一种月季花香基因沉默的快速方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及月季基因功能研究技术，具体涉及一种通过病毒诱导的基因沉默结合嫁接技术以实现月季花香基因沉默的快速方法。

背景技术：

月季（rosahybridal.）因具有美丽的花色、花型及宜人的花香而位居世界四大切花之首。经过近200年的选育和杂交，现代月季高达35000个品种，但由于传统的杂交育种的局限性，以及育种家们注重花色、花形、花径、瓣数和茎长等外观性状的改良，而内在性状，如香味、瓶插寿命以及对病虫害的抵抗能力等未得到相应的提高，导致许多现代月季缺乏明显的香味。月季花香不仅具有重要的生物学意义，而且具有重要的观赏性状和商业价值。目前，由于市场对香味品种的青睐，增加香味的遗传改良成为月季育种的一个重要方向。近五年，随着二代及三代测序技术的应用，月季不同性状关联的转录组及基因组数据已相继发表，大量的功能基因需要进行验证，而蔷薇属植物再生体系困难限制了通过转基因技术进行功能分析。

国外研究者通过直接或间接的器官发生途径和体细胞胚发生途径，以叶片、茎段、花瓣和花丝等为外植体在一些月季品种的植株再生上获得了一定的成功；国内集中在通过类原球茎再生途径在狗蔷薇（r.canina）、粉团蔷薇(r.multifloravar.cathayensis)、香水月季（r.odorata）等获得了成功，以及以现代月季品种‘萨曼莎’为材料的直接和间接再生体系建立。然而，这些转化体系均存在周期较长、转化率低等问题，限制了月季基因功能分析。

vigs最初是从茄科植物中作为基因沉默的快速方法开发而来，目前已成为各种植物功能基因组学研究的一个有力的工具，尤其是对于那些生命周期长、转化效率低的植物的研究。叶片（子叶）渗透是农杆菌接种引发vigs的最常见方法，该方法中将幼嫩的完全展开的叶片（子叶）用携带重组病毒载体的农杆菌悬浮液浸透。由于月季（以及许多其它植物，特别是木本植物）的叶片很难渗透，所以使用幼嫩插条或幼苗进行真空渗透最先被用于农杆菌侵染。然而，侵染的幼苗往往需要两个月以上的时间才能开花，这样的长周期常常导致花中沉默效率降低。另一方面，尽管使用离体的月季花瓣进行vigs可以很快（一周内）诱导强烈的基因沉默，但是该方法却不能用于月季花香相关基因的功能研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有月季转基因技术的不足，提供一种以病毒诱导的基因沉默技术（vigs）与嫁接相结合，以月季幼嫩顶芽为转化受体、通过农杆菌介导实现月季花香基因功能快速分析的方法。该方法将花香基因连接到vigs质粒上，通过农杆菌抽真空转化月季嫩芽，进一步将嫩芽嫁接到月季茎段上，从而获得相应花香基因沉默植株，以达到基因功能分析的目的。该方法的建立，为研究月季及其他木本植物花香基因功能提供有效的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：一种月季花香基因沉默的快速方法，以月季幼嫩顶芽为农杆菌感染的受体，通过vigs系统实验目标基因沉默，采用芽接的方法将受体芽组织嫁接到砧木，侵染组织嫁接后保湿1周，6周后转化花芽相继开花，经rt-qpcr技术检测，获得目的基因沉默植株，经gc/ms分析对沉默目标基因的月季植株进行花香分析。具体包括以下步骤：

（1）转化外植体的准备及选择：选取月季新抽出枝条的嫩芽枝条3～8cm作为待转化受体月季嫩芽枝条；

（2）农杆菌的转化：按常规分别挑取农杆菌单克隆trv1和trv2（携带目的基因），于含有50mg/l卡那霉素和25mg/l利福平的yep液体培养基中，以28℃200rpm进行振荡活化培养12小时，转接并二次活化农杆菌菌液浓度至od600=0.4～0.8，4℃5000rpm离心5分钟收集菌体，弃上清用含10mm氯化镁、200mm乙酰丁香酮及10mmmes的缓冲液悬浮菌体至od600=0.4，即得到农杆菌菌液；

