一种具有低受体结合活性的高致病性H7N9禽流感病毒抗原及其制备方法与流程

本发明涉及病毒基因工程领域，尤其涉及一种具有低受体结合活性的高致病性h7n9禽流感病毒抗原及其制备方法。

背景技术：

a(甲)型流感病毒(influenzaavirus)，是正粘病毒科(orthomyxoviridae)的代表种。根据流感病毒感染的对象，可以将病毒分为人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒以及禽流感病毒等类群。根据血凝素蛋白(ha蛋白)以及神经氨酸酶(na)的不同，a型流感病毒可以进一步分为不同的ha亚型(h1-h18)和na亚型(n1-n11)。当人或动物感染该病毒时可能会引起流感大流行，严重时甚至导致人或动物死亡。

2013年3月，一种全球首发的新型h7n9亚型流感病毒在我国长江三角洲地区引发疫情并迅速蔓延，至今仍有散发病例。截至2018年11月，人感染h7n9确诊病例1567例，其中死亡612人，病死率高达39％。h7n9流感病毒在流行过程中，不断地进行变异与进化。ha基因进化成为长江三角洲系和珠江三角洲系；并且内部基因进一步与h9n2禽流感病毒进行重组。2013年至2016年9月的四次h7n9流行中，h7n9人感染病例由且仅由低致病性h7n9禽流感病毒(lpaih7n9)造成，lpaih7n9流感病毒感染禽类表现为无症状或轻微症状。而2016年10月开始第五次h7n9流行季，广东省首次从患者体内分离到了高致病性h7n9禽流感病毒(hpaih7n9流感病毒)，该毒株ha蛋白裂解位点为krkrtar/g或kgkriar/g基序，与lpaih7n9毒株ha蛋白裂解位点序列(kgr/g)相比，插入了多个碱性氨基酸。研究显示hpaih7n9流感病毒不仅对鸡具有高致病力，而且对小鼠、雪貂等哺乳动物也均具有高致病力。因此hpaih7n9流感病毒更加具有流感大流行的潜在威胁。

由于h7n9流感病毒不断变异，因此hpaih7n9流感病毒的抗原性分析显得尤为重要。血凝抑制(hi)试验广泛用于检测针对流感病毒ha蛋白的中和抗体效价，是who推荐的流感病毒疫苗免疫原性评估、血清流行病学研究和流感病毒抗原性分析的有效工具。hi试验是基于流感病毒ha蛋白能够结合红细胞受体、凝集红细胞，检测血清中阻断流感病毒ha蛋白凝集红细胞的抗体效价。因此，hi试验受到两方面因素影响，一方面为流感病毒ha蛋白与红细胞受体的亲和力，另一方面为抗体与流感病毒ha蛋白的结合能力。许多研究表明，当病毒株(例如hpaih7n9病毒)具有强受体亲和力时，能够更加有效地黏附红细胞，使hi抗体反应显著下降，从而错误地评价hi抗体效价以及病毒抗原性。并且无论同源还是异源h7n9免疫血清hpaih7n9流感病毒均具有hi反应性低的特点。通过红细胞受体结合实验证明hpaih7n9流感病毒具有高受体结合能力，然而通过小鼠免疫实验、微量中和(mn)试验和酶联免疫吸附试验(elisa)等证明hpaih7n9流感病毒具有良好的免疫原性而且抗原性没有发生明显改变。因此，hpaih7n9流感病毒hi结果受到高受体结合亲和力的影响，hi试验无法正确地反映针对hpaih7n9流感病毒的抗体效价，并且错误地评估其抗原性。然而，目前还没有相应的方法能够避免受体亲和力的变化对hi试验结果的影响。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供种具有低受体结合活性的hpaih7n9流感病毒抗原的制备方法，以克服传统hpaih7n9具有很高的受体结合亲和力，hi试验无法正确地反映针对hpaih7n9流感病毒的抗体效价，并且错误地评估其抗原性等问题。

本发明的目的之二在于提供一种具有低受体结合活性的hpaih7n9流感病毒抗原，以解决hi试验中受体亲和力的变化对结果的影响这一问题。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种具有低受体结合活性的hpaih7n9流感病毒抗原的制备方法，包括以下步骤：

制备突变ha基因：制备突变后的高致病性h7n9禽流感病毒全长ha蛋白的基因序列，得到r220g突变ha基因；其中所述r220g突变ha基因序列如seqidno.2所示；

拯救病毒：采用r220g突变ha基因拯救重组流感病毒。

进一步地，在制备r220g突变ha基因的步骤中，首先合成高致病性h7n9禽流感病毒全长ha蛋白的基因序列，所述高致病性h7n9禽流感病毒全长ha蛋白的基因序列如seqidno.1所示；

