基因组dna中是否含有dna片段a”的方法可为s1)或s2)或s3)：s1)直接测序；s2)用引物对1和/或引物对2对待测植物样品的基因组dna进行pcr扩增，然后进行如下判断：若有目的扩增产物，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；若没有目的扩增产物，则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代；所述引物对1可为能够扩增由所述外源dna片段5’端和紧邻其所述上游侧翼序列部分或全部片段组成的dna分子甲的引物对；其对应的目的扩增产物为所述dna分子甲；所述引物对2可为能够扩增含有所述外源dna片段3’端和紧邻其所述下游侧翼序列的部分或全部组成的dna分子乙的引物对；其对应的目的扩增产物为所述dna分子乙。s3)用能特异结合所述dna分子甲或所述dna分子乙的探针对所述待测植物样品的基因组dna进行southernblot杂交，然后进行如下判断：若能得到杂交片段，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；若不能得到杂交片段，则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代。所述引物对1具体可由序列表中序列5所示的单链dna分子和序列表中序列7所示的单链dna分子组成。所述引物对2具体可由序列表中序列6所示的单链dna分子和序列表中序列8所示的单链dna分子组成。本发明还保护一种用于鉴定待测植物样品是否来源于所述培养方法获得的转基因棉花或其后代的试剂盒，包括上述任一所述引物对1和/或引物对2。本发明还保护一种获得盲蝽象抗性提高和/或株高提高和/或第一果枝长度提高和/或果枝数提高和/或结铃数提高和/或衣分提高和/或单铃重降低的棉花的方法，可包括如下步骤：(1)按照上述任一所述培养方法获得转基因棉花；(2)将所述转基因棉花自交或杂交，得到繁育后代，按照上述任一所述的方法鉴定所述繁育后代，得到目标植株。上述方法中，所述转基因棉花的种子在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为cctccno:p201822。本发明还保护d1)-d6)中的任一种。d1)采用上述任一所述培育方法获得的转基因棉花在棉花育种中的应用。d2)上述任一所述外源dna片段在调控棉花抗盲蝽象中的应用。d3)上述任一所述外源dna片段在调控棉花株高和/或第一果枝长度和/或果枝数和/或结铃数和/或衣分和/或单铃重中的应用。d4)上述任一所述外源dna片段在鉴定待测植物样品是否来源于上述任一所述培养方法获得的转基因棉花或其后代中的应用。d5)上述任一所述引物对1和/或引物对2在鉴定待测植物样品是否来源于上述任一所述培育方法获得的转基因棉花或其后代中的应用。d6)上述任一所述上游侧翼序列和/或下游侧翼序列在鉴定待测植物样品是否来源于上述任一所述培育方法获得的转基因棉花或其后代中的应用。上文中，所述目的棉花可为陆地棉。所述陆地棉具体可为陆地棉ccri24。本发明将cry51aa1.c006-1基因导入陆地棉ccri24中，使cry51aa1.c006-1基因在陆地棉ccri24中过表达，得到转基因棉花18c006-10-13，转基因棉花18c006-10-13为将外源dna片段插入目的棉花基因组第d12号染色体的第63328845-63329028位间，替换掉第d12号染色体的第63328845-63329028位间182bp的碱基序列，得到的棉花。试验证明，转基因棉花18c006-10-13不仅抗盲蝽象方面具有高抗特性，而且株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数和衣分也高于陆地棉ccri24。本发明为培育具有抗盲蝽象的转基因棉花奠定基础，具有重要的应用价值。附图说明图1为18c006-10-13的序列分析。图2为转基因棉花18c006-10-13和陆地棉ccri24的离体鉴定。图3为t5代转cry51aa1.c006-1棉花纯合株系18c006-10-13和陆地棉ccri24的田间生长情况。图4为转基因棉花18c006-10-13和陆地棉ccri24的网室鉴定。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的陆地棉ccri24在文献“pag1，acottonbrassinosteroidcatabolismgene，modulatesfiberelongation”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。下述实施例中的农杆菌lba4404在文献“constitutiveexpressionofthevirulencegenesimprovestheefficiencyofplanttransformationbyagrobacterium”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。下述实施例中涉及的引物的核苷酸序列见表1。