将步骤（1）的待转化受体月季嫩芽枝条置于上述农杆菌菌液中，在25kpa条件下抽真空1min，重复1次，即完成侵染，将侵染过的嫩芽枝条置于无菌滤纸上吸去多余的菌液；

（3）转基因嫩芽嫁接：将嫁接砧木的茎段从中间切开，将步骤（2）所得侵染过的嫩芽枝条茎部末端削成“楔”型，放到砧木茎段中间，用保鲜膜将嫁接部位包裹好；

（4）嫁接枝条的生长发育观察：嫁接侵染后的嫩芽枝条用塑料袋套住整个枝条一周以保湿，一周后观察到嫁接部位有愈伤组织生长，接穗部分正常生长；两周后接口部位生长完好，嫁接的嫩芽快速生长；三到四周观察到嫁接枝条的花芽；五到六周嫁接枝条的花蕾相继开花。

所述步骤（1）的嫩芽枝条要求嫩芽无病害、粗壮、且生长势旺盛。

所述步骤（3）的嫁接砧木是与待转化受体月季嫩芽为相同的材料，其为中度成熟。

为验证步骤（4）所得花朵的沉默效率，对转化枝条的分子生物学鉴定及gc/ms进行分析，具体如下：取步骤（4）所得花朵，即为沉默目的基因的花朵，按常规进行转入目的基因的pcr和花香的气质联用仪（gc/ms）检测。

本发明与现有的月季基因功能分析方法相比，在转化程序，转化周期和转化效率等方面都具有明显的优势，具体表现在：

1、缩短了基因功能分析的周期：嫁接辅助的vigs方法，能够在完整的月季植株上有效地实现沉默目标基因，获得基因沉默的花朵的时间仅为30～45天，比传统方法（大约90～270天）缩短了3～6倍。

2、提高了效率：侵染效率达到47.4％。而使用生根的插条或幼苗的传统方法，只有大约33.3％至34.3％的沉默效率。因此，与传统方法相比，“嫁接辅助的vigs”方法诱导月季，特别是月季花香基因沉默效率显著提高。

附图说明

图1为实施例1用于月季嫁接辅助的vigs方法操作示意图；

a．用于真空侵染和嫁接的幼芽；b.侵染枝条嫁接到砧木；c.嫁接苗保湿7d；d.嫁接成活的枝条；e.嫁接枝条和砧木愈合；f.嫁接枝条开的花；g.侵染嫁接枝条不同部位上trv2的相对表达量；图中，le:叶；ste:茎；pe：花瓣；sta:雄蕊；pi:雌蕊；rcgapdh基因为内参。

图2为实施例2月季花香基因沉默的分子及花香物质gc/ms分析图。

a.对照（未侵染）中月季花香物质gc/ms分析（①丁香酚的相对含量为12.76%）；b.携带目的基因（rcegs1）vigs侵染后季花香物质gc/ms分析（②丁香酚的相对含量为4.21%）；c.目的基因rcegs1的表达分析；d.丁香酚在对照和rcegs1基因沉默植株中的含量；图中，株系linea,lineb,linec代表三个rcegs1基因沉默植株，nt代表未转化对照，trv2代表转化的空载体。可见，花香基因rcegs1得到了沉默，相应的花香物质也有所改变。

