小麦UDP-葡萄糖基转移酶TaUGT6及其应用的制作方法

本发明涉及小麦udp-葡萄糖基转移酶基因的应用，特别是该基因在don毒素降解及提高植物don耐受性中的应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术：

小麦赤霉病(fusariumheadblight，fhb)是由禾谷镰刀菌为主要致病菌引起的一种世界范围广泛流传的重大真菌病害，也是危害我国小麦产业发展的主要病害之一。近年来，由于气候变暖和耕作制度的改变，我国小麦赤霉病发病范围呈不断扩大趋势，目前常发区已扩展到黄淮南部麦区，黄淮北部、西南、西北麦区病害发生也明显加重。赤霉病会导致小麦产量下降，一般发生年份引起10％-15％的减产，大流行时甚至绝收。赤霉病不仅造成小麦产量严重降低，其分泌的脱氧雪腐镰刀烯醇(deoxynivalenol，don)等真菌毒素会影响小麦的品质及食品安全。don对人类以及各种动物有着广泛的毒性效应，可引起多种细胞的凋亡，从而对机体多个系统产生毒害作用，如神经毒性、生殖毒性、免疫毒性、致畸和胚胎毒性，以及可能是癌症的诱导剂等。因此，积极有效地防控小麦赤霉病及降低don毒素在籽粒中的积累对粮食安全和食品安全都具有十分重要意义。

don毒素不仅对人和动物的健康危害大，而且会抑制小麦种子的萌发、胚芽鞘的生长以及根部有丝分裂和分化。研究表明，don毒素是禾谷镰刀菌的致病因子，可以促进赤霉病菌在小麦组织中的扩展，加剧和加重赤霉病的发生，而降低don毒性丧失或减弱，可有效的阻止病原菌在植物组织内的扩张，提高对赤霉病的抗性。因此，降低don积累不仅对食品安全十分重要，而且也是一条提高小麦赤霉病抗性的途径。

植物udp-葡萄糖基转移酶(udp-glycosyltransferases，ugts)是一类脱毒相关蛋白，可以通过糖基化don等毒素以降低毒性，从而提高植物对赤霉病的抗性。植物udp-葡萄糖基转移酶属于糖基转移酶大家族中的家族1，在c端有一个pspg盒(plantsecondaryproductglycosyltransferasebox)，是44个氨基酸组成的保守序列，一般以尿苷二磷酸葡萄糖作为糖基供体参与糖基化反应。植物中ugt成员众多，在拟南芥、玉米和水稻等植物中都发现有超过100个成员，但这些udp-葡萄糖基转移酶中的绝大部分功能未知。

小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6是小麦糖基转移酶家族1中的一个成员，该基因序列已随小麦基因组序列公开，但该基因的用途，特别是在don毒素降解及提高植物don耐受性中的应用未见报道。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6在don毒素降解及提高植物don耐受性中的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先一种小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6，其编码基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

其次，本发明提供了一种上述小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6基因编码的蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

第三，本发明提供了上述小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6在don毒素降解中的应用，所述的应用包括：1)将本发明所提供的taugt6序列导入商业化表达质粒pgex-4t-1，利用大肠杆菌外源表达和纯化该蛋白，以含有don的物质为底物，可将don毒素转化为脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(d3g)等。2)将本发明所提供的taugt6蛋白溶液喷洒在受don毒素污染的小麦中(喷洒量约20μg/g)，以降低don毒素含量；所述小麦包括小麦籽粒或全麦粉。

本发明还提供了上述小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6在提高植物don耐受性中的应用，包括：将小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6的编码基因(其核苷酸序列如seqidno.1所示)导入植物过表达载体phb，进行植物转基因操作(zhangx,henriquesr,linss,etal.agrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.[j].natureprotocols,2006,1(2):641.；evamedvecká,harwoodwa.wheat(triticumaestivuml.)transformationusingmatureembryos[j].methodsinmolecularbiology,2015,1223:199.)，获得转基因植物，以提高植物对don的耐受性和提高赤霉病抗性；上述植物包括但不限于拟南芥、小麦、玉米，以获得含有所述基因的转基因材料，以用于生产。