通过同源重组将高致病性h7n9禽流感病毒全长ha蛋白的基因序列插入流感病毒反向遗传操作质粒pm中，制得pm-h7/gd16/wt质粒。

进一步地，在制备r220g突变ha基因步骤中，设计点突变引物对插入pm质粒的高致病性h7n9禽流感病毒全长ha蛋白的基因序列进行定点突变，制得pm-h7/gd16/r220g质粒；

其中，所述点突变引物的序列如seqidno.3及seqidno.4所示。

进一步地，在通过同源重组将高致病性h7n9禽流感病毒全长ha蛋白的基因序列插入流感病毒反向遗传操作质粒pm中，制得pm-h7/gd16/wt质粒的步骤中，包括：

根据所述高致病性h7n9禽流感病毒全长ha蛋白的基因序列和质粒pm的3’和5’末端设计同源重组引物，其中引物的如seqidno.5及seqidno.6所示。

进一步地，在拯救病毒步骤中，将pm-h7/gd16/r220g质粒与pb2重组pm质粒、pb1重组pm质粒、pa重组pm质粒、np重组pm质粒、na重组pm质粒、m重组pm质粒及ns重组pm质粒混合，共转染至293t和mdck共培养细胞中，收集细胞转染上清，制得重组流感病毒。

进一步地，所述na重组pm质粒为pm-n9/gd16质粒，其中pm-n9/gd16质粒中的na基因的序列如seqidno.7所示。

进一步地，共转染12～24h后加入终浓度为0.5～2.5μg/ml的tpck-trypsin，继续培养后收集细胞转染上清；

将上清接种于spf鸡胚尿囊腔中，孵育、收集鸡胚尿囊液，制得重组流感病毒。

进一步地，还包括：制备pm-n9/gd16质粒：

合成高致病性h7n9禽流感病毒na蛋白的基因序列；

通过同源重组将高致病性h7n9禽流感病毒na蛋白的基因序列插入禽流感病毒反向遗传操作质粒pm中，制得pm-n9/gd16质粒。

在通过同源重组将高致病性h7n9禽流感病毒na蛋白的基因序列插入禽流感病毒反向遗传操作质粒pm中，制得pm-n9/gd16质粒的步骤中，包括：

进一步地，根据所述高致病性h7n9禽流感病毒全长na蛋白的基因序列和质粒pm的3’和5’末端设计同源重组引物，其中引物的如seqidno.8及seqidno.9所示。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

具有低受体结合活性的hpaih7n9流感病毒抗原，采用任一项所述的具有低受体结合活性的hpaih7n9流感病毒抗原的制备方法制得。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明具有低受体结合活性的hpaih7n9流感病毒抗原的制备方法制备出的重组hpaih7n9流感病毒，将位于受体结合区域的220位点的精氨酸(r)突变为甘氨酸(g)，使ha蛋白受体结合亲和力降低，能够使hi试验结果不受高受体结合亲和力的影响。

(2)本发明具有低受体结合活性的hpaih7n9流感病毒抗原的制备方法制备出的重组hpaih7n9流感病毒删除了ha蛋白裂解位点多个碱性氨基酸，提升了重组病毒的生物安全性，使重组病毒能够在生物安全二级实验室中进行操作。

附图说明

图1为纯化的h7n9/gd16/wt和h7n9/gd16/r220g重组病毒红细胞受体结合实验结果。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

本发明的主要目的在于提供一种具有低受体结合活性的hpaih7n9流感病毒抗原的制备方法及构建的重组具有低受体结合活性的hpaih7n9流感病毒抗原。

ha蛋白与受体结合特性、病毒的生长复制能力等生物学特性息息相关。当病毒株具有强受体亲和力时，能够更加有效地黏附红细胞，使hi抗体反应显著下降，从而错误地评价hi抗体效价以及病毒抗原性。降低hpaih7n9流感病毒抗原的受体结合亲和力，能够使hi实验正确评价hpaih7n9流感病毒的hi抗体效价。因此，本发明将位于受体结合区域220位点的(按h3亚ha顺序编码，对应h7编码顺序为229位)精氨酸(r)突变为甘氨酸(g)，从而制备ha蛋白受体结合亲和力降低的hpaih7n9流感病毒。