具体实施方案

下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但它们并非是对本发明的限定。

实施例1

（1）转化外植体的准备及选择：选取月季‘月月粉’新抽出枝条的嫩芽枝条3～8cm作为待转化受体月季嫩芽枝条，要求嫩芽无病害、粗壮、且生长势旺盛；

（2）农杆菌的转化：按常规分别挑取农杆菌单克隆ptrv1和ptrv2（携带目的基因），于含有50mg/l卡那霉素和25mg/l利福平的yep液体培养基中，以28℃200rpm进行振荡活化培养12小时，转接并二次活化农杆菌菌液浓度至od600=0.4～0.8，4℃5000rpm离心5分钟收集菌体，弃上清用含10mm氯化镁、200mm乙酰丁香酮及10mmmes的缓冲液悬浮菌体至od600=0.4，即得到农杆菌菌液；

将步骤（1）的待转化受体月季嫩芽枝条置于上述农杆菌菌液中，在25kpa条件下抽真空1min，重复1次，即完成侵染，将侵染过的嫩芽枝条置于无菌滤纸上吸去多余的菌液；

（3）转基因嫩芽嫁接：选择中度成熟的、与待转化受体月季嫩芽相同的材料作为嫁接砧木，将嫁接砧木的茎段从中间切开，将步骤（2）所得侵染过的嫩芽枝条茎部末端削成“楔”型，放到砧木茎段中间，用保鲜膜将嫁接部位包裹好；

（4）嫁接枝条的生长发育观察：嫁接侵染后的嫩芽枝条用塑料袋套住整个枝条一周以保湿，一周后观察到嫁接部位有愈伤组织生长，接穗部分正常生长；两周后接口部位生长完好，嫁接的嫩芽快速生长；三到四周观察到嫁接枝条的花芽；五到六周嫁接枝条的花蕾相继开花。

为验证步骤（4）所得花朵的沉默效率，对转化枝条的分子生物学鉴定及gc/ms进行分析，具体如下：取步骤（4）所得花朵，即为沉默目的基因的花朵，按常规进行转入目的基因的pcr和花香的气质联用仪（gc/ms）检测。

图1a为农杆菌菌液真空侵染月季‘月月粉’的嫩芽，经过侵染的嫩芽通过横切面结合的方式嫁接回‘月月粉’的枝条上（图1b），并保湿7d（图1c）。结果显示，试验中20个侵染的嫩芽中有18个存活（图1e）并在侵染后30～45天开花（图1f），而使用扦插苗或实生苗的常规方法分别至少需要90d、240d，相比之下时间得到极大的缩短。使用实时荧光定量pcr对侵染的枝条进行检测，在13株中发现了trv的转录本，表明侵染效率在72.2%。进一步地发现，重组trv在嫁接的枝条中成功扩散到所有新生的器官，包括新叶、茎、花瓣、雄蕊和雌蕊（图1g）。结果显示，内源trv转录本在‘月月粉’花中比叶中有更高的水平、在雄蕊中比茎中有更高的水平。以上结果表明，通过嫁接的方法可以在‘月月粉’中快速有效地进行vigs沉默实验。嫁接之后，重组trv病毒可以移动到新生的叶子和花器官并实现积累。

实施例2

同实施例1，不同是vigs系统携带了花香基因rcegs1。

结果发现20个嫁接的嫩芽有19个成活，并在侵染36d后开花。rt-qpcr的结果表明，有9株rcegs1侵染的植株花瓣中存在病毒转录物，表明重组trv病毒成功地转移至新发育的花器官中，侵染效率为47.4%。而且，沉默植株花瓣中rcegs1转录本的丰度大大减少（图2c）。使用固相微萃取-气相色谱/质谱法(spme-gc/ms)检测三个独立沉默植株上花的挥发性化合物含量，结果表明挥发性香叶醇相对含量显著降低（图2d）。对照植株中丁香酚占总挥发物的相对含量为12.76%（图2a），而在沉默植株中仅占总挥发物的4.21%（图2b）。结果表明，嫁接辅助的vigs方法，快速而有效地沉默了花香相关基因的表达。

实施例3

同实施例1，不同是vigs系统携带了花香基因rhnudx1。所得结论与实施例2相同：嫁接辅助的vigs方法，快速而有效地沉默了花香相关基因的表达。