本发明首次证明udp-葡萄糖基转移酶taugt6能够通过糖基化don而降低don毒性并提高植物对don毒素的耐受性。并首次通过喷洒taugt6蛋白，以降低污染籽粒或全麦粉中don含量，为高污染籽粒的利用提供了一条简便可行的途径。另外克隆的基因来源于小麦本身，过量表达不会影响食品安全性，且可广泛的在不同植物的抗病性育种中利用。

附图说明

图1：通过rt-pcr技术扩增taugt6序列，利用琼脂糖电泳检测。

m为分子量标准dl2000；泳道1为taugt6片段。

图2：重组质粒pgex-taugt6的双酶切鉴定。

m为蛋白质分子量标记；泳道1为未酶切的pgex-taugt6质粒；泳道1为经bamhⅰ和ecori双酶切的pgex-taugt6质粒。

图3：用sds-page检测纯化的融合蛋白gst-taugt6。

m为蛋白质分子量标记；泳道1为纯化的gst-taugt6融合蛋白。

图4：用质谱(lc-ms)鉴定taugt6的催化产物。

a为酶活反应中的底物，峰值符合don的特征；b为don经taugt6催化后的产物，峰值符合d3g的特征。

图5：taugt6蛋白降低高污染籽粒或全麦粉中don含量。

a为赤霉病污染籽粒；b为籽粒喷洒taugt6蛋白4小时后的don含量测定；c为赤霉病污染全麦粉；d为全麦粉喷洒taugt6蛋白4小时后的don含量测定。

图6：转基因植株中的taugt6基因检测。

a中m为分子量标准dl2000，泳道1-7为转基因植株叶片中的pcr扩增产物，泳道8为含有taugt6基因的阳性质粒的pcr产物，泳道9为野生型拟南芥叶片对照的pcr产物；b为转基因株系1-7中的taugt6基因qrt-pcr定量检测。

图7：转基因植株对don的耐受性。

a为加水处理；b为100μmdon处理；c为根长统计。转基因株系在don处理下，明显比wt植株根系生长快。wt为野生型，2为转基因株系2。

具体实施方式

实施例中如无特殊说明，均为本领域所用常规方法和实验试剂。涉及的小麦品种苏麦3号、拟南芥均来自江苏省农业科学院粮食作物研究所小麦研究室保藏。

实施例1小麦udp-葡萄糖基转移酶基因taugt6的克隆

使用svtotalrnaisolationsystem试剂盒(promega公司，货号：z3100)提取小麦品种苏麦3号抽穗期的小穗rna，然后使用反转录试剂盒(takara公司，货号：6210a)获取cdna。

通过公开网站http://plants.ensembl.org/获得taugt6基因的cdna序列。设计合成用于扩增taugt6基因的引物，正向引物为5’-cgggatccatggctgtccacgacgagcc-3’(其核苷酸序列如seqidno.3所示)，反向引物为5’-cggaattcgctggcctggatgtcttggc-3’(其核苷酸序列如seqidno.4所示)。使用该引物对和高保真mix(诺唯赞公司，货号：p511)，以cdna为模板进行pcr扩增。

pcr反应体系为2×mastermix25μl，cdna模板2μl，seqidno.3和seqidno.4引物各1.5μl，无菌水20μl。反应程序设定为95℃1min；95℃10s，58℃15s，72℃50s，36个循环；72℃5min。

将pcr产物于1％的琼脂糖凝胶中电泳，电泳结果如图1所示。将目的片段进行胶回收(诺唯赞公司，货号：dc301)，连入peasy克隆载体(全式金公司，货号：cb111)中，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证，测序正确的质粒命名为t-taugt6。