表1核苷酸序列(5’-3’)在序列表中的位置引物5gagcttggatcagattgtcg序列5引物6actatagggcacgcgtggt-引物7gtttcgctcatgtgttgagc序列6引物8gccgtcgttttacaacgtc-引物9cgatcgcccttcccaac-引物10gaggatctcgtcgtgacac-引物11cgacaagctcgagtttctc-引物12gtaatacgactcactatagggcacgcgtggtntcgastwtsgwgtt-引物13gtaatacgactcactatagggcacgcgtggtngtcgaswganawgaa-引物14gtaatacgactcactatagggcacgcgtggtwgtgnagwancanaga-引物15gtaatacgactcactatagggcacgcgtggtagwgnagwancawagg-引物16gtaatacgactcactatagggcacgcgtggtngtawaasgtntscaa-引物17gtaatacgactcactatagggcacgcgtggtngacgaswganawgac-引物18gtaatacgactcactatagggcacgcgtggtngacgaswganawgaa-引物19gtaatacgactcactatagggcacgcgtggtgtncgaswcanawgtt-引物20gtaatacgactcactatagggcacgcgtggtncagctwsctntsctt-引物21gtaatacgactcactatagggc-引物22cttgtctgatcgatgtgaac序列7引物23cacctcagaagttgaagcctg序列8注：“-”表示不存在；n为a或c或g或t，s为c或g，w为a或t。实施例1、转cry51aa1.c006-1棉花的获得及农艺性状分析一、转cry51aa1.c006-1棉花的获得1、重组载体的构建将表达盒a插入pcambia2301载体(该质粒购于ntcc典型培养物保藏中心下属的biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号为：biovectorpcambia1300)的ecori和hindiii酶切位点间，且保持pcambia2301载体的其他序列不变，得到重组载体(核苷酸序列如序列表中序列4所示)。上述表达盒a的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第2186-3822位所示。表达盒a从上游依次包括来自椰菜花叶病毒的camv35s的启动子、cry51aa1.c006-1基因和nos终止子；其中，camv35s启动子的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第2192-2537位核苷酸所示；cry51aa1.c006-1基因的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第2614-3534位核苷酸所示；nos终止子的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第3569-3821位核苷酸所示。pcambia2301载体自身包括表达盒b和表达盒c。表达盒b从上游起依次包括花椰菜花叶病毒的camv35s的增强启动子、kanr抗生素标记基因和ploya终止子。表达盒c从上游起依次包括花椰菜花叶病毒的camv35s的启动子、gus标记基因和nos终止子。2、重组菌的获得将步骤1获得的重组载体导入农杆菌lba4404中，得到重组菌。3、转cry51aa1.c006-1棉花的获得采用农杆菌介导的方法将步骤2获得的重组菌转化陆地棉ccri24的外植体(1500个)，在含有卡那霉素的培养基上培养诱导形成愈伤组织，选择转化的愈伤组织，愈伤组织在卡那霉素筛选培养基上形成胚性愈伤组织，挑选存活的胚性愈伤转化形成再生成棉花，最后共获得50个t0代转cry51aa1.c006-1棉花，并将其用于筛选。4、转cry51aa1.c006-1棉花的鉴定(1)对收获的t1代转cry51aa1.c006-1棉花种子在温室种植，进行温室功效分析和分子分析。提取t1代转cry51aa1.c006-1棉花叶片的dna，采用引物：5’-acccatccaaggttgatacc-3’和5’-ttgataggtgaagtcggagc-3’进行pcr扩增，检测目的基因是否存在，并统计材料的分离比。根据孟德尔遗传定律，获得12个单拷贝的t1代转cry51aa1.c006-1棉花；(2)采用taqmanpcr和southernblot对上述步骤(1)获得的12个单拷贝的t1代转cry51aa1.c006-1棉花进一步验证。具体步骤如下：在始花期对获得的12个单拷贝的t1代转cry51aa1.c006-1棉花材料和陆地棉ccri24材料的cry51aa1.c006-1基因表达量进行分析，表明12个单拷贝的t1代转cry51aa1.c006-1棉花中有9个t1代转cry51aa1.c006-1棉花的表达量较陆地棉ccri24大幅提高。(3)在开花期测定上述步骤(2)获得的9个t1代转cry51aa1.c006-1棉花材料的农艺学性状和盲蝽象抗性。结果表明，9个t1代转cry51aa1.c006-1棉花中9个t1代转cry51aa1.c006-1棉花的部分农艺性状(如株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数)和盲蝽象抗性较陆地棉ccri24显著提高。