实施例1

降低hpaih7n9流感病毒受体结合亲和力的方法

第一步，合成ha基因：首先根据who推荐的hpaih7n9流感疫苗株a/guangdong/17sf003/2016(h7n9)的ha基因序列，合成裂解位点多个碱性氨基酸删除的ha基因，裂解位点多个碱性氨基酸删除的ha基因(称为h7/gd16/wt)交由金斯瑞公司完成。现有研究表明，具有多个碱性氨基酸的裂解位点是高致病性禽流感病毒的标志，删除多个碱性氨基酸后能够降低其致病性，使重组病毒能够在生物安全二级实验室中进行操作，同时不影响ha蛋白的免疫原性。出于安全性的考虑，将hpaih7n9流感疫苗株的ha基因中具有高致病性禽流感病毒特性的裂解位点改为与lpaih7n9流感病毒ha基因相同的裂解位点。其中，删除多个碱性氨基酸的hpaih7n9流感病毒全长ha蛋白(称为h7/gd16/wt)的基因序列如seqidno.1所示。此处选择合成ha基因序列的方式可以是全基因合成手段，也可以是通过dna扩增或者rna扩增(即rna经反转录得到dna模板后再扩增)手段。基因合成交由金斯瑞公司完成。

第二步：构建pm-h7/gd16/wt重组质粒

根据插入片段ha和pm载体的3’、5’末端设计同源重组的上、下游引物，引物序列为：

ha-f：tccgaagttggggccagcaaaagcaggggatacaaaatg；对应于序列表中的seqidno.5；

ha-r：ggccgccgggttattagtagaaacaagggtgtttttttc；对应于序列表中的seqidno.6。

分别以合成的ha基因为模板，通过上、下游引物获得对应ha基因的pcr产物。pcr产物经过凝胶电泳检测后，采用胶回收试剂盒进行pcr产物的回收和纯化。分别将纯化的pcr产物与线性化的pm质粒通过clonexpressii同源重组试剂盒进行同源重组，具体方法参见说明书。获得的pm-h7/gd16/wt重组质粒进过测序验证后可以用于反向遗传技术拯救重组流感病毒。

第三步，ha基因的定点突变：

为了将ha蛋白220位点的精氨酸(r)突变为甘氨酸(g)，首先设计定点突变引物：

r220g-f：cgagtccaggagcaggaccacaagttaatg，对应于序列表中的seqidno.3；

r220g-r：cattaacttgtggtcctgctcctggactcg，对应于序列表中的seqidno.4。

采用quikchange定点突变试剂盒将pm-h7/gd16/wt突变为pm-h7/gd16/r220g。重组质粒pm-h7/gd16/r220g经测序验证后用于反向遗传技术拯救重组流感病毒。

拯救病毒的过程

将生长状态良好的293t细胞和mdck细胞分别以4×10⁵个细胞/ml和5×10⁴个细胞/ml密度共培养于6孔板中，37℃培养16-24h后可用于质粒的转染。

分别将实验室保存的来源于pr8株的pb2、pb1、pa、np、na、m、ns重组pm质粒按照1μg每孔混合，并向每孔加入1μgpm-h7/gd16/wt。质粒混合物分别通过lipofectamine2000转染试剂共转染至293t和mdck共培养细胞中，转染方法参见说明书。转染后37℃培养16h，之后加入终浓度为1μg/ml的tpck-trypsin。继续培养24h后，收集细胞转染上清，接种于9～11日龄spf鸡胚尿囊腔中。鸡胚于37℃培养箱内孵育48h，收集鸡胚尿囊液用1％鸡红细胞进行血凝(ha)试验。根据ha基因的序列差异，重组流感病毒称为h7/gd16/r220g。

实施例2

实施例2与实施例1的不同点在于：实施例2中的na片段选自非奥司他韦耐药性突变的n9na基因。含有奥司他韦耐药性突变的na基因具有耐奥司他韦耐的效果，使用这种突变的na基因制备的hpaih7n9流感病毒具有耐药基因泛滥的风险，通过使用非奥司他韦耐药性突变的na基因，能够避免奥司他韦耐药性突变的na基因广泛播散流感病毒。实施例2中h7/gd16/wt的合成ha基因、构建pm-h7/gd16/wt重组质粒以及ha基因的定点突变均同上述实施例1。

第一步，na基因选用lpaih7n9疫苗株a/anhui/1/2013(h7n9)的na基因(gisaidid:epi439509，称为n9/ah13)，n9/ah13交由金斯瑞公司完成，n9/ah13的序列如seqidno.7所示。

第二步，构建pm-n9/gd16/wt重组质粒

采用pcr扩增的手段扩增na片段，根据插入片段na和pm载体的3’、5’末端设计同源重组的上、下游引物，引物序列为：

na-f：tccgaagttggggccagcaaaagcagggtcaagatgaatc(参见seqidno.8)；

na-r：ggccgccgggttattagtagaaacaagggtctttttcttc(参见seqidno.9)。

分别以合成的na基因为模板，通过上、下游引物获得对应na基因的pcr产物。pcr产物经过凝胶电泳检测后，采用胶回收试剂盒进行pcr产物的回收和纯化。分别将纯化的pcr产物与线性化的pm质粒通过clonexpressii同源重组试剂盒进行同源重组。获得的pm-n9/gd16重组质粒进过测序验证后可以用于反向遗传技术拯救重组流感病毒。