实施例2小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6在don毒素降解中的应用

1.taugt6的原核表达载体构建

用bamhⅰ(neb，货号r3136)和ecori(neb，货号r3101)双酶切实施例1获得的t-taugt6质粒，回收得到目的基因片段；同时用bamhⅰ和ecori双酶切公开通用的原核表达载体pgex-4t-1，回收载体片段。将目的基因片段连入上述原核表达载体中，得到的taugt6的原核表达载体pgex-taugt6，用bamhⅰ和ecori双酶切pgex-taugt6载体验证，如图2所示。

2.转化大肠杆菌、诱导蛋白表达及蛋白的纯化

将pgex-taugt6质粒转入大肠杆菌bl21(de3)(全式金公司，货号：cd601)。将含阳性克隆的bl21菌液以1：100比例，加入含有amp的lb液体培养基中，在37℃摇床200rpm扩大培养2h，至菌液od600在0.6-0.8之间。加入iptg至终浓度达到1mm，在25℃摇床中过夜诱导，收集菌体备用。

取过夜诱导条件下收集的菌液，加入10ml磷酸盐缓冲液(pbs，20mmk2po4，0.15mnacl，ph7.9)悬浮菌体，加入100μl1m苯甲基磺酰氟(pmsf)混合均匀后超声破碎20分钟(200w，工作1s，间歇2s)，离心取上清。上清液用0.45μm针头式过滤器(生工公司，货号：f513143)过滤，用proteinisogstresin蛋白纯化系统(全式金公司，货号：dp201)，按照操作手册进行蛋白纯化，经过装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱后，用1.5ml离心管收集洗脱液，取30μl样品进行sds-page检测重组蛋白的浓度以及纯度，如图3所示，收集获得的重组蛋白，备用。

3.don的酶催化反应

每200μl酶促反应混合物中，包含了2μg的重组蛋白、50mmtris-hclph＝7.0、5mm的udp-葡萄糖、14mm的2-巯基乙醇以及1mm的don，这些混合物在30℃下孵育3h，使用20μl240mg/ml的三氯乙酸终止反应，并速冻于液氮中，在-20℃冰箱中保存。

4.lc-ms\ms检测don和d3g的产生

色谱条件：agilentextend-c18色谱柱(150mm×3.0mm，3.5μm)；柱温40℃，样品温度5℃。进样体积5μl。流动相a为甲醇，流动相b为5mm醋酸铵。流速0.3ml/min。流动相洗脱梯度0min20％a，1min20％a，5.5min90％a，6.5min90％a，7.0min20％a。

质谱条件：选择反应监测模式(mrm)检测。曲线脱溶剂管(cdl)温度250℃，雾化气体和干燥气体均为氮气，流速分别为3.0l/min、15l/min。碰撞气为高纯氩气，碰撞诱导解离压力为230kpa。

将上述所述的酶促反应液，按照上述条件进行质谱检测，经比对分析峰图，发现don和d3g，如图4所示。由此得出结论，taugt6可以将don毒素糖基化为脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(d3g)，降低don毒性。

实施例3小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6在降解don污染籽粒或全麦粉中毒素含量应用

小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6酶液(2ml)配制：实施例2步骤2获得的重组蛋白20μg、终含量为5mm的udp-葡萄糖、终含量为14mm的2-巯基乙醇、tris-hcl(ph＝7.0)补足至2ml。

上述酶液中，2-巯基乙醇可以保护酶的活性；tris-hcl可维持相对稳定的酶促反应环境。

将小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6酶液(蛋白浓度10μg/ml)喷洒在赤霉病污染的小麦籽粒(图5a)或全麦粉(图5c)上，30℃下放置4h，利用呕吐毒素elisa检测试剂盒(北京华安麦科公司，货号：hem0896/hem0848)，按照产品说明书快速检测don含量，如图5所示，经过4h反应，籽粒中毒素含量降低620μg/kg(图5b)，全麦粉中毒素含量降低660μg/kg(图5d)，同时以水作为对照组。