(4)在第一年田间大田试验中在相同位置的成对地块中评估9个t2代转cry51aa1.c006-1棉花的农艺和品质性状(株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数、单铃重、衣分，其中纤维品质包括长度、比强度、马克隆值、伸长率、整齐度)及盲蝽象抗性。结果表明：9个t2代转cry51aa1.c006-1棉花中共有2个t2代转cry51aa1.c006-1棉花的部分农艺性状(株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数、衣分)和盲蝽象抗性显著好于陆地棉ccri24。(5)在第二年田间大田试验中在相同位置的成对地块中评估上述步骤(4)获得的2个t2代转cry51aa1.c006-1棉花的农艺和品质性状(株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数、单铃重、衣分，其中纤维品质包括长度、比强度、马克隆值、伸长率、整齐度)及盲蝽象抗性。结果表明：2个t2代转cry51aa1.c006-1棉花中共有1个t2代转cry51aa1.c006-1棉花的部分农艺性状(株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数、衣分)和盲蝽象抗性显著好于陆地棉ccri24，将该t2代转cry51aa1.c006-1棉花的种子命名为18c006-10-13，将t2代转cry51aa1.c006-1棉花18c006-10-13进行自交，直至获得t5代转cry51aa1.c006-1棉花纯合株系18c006-10-13。2018年10月30日将t5代转cry51aa1.c006-1棉花种子(gossypiumhirsutuml.)18c006-10-13保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为陆地棉种子c006-10-13，保藏编号为cctccno:p201822。二、转cry51aa1.c006-1棉花的农艺性状分析1、棉花盲蝽象抗性鉴定方法抗性鉴定方法参考2015年发布与实施的行业标准“棉花抗盲蝽象性鉴定方法《中华人民共和国农业行业标准(ny/t2676-2015)》”。(1)离体鉴定(见图2，c006-10-13为18c006-10-13，ccri24为陆地棉ccri24)将带有小蕾的棉花枝条插入到盛有2％琼脂的透明塑料杯中，然后将3头盲蝽象若虫接入其中，上方覆盖倒置的扎有孔洞的塑料杯，防止水汽产生，并用封口膜将杯口密封，防止盲蝽逃逸。待试验进行至第6天时，进行活虫数及发育至成虫数的调查。(2)网室鉴定(见图4，c006-10-13为18c006-10-13，ccri24为陆地棉ccri24)1)棉花种子应符合gb4407.1对种子质量的要求；2)鉴定在网室内进行，网室规格长×宽×高分别为20m×3m×2m，尼龙网为80目；3)鉴定方法：a.试验设计与管理：网室内随机排列种植供试棉花材料与感虫对照棉花材料，每材料种1行，株距为0.25m、行距为0.80m。每个网室为一次重复，共3次重复。网室内棉花栽培管理方式同大田，试验前7d-10d喷施残效短的化学农药清洁网室，试验期间不施用任何化学农药。b.播种：供试棉花材料和感虫对照材料均按当地棉花常规播种时期和播种量进行播种。c.试虫饲养：为室内用豇豆、嫩玉米穗等人工饲养的1龄-5龄盲蝽象混合种群。d.试虫释放时期及释放量：网室内棉花生长到4叶-6叶期时释放盲蝽象，释放时选择活动力强的个体，每株棉花释放1头。e.结果记录：试虫释放7d-10d后，每个网室每个材料随机调查10株，记录棉株上部5片嫩叶的受害情况，同时调查棉花的蕾铃数量和总蕾铃数。棉花叶片受害情况划分为5个级别，即0级、1级、2级、3级和4级，分级标准如下：0级为叶片无危害状；1级为叶片轻微受害，0％＜受害面积≤5％；2级为叶片中等受害，5％＜受害面积≤20％；3级为叶片严重受害，20％＜受害面积≤50％；4级为叶片危害同对时品种，受害面积>50％。f.鉴定指标：叶片危害指数(每株棉花上部5片叶片的危害级别均值)、叶片危害指数减退率(％)、棉蕾被害率(％)和棉蕾被害减退率(％)。抗性鉴定结果见表2(ck为陆地棉ccri24)。结果表明，与陆地棉ccri24相比，18c006-10-13的盲蝽象抗性显著提高。表2.18c006-10-13和陆地棉ccri24的盲蝽象抗性待测棉花幼虫死亡率(％)校正死亡率(％)发育至成虫数(头)发育至成虫比例(％)18c006-10-1361.90±15.3154.28±18.370.4±0.314.29±9.91ck16.67±7.45-0.8±0.427.78±13.382、农艺性状将t5代转cry51aa1.c006-1棉花纯合株系18c006-10-13与陆地棉ccri24进行其他农艺性状的考察与测定。在河南安阳设计小区试验，设置3个小区，3个小区设置完全相同，小区行长8m，每行种植30株，行间距80cm，每个材料种植3行，小区共6行。