第三步，ha基因的定点突变，与实施例1相同。

拯救病毒的过程

将生长状态良好的293t细胞和mdck细胞分别以4×10⁵个细胞/ml和5×10⁴个细胞/ml密度共培养于6孔板中，37℃培养16-24h后可用于质粒的转染。

分别将实验室保存的来源于pr8株的pb2、pb1、pa、np、m、ns重组pm质粒按照1μg每孔混合，并向每孔加入1μgpm-h7/gd16/wt及1μgpm-n9/gd16。另外，将实验室保存的来源于pr8株的pb2、pb1、pa、np、m、ns重组pm质粒按照1μg每孔混合，并向每孔加入1μgpm-h7/gd16/r220g及1μgpm-n9/gd16，8质粒混合物也按照相同方法混合。质粒混合物分别通过lipofectamine2000转染试剂共转染至293t和mdck共培养细胞中，转染方法参见说明书。转染后37℃培养16h，之后加入终浓度为1μg/ml的tpck-trypsin。继续培养24h后，收集细胞转染上清，接种于9～11日龄spf鸡胚尿囊腔中。鸡胚于37℃培养箱内孵育48h，收集鸡胚尿囊液用1％鸡红细胞进行血凝(ha)试验。根据ha基因的序列差异，两种重组流感病毒分别称为h7n9/gd16/wt和h7n9/gd16/r220g。ha试验结果显示，h7n9/gd16/r220g拯救成功，血凝效价为2¹⁰。

病毒基因测序验证

通过病毒核酸提取试剂盒提取重组流感病毒rna，以上述ha和na基因扩增引物通过一步法反转录试剂盒分别扩增病毒ha基因和na基因。扩增后的基因插入pmd-18t质粒，并进行测序。测序结果正确的重组病毒作为hpaih7n9流感病毒候选疫苗株。

实施例3

具有低受体结合亲和力的hpaih7n9流感病毒的制备方法，包括灭活步骤。

第一步，流感病毒的灭活

对上述实施例2制备出的重组流感病毒进行灭活，具体灭活方法如下。采用甲醛溶液进行灭活，向病毒尿囊液中加入终浓度为0.1％的甲醛溶液，37℃灭活16小时。灭活后的流感病毒在鸡胚中连续传代三次，传代后检测不到血凝效价判定为灭活成功。

灭活和纯化后的h7n9/gd16/wt和h7n9/gd16/r220g重组病毒记为两株hpaih7n9流感病毒，即为hpaih7n9流感病毒hi检测抗原。

效果实施例

(1)重组流感病毒受体结合亲和力的测定

采用红细胞受体结合实验分析重组流感病毒h7n9/gd16/wt和h7n9/gd16/r220g的对红细胞的受体结合能力。由于神经氨酸酶切割红细胞表面的唾液酸受体，流感病毒与不同浓度神经氨酸酶处理的红细胞的凝聚水平能够反映流感病毒的受体结合活性。首先将来源于霍乱弧菌的神经氨酸酶进行梯度稀释，分别37℃处理浓度为10％的鸡红细胞1h，处理后的鸡红细胞用pbs溶液洗两遍，并稀释至1％。将待测病毒统一至2个血凝单位，分别将50μl待测病毒与50μl不同浓度神经氨酸酶处理的鸡红细胞在v板上混合孵育，室温孵育1h，记录待测流感病毒能够凝集红细胞的最大神经氨酸酶浓度。结果如图1所示，h7n9/gd16/wt病毒能够凝集52μg/ml神经氨酸酶处理的红细胞，而h7n9/gd16/r220g流感病毒仅能够凝集6.5μg/ml神经氨酸酶处理的红细胞。结果表明h7n9/gd16/r220g流感病毒受体结合亲和力显著低于h7n9/gd16/wt。

(2)流感病毒抗原的hi试验结果

采用who推荐的标准方法对h7n9/gd16/wt和h7n9/gd16/r220g病毒抗原进行hi试验，其中采用h7n9/ah13免疫猕猴血清和h7n9/gd16免疫猕猴血清。结果如表1，无论对h7n9/ah13免疫猕猴血清还是h7n9/gd16免疫猕猴血清，以h7n9/gd16/r220g作为抗原检测hi抗体滴度高于h7n9/gd16/wt抗原32倍。

表1免疫血清与病毒抗原hi试验结果

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。