本实施例中是喷洒4ml的酶液在20g赤霉病污染的小麦籽粒或全麦粉的样品中，ugt蛋白的喷洒量约为20μg/g样品。

实施例4小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6在植物don耐受性中的应用

1.taugt6的植物过表达载体构建

用正向引物(其核苷酸序列如seqidno.3所示)和反向引物5’-gactagtgctggcctggatgtcttggc-3’(其核苷酸序列如seqidno.5所示)扩增目的片段，用bamhⅰ和spei(neb，货号：r3133s)双酶切，回收得到目的基因片段；同时用bamhⅰ和spei双酶切植物表达载体phb，回收载体片段。将目的基因片段连入上述表达载体中，得到以玉米ubiquitin启动子驱动的taugt6的植物过表达载体taugt6-oe。

2.农杆菌介导的遗传转化

将植物过表达载体taugt6-oe转入农杆菌gv3101(上海唯地生物公司，货号：ae1001)，进行pcr验证。采用通用的拟南芥转化方法“浸花法”(zhangx,henriquesr,linss,etal.agrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.[j].natureprotocols,2006,1(2):641.)，使含有植物表达载体的农杆菌gv3101浸染拟南芥花蕾。待其长出的角果成熟之后，收集t1代种子并在筛选培养基上进行筛选，分别收获其t2代种子再进行下一轮筛选，将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子为t3代，即为纯合转基因株系。

3.过表达转基因植株分子鉴定

对上述转基因植株，取叶片提取dna做pcr检测，获得7个独立的转基因株系，分别命名为1-7，如图6a所示。分别提取转基因植株和野生型植株的rna，反转录后以核苷酸序列如seqidno.6所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.7所示的反向引物为引物进行qrt-pcr扩增，分析过表达植株和野生型植株的基因表达差异。

taugt6在过表达植株中的表达量都明显高于野生型植株，如图6b所示。利用表达量高的株系2来进行后续的实验。

4.taugt6在don耐受性中的作用验证

将wt和转基因转系2播种在1/2ms培养基上，5天之后，取大小、长相相似的植株，转移到新的1/2ms培养基上，该培养基表面涂布一层100μmdon，生长7天后，如图7所示，taugt6过表达的拟南芥植株根长明显长于野生型根系，说明taugt6增强了植物对don毒素的耐受性。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>小麦udp-葡萄糖基转移酶taugt6及其应用

<141>2019-03-28

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1473

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggctgtccacgacgagccgctgcacatcctcttcttcccgttcctggcctccggccac60