采用students’test对t5代转cry51aa1.c006-1棉花纯合株系18c006-10-13与陆地棉ccri24的株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数、衣分分别进行了统计分析。田间生长情况见图3(c006-10-13为t5代转cry51aa1.c006-1棉花纯合株系18c006-10-13，ccri24为陆地棉ccri24)。统计结果见表3。结果表明，与陆地棉ccri24相比，t5代转cry51aa1.c006-1棉花纯合株系18c006-10-13的株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数、衣分均显著提高，单铃重显著降低。表3.转基因棉花18c006-10-13和陆地棉ccri24的农艺性状比较3、其他方面的影响由于启动子是组成型启动子，因此不仅在绿色组织(包括茎、叶、蕾、生长点)中表达，其他组织也会受到一定影响。为了研究除了改良盲蝽象抗性外，cry51aa1.c006-1基因对其他组织是否产生影响，对t5代转cry51aa1.c006-1棉花纯合株系18c006-10-13与陆地棉ccri24的纤维长度、比强度、马克隆值、整齐度指数和伸长率进行了检测。统计结果见表4。结果表明，与陆地棉ccri24相比，t5代转cry51aa1.c006-1棉花纯合株系18c006-10-13的马克隆值与伸长率均有所提高但无显著差异，纤维长度、断裂比强度、整齐度指数均有降低但无显著差异。表4.转基因棉花18c006-10-13和陆地棉ccri24的纤维品质数据比较三、18c006-10-13的dna序列的表征分析采用分子生物学的方法分析18c006-10-13基因组的插入物和与插入物相连接侧翼连接的基因组序列。具体步骤如下：1、提取棉花的基因组。温室或大田条件下，取18c006-10-13的棉花的幼嫩叶片约100mg置于2.0ml的ep管中，采用液氮冷冻ep管，然后采用冷冻研磨仪研磨，采用qiagen公司dneasyplantminikit(50)(货号69104)中提供的方案提取基因组dna。该方法可经本领域技术人员改进以从任何组织(包括但不限于种子)提取dna。2、根据诺唯赞公司的pcrmastermix(p213-aa)进行融合引物和巢式相结合的fpni-pcr(wangetal.2011)。根据已知的转基因插入物序列，在其5’端和3’端分别设计三条巢式引物(5’端的三条巢式引物为引物8、引物9和引物5，3’端的三条巢式引物为引物10、引物11和引物7)。在棉花基因组上设计的pcr引物第一轮为融合引物，共9条(引物12-引物20)，这9条引物分别与引物8和引物10进行第一轮扩增。在棉花基因组上设计第二轮pcr扩增引物(引物21)，引物21分别和引物9、引物11进行第二轮扩增。在棉花基因组上设计第三轮pcr扩增引物(引物6)，引物6分别和引物5、引物7进行第三轮扩增，通过3轮pcr。利用琼脂糖凝胶电泳分离从反应产生的扩增子，随后使用qiagen凝胶纯化试剂盒(qiagen，valencia，ca)进行纯化，按照大连宝生物生命科技有限公司的pmd-19t-simple(货号：d104a)试剂盒中提供的方案将凝胶纯化的扩增子克隆入t克隆载体中，并转化大肠杆菌dh5α中，在氨苄抗性的平板上筛选转化子，并进行菌落pcr，阳性克隆进行单克隆测序。测序结果表明：转基因棉花18c006-10-13为将序列表中序列1所示的外源dna分子插入陆地棉ccri24基因组第d12号染色体的第63328845-63329028位间(序列表中序列1所示的外源dna分子的5’末端紧邻第d12号染色体的第63329028位，序列表中序列1所示的外源dna分子的3’末端紧邻第d12号染色体的第63328845位)，替换掉第d12号染色体的第63328845-63329028位间182bp的碱基序列，得到的转基因棉花，且自第63329028位上游且紧邻第63329028位核苷酸的上游侧翼片段的核苷酸序列为序列2，自第63328845位下游且紧邻第63328845位核苷酸的下游侧翼片段的核苷酸序列为序列3(图1)。实施例2、18c006-10-13繁育后代性状的获得和鉴定及其农艺性状分析一、18c006-10-13繁育后代性状的获得1、杂交在开花前1天下午通过人手工或者人为行动除去第一棉花的花粉，并且采用蜡管套住花的柱头，防止外来花粉与柱头接触，第二天上午待第二棉花的花粉散粉时，通过人手工收集第二种棉花的花粉，并将该花粉与第一种植物的花柱或柱头接触，即完成杂交过程。其中，第一棉花为实施例中的18c006-10-13时，第二棉花为其他棉花，或者第二棉花为18c006-10-13，第一棉花为其他棉花。吐絮期收获杂交铃，并将棉花自然晒干，轧花，并采用浓硫酸拖绒，即获得杂交种子。种植，获得杂种后代，即为18c006-10-13繁育后代。2、自交在开花前1天，采用嫁接夹直接夹住18c006-10-13的花蕾或者采用细线捆绑花蕾，防止开花时外来花粉与18c006-10-13的柱头接触；或者通过网袋将整个棉花植株套住，可以有效的防止通过昆虫等传粉，能够实现棉花的自花授粉。通过上述步骤可以完成自交。吐絮期收获杂交铃，并将棉花自然晒干，轧花，并采用浓硫酸拖绒，即获得自交种子，种植，得到自交后代，即为18c006-10-13繁育后代。二、18c006-10-13繁育后代性状的鉴定及其农艺性状分析(一)18c006-10-13繁育后代性状的鉴定方法以18c006-10-13繁育后代的基因组dna为模板，采用特异性引物进行pcr扩增，若pcr扩增产物含有18c006-10-13的扩增子(扩增子是指一条或者一段采用pcr扩增技术合成的dna分子)，说明18c006-10-13繁育后代具有和18c006-10-13相同的性状，若pcr扩增产物不含18c006-10-13的扩增子，说明18c006-10-13繁育后代不具有和18c006-10-13相同的性状。具体鉴定方法如下：1、鉴定方法1(1)以18c006-10-13繁育后代的基因组dna为模板，采用引物5和引物22组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。pcr扩增体系如下：2×mastrepcrmix10μl、引物5(10μm)0.5μl、引物22(10μm)0.5μl、模板dna(50ng/μl)1μl、超纯水8μl，总体积20μl。pcr反应条件如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，32个循环；72℃5min。(2)将步骤(1)获得的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：若pcr扩增产物含有约500bp的dna片段，则说明18c006-10-13繁育后代含有18c006-10-13的扩增子，18c006-10-13繁育后代具有18c006-10-13性状；否则不具有18c006-10-13性状。2、鉴定方法2(1)以18c006-10-13繁育后代的基因组dna为模板，采用引物7和引物23组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。pcr扩增体系如下：2×mastrepcrmix10μl、引物7(10μm)0.5μl、引物23(10μm)0.5μl、模板dna(50ng/μl)1μl、超纯水8μl，总体积20μl。pcr反应条件如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，32个循环；72℃5min。(2)将步骤(1)获得的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：若pcr扩增产物含有约900bp的dna片段，则说明18c006-10-13繁育后代含有18c006-10-13的扩增子，18c006-10-13繁育后代具有18c006-10-13性状；否则不具有18c006-10-13性状。(二)18c006-10-13繁育后代性状的抗盲蝽象与农艺性状分析按照实施例1中的步骤二中1的方法检测上述步骤(一)中获得的具有18c006-10-13扩增子的18c006-10-13繁育后代和陆地棉ccri24的抗盲蝽象与农艺性状分析。农艺性状分析结果见表5。结果表明，与陆地棉ccri24相比，18c006-10-13繁育后代的株高、第一果枝长度、果枝数、结铃数和衣分均显著提高。表5.转基因棉花18c006-10-13和陆地棉ccri24的农艺性状比较盲蝽象抗性鉴定结果见表6。结果表明，与陆地棉ccri24相比，18c006-10-13繁育后代的抗盲蝽象显著提高，叶片受害程度也显著降低。表6.转基因棉花18c006-10-13和受体材料ccr124的盲蝽象抗性<110>中国农业科学院棉花研究所<120>陆地棉转化事件18c006-10-13及其特异性鉴定方法<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>5965<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1tggcaggatatattgtggtgtaaacaaattgacgcttagacaacttaataacacattgcg60gacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtact120ggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatac180atactaagggtttcttatatgctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaattcc240cttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagcttgtcgatcgactcta300gctagaggatcgatccgaaccccagagtcccgctcagaagaactcgtcaagaaggcgata360gaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagc420ccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcg480gtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccat540gatattcggcaagcaggcatcgccatgtgtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgcg600cgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatc660atcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgc720ttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagc780catgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcac840ttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgca900aggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctggagttcattcag960ggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaa1020cacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctc1080cacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatccccatggtcgatcg1140acagatctgcgaaagctcgagagagatagatttgtagagagagactggtgatttcagcgt1200gtcctctccaaatgaaatgaacttccttatatagaggaaggtcttgcgaaggatagtggg1260attgtgcgtcatcccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacg1320tggttggaacgtcttctttttccacgatgctcctcgtgggtgggggtccatctttgggac1380cactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcctttcctttatcgcaatgatggcatttgt1440aggtgccaccttccttttctactgtccttttgatgaagtgacagatagctgggcaatgga1500atccgaggaggtttcccgatattaccctttgttgaaaagtctcaatagccctttggtctt1560ctgagactgtatctttgatattcttggagtagacgagagtgtcgtgctccaccatgttat1620cacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacgtcttctttttccacgatgctcc1680tcgtgggtgggggtccatctttgggaccactgtcggcagaggcatcttgaacgatagcct1740ttcctttatcgcaatgatggcatttgtaggtgccaccttccttttctactgtccttttga1800tgaagtgacagatagctgggcaatggaatccgaggaggtttcccgatattaccctttgtt1860gaaaagtctcaatagccctttggtcttctgagactgtatctttgatattcttggagtaga1920cgagagtgtcgtgctccaccatgttggcaagctgctctagccaatacgcaaaccgcctct1980ccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagc2040gggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggcttt2100acactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacac2160aggaaacagctatgaccatgattacgaattctgagacttttcaacaaagggtaatatccg2220gaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaa2280aggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatg2340cctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaag2400aagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaa2460gggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcat2520ttcatttggagagaacagccccctgagaactggtaccatctagacgaaaaacaaccaagg2580aatttgttcgttcgg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