ctcattccgatcgccgacatggccgcgctcttcgccggccgcggcgtcaggtgcaccatc120

ctcaccacgcccgtcaacgccgccatcatccgctccgccgtcaagcgcgccaacgacgcc180

ttcgccggcaccggctgtcccgccatcgacatcgctgtcgtgcctttccccgacgtcggg240

ctcccgccgggggtggagaacggcacggccctctcgtcccaggacgaccgcgacaagttc300

ttccacgcggcgactctgctccgggagccattcgaccggttcctggccgaccaccgcacc360

gacgctgtcgtgtccgacagcttcttccactggtctgtcgacgccgccgcggagcggggc420

gtcccgcgcatcgcgttcctcggcagcagcatgttcgcgcgctcctgcagcgacagcatg480

ctgcgccacaacccgctggagaacgcccccgacgaccccgacgccttcgtcgccctgccg540

gggctgccgcaccgcatcgagctgaggcgaagccagatgatggacccggctaagaagcca600

tggcagtggcagttcttcaagggcgtgaacgccgccgaccagaggagcttcggcgaggtg660

ttcaacagcttccacgagctggagccggattacgtcgagcacttcaacaagacgctctcc720

cggcgtgtgtggctcgtcgggccagtagcgctcgccagcaaggacatggctgtgagaggc780

accgacgcgccctcgccggacgcggacagctgcatccggtggctggacgcgaagccagcc840

ggctcggtggtgtacgtctccttcggcacactaaccaagttcgcaccggcggagctgcac900

cagctcgcccgcgccctcgacctctcaggcgtgaacttcgtgtgggtcatcggcaccgcc960

gcaggccaagactctgctgaatggatgcccgaaggcttcgcggacctcatagcgcacggc1020

gaccgcggcttcctaatccgaggctgggcgccgcagatgctgatcctgagccacgccgcc1080

ctgggcgggttcgtgacgcactgcggctggaactcggtgctggaggccgtgagcgccggc1140

gtgccgatggtgacgtggccgcggtacgcggaccagttcaacaacgagaagctcgtggtg1200

gagctgctcaaggtgggcgtcagcatcggggccaaggactacgcgtcgggcatcgaggcc1260

cacgaggtgatcgccggcgaggtgatcgccgagtccatccagaggctgatggagagcgac1320

gccatccagaagaaggccaaggacctcggtgagaaggcaaggcgcgcggtggagaagggc1380

ggatcttcgtacgatgatgttggccggctcatggacgtgctgacggcccgtcggagctcc1440

gtcgaggttggccaagacatccaggccagctga1473

<210>2

<211>491

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metalavalhisaspgluproleuhisileleuphephepropheleu

151015

alaserglyhisleuileproilealaaspmetalaalaleupheala

202530

glyargglyvalargcysthrileleuthrthrprovalasnalaala

354045

ileileargseralavallysargalaasnaspalaphealaglythr

505560

glycysproalaileaspilealavalvalpropheproaspvalgly

65707580

leuproproglyvalgluasnglythralaleuserserglnaspasp

859095

argasplysphephehisalaalathrleuleuargglupropheasp

100105110

argpheleualaasphisargthraspalavalvalseraspserphe

115120125

phehistrpservalaspalaalaalagluargglyvalproargile

130135140

alapheleuglysersermetphealaargsercysseraspsermet

145150155160

leuarghisasnproleugluasnalaproaspaspproaspalaphe

165170175

valalaleuproglyleuprohisargilegluleuargargsergln

180185190

metmetaspproalalyslysprotrpglntrpglnphephelysgly

195200205

valasnalaalaaspglnargserpheglygluvalpheasnserphe

210215220

hisgluleugluproasptyrvalgluhispheasnlysthrleuser

225230235240

argargvaltrpleuvalglyprovalalaleualaserlysaspmet

245250255

alavalargglythraspalaproserproaspalaaspsercysile

260265270

argtrpleuaspalalysproalaglyservalvaltyrvalserphe

275280285

glythrleuthrlysphealaproalagluleuhisglnleualaarg

290295300

alaleuaspleuserglyvalasnphevaltrpvalileglythrala

305310315320

alaglyglnaspseralaglutrpmetprogluglyphealaaspleu

325330335

ilealahisglyaspargglypheleuileargglytrpalaprogln

340345350

metleuileleuserhisalaalaleuglyglyphevalthrhiscys

355360365

glytrpasnservalleuglualavalseralaglyvalprometval

370375380

thrtrpproargtyralaaspglnpheasnasnglulysleuvalval

385390395400

gluleuleulysvalglyvalserileglyalalysasptyralaser

405410415

glyileglualahisgluvalilealaglygluvalilealagluser

420425430

ileglnargleumetgluseraspalaileglnlyslysalalysasp

435440445

leuglyglulysalaargargalavalglulysglyglysersertyr

450455460

aspaspvalglyargleumetaspvalleuthralaargargserser

465470475480

valgluvalglyglnaspileglnalaserglx

485490

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgggatccatggctgtccacgacgagcc28

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cggaattcgctggcctggatgtcttggc28

<210>5

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gactagtgctggcctggatgtcttggc27

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cgacagcttcttccactggt20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ggttagtgtgccgaaggaga20